ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

本実験の全体的な目的は、タバコ葉の表皮細胞においてGFPタグ付きレポーターの一過性遺伝子発現を観察することです。まず、葉緑体およびペルオキシソームで発現するDNAコンストラクトを設計します。次に、PCR増幅とGibsonアセンブリを用いて、このコンストラクトを構築します。

次に、ジーンガンを用いて構築物をタバコ葉の表皮細胞に導入します。最終的に、共焦点顕微鏡でタバコ葉を観察すると、葉緑体およびペルキシソームにおけるGFPの発現が確認されます。古典的なクローニングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、制限酵素を必要としないため、PCRで増幅可能なあらゆる配列をクローニングできることです。

遺伝子設計の柔軟性により、これらの手法の応用範囲はより大規模なスケールへと広がっています。農作物の遺伝子工学においては、まず植物細胞内の最終的なタンパク質発現部位を決定することから本プロトコルを開始します。本研究では、葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質への発現を標的とします。

次に、発現コンストラクトを設計します。コンストラクトには、プロモーター、検出可能な遺伝子、およびターミネーターを単一のプラスミド内に含める必要があります。本例では、構成的プロモーターであるP end cup twoがGFPの発現を誘導し、その後にNolene Syntheターミネーター（またはnos t）が続きます。

本実験では、葉緑体およびペルキシソームでの発現を目的として、GFPのC末端に融合させて発現させる一連のtritタグ（1つ、2つ、および3つのタグ）をテストすることに注意してください。ギブソンアセンブリ法は、調製済みのミックスに含まれる複数の酵素の作用により、二本鎖DNAの末端を部分的に消化し、隣接するDNA配列の相補的な塩基対のアニーリングを促進することによって機能します。最終的なコンストラクトは3つのパーツで構成されており、ギブソンアセンブリの前に4回のPCR反応で増幅させる必要があります。

第1および第2の反応では、GFP NOS Tおよびcany耐性マーカーを含む8,000 bpのプラスミドベクターPOREを増幅します。この耐性マーカーは、この大きなDNAを、PCR増幅がより容易な2つの小さなテンプレートに分割するのに適した箇所です。第3の反応ではプロモーターP end cup twoを増幅し、第4の反応ではtriag oneを増幅します。これらはape designなどのin silico設計ソフトウェアを用いて、各断片間に50 bpのオーバーラップができるよう塩基単位で構築されています。

PCR用のプライマーを注文する際は、50 bpのオーバーラップ部分を、各方向25 bpずつのプライマーとして使用することが可能です。各コンポーネントを増幅させるためのPCRを行った後、PCR産物を個別に精製し、脱イオン蒸留水で希釈します。PCRテンプレートにE. coliからのミニプレップを用いた場合は、制限酵素DpnIで処理することで、混入したテンプレートDNAを除去します。次に、各DNA断片の濃度を測定します。

コントロールを含む、アセンブリを行う各コンストラクトのベクター濃度を約150 nanograms per microliterに調整し、Gibson Assembly mixの15 microliter分注液をフリーザーから取り出して氷上で融解させます。オンラインのオープンソースツール@gibbon. orgを使用して、各フラグメントを等モル量にするための液量を決定します。

計算した各フラグメントの量を、15 µLのGibsonミックスに加えます。また、ベクターDNAのみのコントロールも調製します。各反応の総量は20 µLとなるようにしてください。

必要に応じて、水を用いて液量を調整します。チューブを50〜55 °Cで30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを再び氷上に置きます。

-80 °Cのフリーザーから、市販の塩化カルシウム処理済みコンピテントE. coli 200 µLが入ったマイクロ遠心チューブを取り出し、手の中で軽く温めます。次に、反応液20 µLすべてをE. coliに加えます。培養物を氷上で30分間インキュベートし、その後42 °Cのウォーターバスに移して60秒間ヒートショックを行います。

エレクトロコンピテントセルは使用しないでください。塩濃度が比較的高く、DNA濃度が低いため、形質転換後にセルにアーク放電が発生する可能性があります。形質転換後、培養物を2分間氷上に置き、その後750 µLのSOCまたはLB培地を加えて37 °Cで30分間回復させてください。

