における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル C.虫
2014年3月11日
プロトコルは、Cで酸素欠乏症/飢餓を使用していますことが記載されている虚血/再灌流をモデル化するエレガンス 。機能的転帰は、死亡率の増加、GFP標識神経突起で見える異常、および神経機能を必要とする障害のある行動反応が含まれています。
この手順の全体的な目標は、海の優雅さで虚血再灌流を模倣することです。これは、海のエレガンスを微小管に移し、バクテリアを洗い流すことによって達成されます。2番目のステップは、無酸素環境を作成することです。
実験室で作られた低酸素チャンバーを使用して、動物を20時間無酸素状態にし、24時間後に好気性条件に置きます。最後のステップは、死んだ動物とタッチレスポンスのスコアリングです。ニューロンの修飾は、蛍光顕微鏡法によっても観察されます。
最終的には、海の優雅さの無酸素飢餓は、虚血、より簡単で柔軟な遺伝子モデルで優れた真核生物の損傷に見られるのと同じ条件を作成するために使用されます、そして、これらの技術の管理の利点は、細胞内の虚血性反復融合の絶滅方法よりも心臓を分離することですCエレガンスは非常に強力な遺伝子モデルであり、また、輸送です。生物は、いくつかの異なる流体と技術を使用することを可能にします。それに加えて、高価な低酸素または環境チャンバーを使用する代わりに、ラボの低酸素および環境チャンバーを使用する方法を示しています。
一般的に、この問題に関する個々のニュースは、例えば、バッファーをパージし、ワームのスコアリングに非常に注意し、使用している温度の量と酸素の量を一定にするなど、いくつかの重要なポイントを認識する必要があります。これらの点はすべて実験の結果を変えることができます カスタムの低酸素チャンバーを準備するには、タッパーウェアスタイルの密閉可能な密閉容器を無酸素チャンバーとして後付けすることができます。小さな容器は低酸素環境をより早く作り出し、ウォーターバスに収まりやすいため、可能な限り小さな容器を選択します。
蓋には、プラスチックまたは金属製のコネクタを収納できるサイズの穴を2つ開け、チューブを接着剤で固定して固定し、水中に置くことができ、乾燥後に硬くなるため、コネクタの動きを避けて漏れの可能性を減らします。あるいは、ネオプレンワッシャーを使用して、コネクタをコンテナにシールすることもできます。容器をウォーターバスに入れ、完全に水没させます。
容器を浸します。ボトルウェイトまたはダイビングウェイトを使用してください。チューブ接続の1つはガス混合物を導入するために使用され、もう1つのチューブは圧力リリーフとして機能します。
したがって、コンテナが外部環境から密閉されるように、水中に置いておく必要があります。テキストプロトコルに記載されているように、C Eleganceの成長を開始するには、M nineバッファーを準備し、実験の30分前に窒素で平衡化し、氷に囲まれたままにして酸素をパージします。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管の蓋に小さな穴を開け、無酸素飢餓時にワームを配置します。
この穴は、蓋を開けたままにすることなくガス交換を可能にするため、媒体が過剰に蒸発する可能性があります。若年成虫を含む各35mmプレートに、室温で酸素化されたM nineバッファー1ミリリットルを加えます。プレートから雑菌が落ちないように注意してください。
約1分後、ワームはMナインを泳いでいるはずです。次に、1ミリリットルのピペットチップにウシ血清アルブミンまたはBSAをピペッティングして滅菌した1%BSA溶液を排出します。M nineバッファーにワームが含まれているプレートを慎重に傾け、M nineを添加したのと同じ場所から取り外します。
次に、準備したマイクロ遠心チューブに懸濁液を入れます。ワームがチューブの底に落ちるまで、サンプルを氷の中に置きます。チューブからワームを乱さずに、可能な限り最大量のMナインを取り除きます。
次に、パージして氷結させたM nineの酸素を1ミリリットル加え、ワームが底に落ち着くまでチューブを氷の上に置きます。又。最後の洗浄でこの洗浄手順を3回繰り返します。チューブに約100マイクロリットルが残るまでMナインを取り外します。
次に、脱酸素M 9バッファーにワームが入ったチューブをチャンバーに配置し、毎分100ミリリットルの一定の窒素フラックスで蓋ガスを使用してチャンバーをシールします。容器を摂氏26度のウォーターバスに入れます。出口チューブが水に十分に浸されていることを確認して、空気が戻らないようにし、システムに漏れがないことを確認します。
インキュベーション後、26°Cで20時間、線虫をインキュベーションし、BSAコーティングチップを35mmの線虫増殖培地プレートに装着します。プレートを摂氏20度で24時間インキュベートします。この後、ワームは得点する準備が整います。
プラチナピックを使用して、ワームLiveの頭のてっぺんに軽く触れます。ワームが反応しない場合、ワームは触れられた後方に移動し、死亡したとスコア付けされます。時折、ワームは後方に動かず、わずかに左右に頭を動かすことがありますが、技術的には死んでいませんが、これらのワームは数時間以内に期限切れになることはほぼ確実であり、死亡したと評価する必要があります。
この手順を 10 秒間隔で各ワームに対して 10 回から 15 回繰り返します。各グループで少なくとも 10 匹の線虫を調査して、無酸素症後の飢餓、ニューロンの修飾を視覚化するための正確なデータを取得します。触覚応答メカニューロンに緑色蛍光タンパク質またはGFPを発現する株を使用してください。
底面に1枚のテープがある他の2つのスライドの間に置かれたスライドガラスに2%ARO溶液を滴下します。2%ARO溶液の上に最初のスライドガラスに垂直に最終的なスライドガラスを置き、室温で冷まします。これにより、テープの厚さのパッドが形成されます。
次に、上部のスライドを取り外し、0.1%テトラアオールを含む10マイクロリットルのMナインを追加します。約10匹の生きたワームを2%aroスライドに移し、その上にカバースリップを置きます。100 x 対物レンズの下、適切な照明で蛍光顕微鏡を使用して GFP を視覚化します。
損傷したニューロンは、複数の点からなるプロセスで、細胞質膜の真珠のひもパターンを示します プロセスおよび/またはプロセスが壊れているように見える異常。合計で少なくとも 10 匹の線虫を使用して、各線虫の両方のニューロンの点状点と異常を数えます。シーエレガンスを20時間の無酸素状態と摂氏26度の飢餓にさらし、カスタムラボで作られたインキュベーションチャンバーで、かなりの死亡率をもたらしました。
生存者はまた、軽い体壁の接触に対しても反応が悪かった。その後の生存者のGFP標識ニューロン突起のpunctoおよび切断の蛍光イメージングにより、形態学的異常の存在が確認された。このビデオを見た後、虚血を促進する方法をよく理解しているはずです。
実験室での観察は低酸素室を作り、また、シアトルの優雅さで死と神経修飾を測定できるはずです。このモデルは、多くの介入と代謝からの天然イオンが生死の低酸素状態にどのように影響するかを研究するために、複数のグループによって使用されています。
概要
このプロトコルは、虚血/再灌流をモデル化するために線虫の無酸素/飢餓の使用を説明しています。研究では、増加した死亡率、目に見える神経異常、行動反応の障害などの機能的結果を評価します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- モデル生物
- 虚血研究
背景
- C. elegansは虚血を研究するための強力な遺伝子モデルとして機能します。
- 無酸素/飢餓は虚血/再灌流障害を模倣します。
- 蛍光顕微鏡は神経修飾を観察するために使用されます。
- 低酸素環境を作るための費用効果の高い方法が議論されます。
研究の目的
- より単純な生物で虚血/再灌流をモデル化すること。
- 無酸素後の神経機能と行動反応を評価すること。
- 無酸素を誘発するための低コストな方法を示すこと。
使用された方法
- 密閉可能な容器を使用してカスタム低酸素チャンバーを作成すること。
- C. elegansを20時間の無酸素条件にさらす。
- ワームの死亡率と触覚反応のスコア付け。
- GFPと蛍光顕微鏡を使用して神経変化を視覚化すること。
主要な結果
- 無酸素条件下で増加した死亡率が観察されました。
- GFPでラベルされた神経プロセスの目に見える異常。
- 神経機能障害を示す行動反応の障害。
- ワームの生存能力を評価するための効果的なスコアリング方法のデモンストレーション。
結論
- C. elegansの無酸素/飢餓は虚血研究の有効なモデルです。
- 費用効果の高い技術は高価な低酸素チャンバーに代替できます。
- 発見は虚血条件に対する神経反応の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This model enables mechanistic de-risking of ischemia-reperfusion pathways using a genetically tractable organism, supporting early target validation in neuroprotective drug discovery. By linking anoxia exposure to quantifiable neuronal damage and behavioral deficits, it provides predictive confidence for screening compounds that mitigate ischemic injury. The low-cost, scalable hypoxic chamber design facilitates assay development and translational biomarker screening in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to ischemic neuronal death and pathway clarification in a whole-organism context.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation through quantifiable touch response and mortality readouts.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by correlating genetic or pharmacological interventions with reduced neurodegeneration and improved survival.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated disease-relevant systems for downstream compound screening via standardized anoxia/reperfusion cycling.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of touch sensitivity and neuronal morphology as dependent variables for dose-response analysis.
- Scalability: The custom hypoxic chamber design supports platform reuse and cross-team standardization in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through conserved stress-response pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking target modulation to reduced axonal damage and improved behavioral recovery.
- Biomarker Alignment: GFP-labeled neuronal process abnormalities serve as translatable biomarkers of ischemic injury and repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early-stage target engagement studies that inform lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective targets by modeling ischemia-reperfusion injury in a genetically manipulable system.
- Screening: Delivers assay-ready conditions with reproducible anoxia exposure and standardized scoring of viability and touch response.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including mortality rates, touch response frequency, and puncta counts in GFP-labeled neurons for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links neuronal morphological changes to functional outcomes, supporting biomarker-guided progression to preclinical models.
- Enterprise Reuse: The low-cost hypoxic chamber design enables reuse across multiple projects studying hypoxia-responsive pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ischemic injury models.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through a low-cost, customizable hypoxic chamber platform.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early de-risking of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by linking target modulation to measurable reductions in neuronal damage and mortality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, fluorescence microscopy, and hypoxic system setup.
- Depends on instrumentation for gas mixing, temperature control (water bath), and neuronal imaging.
- Necessitates cross-team standardization of worm preparation, anoxia duration, and scoring protocols.
- Adaptation considerations include model strain selection (e.g., GFP-expressing touch neurons) and buffer purging consistency.
- Practical limitations include variability in worm handling sensitivity and the need for strict oxygen control to maintain model fidelity.