次のプレートとして、canyまたはその他の適切な抗生物質を含むLBプレートに混合液を播種し、37°Cで一晩培養した後、10個のコロニーをシーケンシングによりスクリーニングします。この方法は、従来のライゲーションベースのクローニングよりもバックグラウンドが高くなり、非標的組換えイベントの数が増える可能性があることに注意してください。ジーンガンを用いたタバコへのバイオティクス・トランスフェクションについては、以前にJoVEで解説されています。

ここでは、従来のプロトコルからの主要なステップと相違点について概説します。コンストラクトを増幅および単離した後、woodsおよびzetoによるJoVEの記事に記載されている方法でジーンガン用弾丸を調製し、ニコチアナ・ベンハミアナ（Nicotiana benhamiana）のタバコ葉表皮組織へ形質導入するためにジーンガンに装填します。樹齢3〜5ヶ月の個体の、基部に近い大きな葉を選択してください。

適切な保護メガネと耳栓を着用し、15 centimeterのペトリ皿に入れた濡れたペーパータオルの上に、葉の裏側を上にして慎重に置きます。ジーンガンのヘリウム圧を200から250 PSIに設定します。ジーンガンを葉の裏側の主脈の間に、葉から約3から5 centimeter上の位置に慎重に向けます。安全装置を解除し、粒子を葉に導入します。

葉の同じ位置に、各弾丸を2回ずつ使用してください。葉が破裂した場合は、別の位置に移動してプロセスを繰り返すか、その葉を廃棄して新しい葉で開始してください。年齢や水分などの成長条件により、葉の強靭さにはある程度のばらつきがあります。

すべてのショットが完了した後、葉を覆い、ベンチ上の低光量下で2〜3日間保存します。UV蛍光装置を備えた解剖顕微鏡で葉を観察し、GFPを発現している個々の細胞を探します。GFP発現細胞が見つかったら、解剖用ハサミを使用して、葉の5〜10 mmのセクションを慎重に切り出します。

個々の葉の断片を、約200 µLの0.1% Triton X 100を含むディープウェル顕微鏡スライドのウェルにすぐに浸します。界面活性剤は表面への気泡の形成を防ぐ役割を果たし、ディープウェル顕微鏡スライドを使用することで、適切なフィルターと40x水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて、より広い組織領域の細胞イメージングが可能になります。本研究では、3種類の異なるGFPオルガネラ標的構築物を、タグなしGFPおよびrubis.Coagと比較しました。

タグなしGFPを発現させた対照実験において、一過性変換された単一細胞のGFP蛍光を検出するために、GFP共焦点顕微鏡を用いた。蛍光は核と細胞質でのみ観察され、葉緑体では観察されない。葉緑体は、葉緑体標的型RubisCOのみを導入した細胞のこの例に見られるように、クロロフィルの赤色自家蛍光によって識別される。GFP構築物GFPは、巨大なオルガネラで発現していた。

細胞は白線で囲まれています。黄色は構築物とクロロフィルの共局在領域を示しており、このtriag one導入細胞の画像に示されるように、構築物が葉緑体に標的化されていることを示しています。GFPの発現は、葉緑体、周辺部、細胞質、およびペルオキシソームと考えられる小さな点状のオルガネラに認められます。同様に、triag two導入細胞においても、葉緑体、細胞質、およびペルオキシソームでGFPが発現しています。葉緑体配列の低複雑性領域内にペルオキシソームシグナルが組み込まれたtriag threeは、葉緑体とペルオキシソームにのみ局在しました。

この細胞は異なる葉層にあることに注意してください。この図は、典型的なタバコ葉表皮細胞のコンパートメントで観察された発現をまとめたものです。細胞内での相対的なサイズと位置、およびジーンガン法によるトランスフェクションと共焦点顕微鏡観察によって認められた相対的な発現レベルが示されています。

タグのないGFPは細胞質と核に局在し、PIMT two GFPコントロールは葉緑体に局在し、triag one GFP、triag two GFP、およびTriag 3G FPは予測通り葉緑体とペルオキシソームに局在することに注意してください。このビデオを視聴することで、Gibson assemblyを用いてプラスミドを構築し、それをタバコ葉に弾丸法で導入し、3日以内にGFPの発現を観察する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、Gibson assemblyに150 ng/µLのベクターDNAを、またジーンガン弾の作製に最終的なDNA構築物を1500 ng/µL使用することを忘れないでください。この手順に続き、一過性ではなく安定した遺伝子発現を得るために、アグロバクテリウム法などの他の手法を行うことができます。