Name: ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いたタバコ葉表皮細胞への一過性遺伝子発現法。葉緑体とペルオキシソーム標的のGFP発現を共焦点顕微鏡で観察し、制限酵素不要の柔軟なクローニング技術を実演します。

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著者は、 ベンサミアナタバコ苗の寛大な寄付のためにマサチューセッツ総合病院のジェンシーンに感謝したいと思います。ジェン·ブッシュは、植物の成長、成長チャンバ領域を設定する際の助言が大きく私たちを助けた。ウィス大学のトム·フェランテは、共焦点顕微鏡で重要なヘルプを提供した。著者は、特に遺伝子銃および関連物資の寛大な寄付のためにボストン小児病院とWyssさん研究所のドンIngberに感謝したいと思います。このプロジェクトの資金は、MJVため、PAS、JCW、およびMDM、およびChimerionバイオテクノロジーによって、株式会社のためのエネルギー省高等研究計画局（ARPA-E賞＃DE-000079）との協力協定を通じて提供されていました。

ターゲットと複数のオルガネラのための選択的にスプライス配列の1。デザイン<ol><li>最終的なタンパク質発現のための部位を決定。この作業のために、関心は葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質ゾルをターゲットにしている。 </li><li>関心対象の細胞小器官へのタンパク質を標的化することが知られているタンパク質およびDNA配列を同定するために文献を使用する。この場合、葉緑体は、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、L-アスパラギン酸メチル6,15から配列を標的とシロイヌナズナのトランスサイレチンのようなS-アラントイン合成酵素16,17から配列を標的ペルオキシソームを決定した。 </li><li>正しい細胞小器官への関心のタンパク質をターゲットとすべき代替スプライシング体制を特定します。この作業のため、自然のシロイヌナズナシステム 6で観察されるようなスプライス部位。 mRNA配列は、天然のスプライス部位を残して再設計されましたが、シーケンスは、符号化葉緑体やperoxisを置いた選択的にスプライスイントロン（ 図1）内のタグをOMEターゲティング。 </li></ol> DNAのパーツの2。ギブソン総会 図2も参照してください。 ギブソンの組立方法は、部分的に隣接するDNA部分の一本鎖および2）アニール相補塩基対を作るために二本鎖DNAの末端のダイジェスト）を1に予め作られた混合物中のいくつかの酵素の作用に依存する。これは、制限部位の制限なしにDNA断片のクローニングを可能にする。 <ol><li> DNAプラスミド構築物における要素の順序を選択します。 a）は、プラスミド、植物、カナマイシン耐性マーカーで作業することが知られているGFP構築物を含むベクター（孔、および大腸菌およびアグロバクテリウム·ホスト·ツメファシエンス ）、b）工程aのための複製起点：一例としてTriTag-1の要素を有しているプロモーター配列、（P ENTCUP2、植物において構成的であることが示されている）、c）の葉緑体配列（CTS）と、c）ペルオキシソーム標的化配列（PTS）を標的、およびd）スプライス部位の一連の6先に説明したように。 </li><li> インシリコデザイン· ソフトウェアで構築ベース用ベースを設計します。 APEはこの仕事に便利なオープンソースのフリーウェアパッケージです。 プラスミドベクターに含まれるプラスミドベクター、プロモーター、ATG、スプライスドナー部位、葉緑体標的配列、スプライスドナー部位、中性部位、スプライスアクセプター部位、ペルオキシソーム標的配列、スプライスアクセプター部位、GFP：注：TriTag-1は、順序を有する。 <ol><li> PCR用のプライマーをご注文の際に各ピース間50bpの重複が存在するようなインシリコ DNA構築物を設計します。 25bpの各方向：これは、プライマーとして50 bpのオーバーラップを使用することが可能である。 <ol><li>シーケンス片の起源を追跡するようにしてください。それはのようになります。成長させ、ミニプレップするプラスミド; PCRの鋳型として用いることができる直鎖状配列;である必要があるか、シーケンス商業的に合成された？いくつかの企業が断片&lt;500bpのための低コストのDNA合成サービスを提供しています。それは商業的にご注文することが有利だったので、この場合は、TriTag自体は437 bpである。 </li><li>すべてのフラグメントをPCRで増幅し、その鋳型DNAから精製された場合、最良の結果が来る。耐性マーカーをより容易にPCRで増幅された二つの小さなテンプレートに、この大きなDNAを分割するには良い場所です。 </li><li>制限制限酵素DpnIを、メチル化DNAを切断する。 PCRの鋳型は、 大腸菌からのミニプレップした場合大腸菌、DpnIを処理は、混入のテンプレートDNAを除去します。 </li></ol></li></ol></li><li>別途、すべてのDNA配列を浄化した水、TEまたは緩衝液EBで溶出する。 <ol><li>気孔ベクター部分1、〜3,000 BP（緑の矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。 </li><li>気孔ベクター部分2、〜3,000 BP（黒矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。 </li><li> TriTag INSERT、437 BP（青の矢印）。商業的になっております。 RのddH 2 Oにesuspend </li><li> P ENTCUPプロモーター 、〜750塩基対（オレンジの矢印）。 PCRで増幅し、DpnIを処理された。 </li></ol></li><li> DNA断片のそれぞれの濃度を測定する。ベクトル片の150 ngの/μLを目指す。 </li><li>冷凍庫からギブソンアセンブリミックスの分量を取り、氷上で解凍する。これは、ラボ12月14日に行うことが商業的に入手可能なだけでなく、簡単です。 <ol><li>粘性5Xマスターミックスと15μlの反応サイズの1.33倍の分量：このレシピへの2つのステップがあります。 5Xマスターミックスには含まれています。3ミリリットルの1Mトリス-HCl、pH7.5、300μlの1 M MgCl 2を 、各dNTP、300μlの1 M DTT、1.5グラムのPEG-8000、20 mgのNAD、および蒸留H 2の600μlの10 mMの6ミリリットルのO。 320μlの一部（18）を調製し、-20℃で1が、すべてを凍結する解決策は非常に粘性になります。これらの「5X等温線バッファを &quot;ラベル</li><li> （320μl）を、残りの1に、1.2μLT5エキソヌクレアーゼ、20μLのPhusionハイ-FIDを追加elity DNAポリメラーゼ、160μLのTaq DNAリガーゼと700μlの蒸留H 2 O -20℃でPCR管中の氷とストアに15μLずつ（〜80）を準備</li></ol></li><li>各フラグメントの等モル量のボリュームを決定します。 Gibthon.orgを含むいくつかのオンライン計算機があります。すべてのDNA断片5μlの合計があるはずです。ギブソンは分量を混ぜて15μLに追加します。これは、ピペットに小さすぎるボリュームを必要とする場合、DNA断片を希釈および/または複数のアリコートを使用する。 <ol><li>単独のベクターDNA（抗生物質耐性マーカーを含む例えば DNA部分）の制御を準備し、水でボリュームを構成することを忘れないでください。 </li></ol></li><li> 30〜60分間50〜55℃でサーマルサイクラーにチューブをインキュベートする。氷の上で交換して、Eに変換する熱ショック、化学的にコンピテントセルを経由して大腸菌 。エレクトロコンピテント細胞を使用しないでください。高塩濃度および比較的低いDNA濃度細胞はアークが発生することがあります。 <ol><li> 200μlの塩化カルシウムコンピテントの市販製剤に全20μLを適用大腸菌 。 42℃で氷30分および熱ショック60秒でインキュベート</li><li>氷2分に戻り、750μlのSOCまたはLB培地を適用し、37℃でマイクロ遠心チューブに30分を振っ回復LB +菅（またはその他の適切な抗生物質）に混合し、適切な希釈液をプレート。これは、従来のライゲーションに基づくクローニングよりも高いバックグラウンド（および非標的組換え事象の数が多い）になることがありますが、約10個のコロニーをスクリーニングすることは価値がある。 </li></ol></li><li>配列を介してクローンを確認し、-80℃で一定分量を保存する</li></ol>遺伝子銃とタバコの3。微粒子銃トランスフェクションこれはJoveの18,19年に設立された技術である。重要なステップとの相違点を以下に説明する。 <ol><li> 50〜100を成長ミリリットルE. COLiや200ミリリットルアグロバクテ 。文化をマキシプレップ。約1,500 NG /μLの濃度は、継続するために必要とされている。 </li><li>前述したように、遺伝子銃の弾丸を準備します。遺伝子銃にロードします。 </li><li> ベンサミアナタバコタバコの葉の表皮組織のトランスフェクションのために、3ヶ月の植物の根元に近い大葉を選択します。丁寧にカットさ15cmシャーレに湿ったペーパータオルの上にボトム側を上に配置します。 </li><li> 200〜250 PSIへの遺伝子銃He圧力を設定します。 </li><li>慎重に約3〜5センチメートルその上、葉の下側のリブの間の遺伝子銃を目指しています。安全性を解放し、リーフに粒子を送達。各弾丸は、葉上の同じ場所に二度使用されてもよい。葉が爆発した場合、新しい葉があるため、12 cmの葉のためのそのような年齢、水分などの成長条件への葉の靭性のある分散があるを破棄し、起動し、約6ショットに合うように期待しています。 </li><li>の上で覆われた葉を格納ベンチで暗い場所で2〜3日間、ペトリ皿。 </li><li> UV蛍光を装備した解剖顕微鏡で葉を調べ、GFPを発現する個々のセルを検索します。葉の5〜10ミリメートルのセクションを分析。 </li><li> 〜200μlの0.1％トリトンX-100の下にディープウェル顕微鏡スライドに葉を沈める。界面活性剤は、表面上に気泡を防ぐことができ、及びディープウェル顕微鏡スライドは、より大きな組織の撮像領域を可能にする。 </li></ol>トランスフェクションされた組織の4。共焦点顕微鏡これらの命令は、すべての楽器ごとに異なりますので、適切な訓練を受けた取得することが不可欠である。 <ol><li>蛍光検出実験のために、489 nmの励起レーザーを設定し、GFP蛍光とクロロフィルの自家蛍光のために630から700ナノメートルのための500から569 nmの光電子増倍管検出器を設定します。 40倍水浸対物レンズを用いて画像セル。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本研究では、単純な戦略は、植物内の複数の細胞区画に一つのトランスジェニックタンパク質をローカライズするために記載されている。目標は、 ベンサミアナタバコの複数の細胞小器官に単一の遺伝子を発現し構造物を設計することでした。戦略は合理的にGFPベースのDNA構築物の設計、ギブソンアセンブリ、遺伝子銃で葉細胞へのプラスミドの配信、および共焦点顕微鏡を用いた結果を観察することがあります。 三つの異なる短い、N末端 ​​タグは11を対象とした同時葉緑体、ペルオキシソームおよび細胞質ゾルのために設計された。これらの「TriTags」は、葉緑体に加え、細胞質6かペルオキシソームプラス細胞質17のいずれかにコードされたタンパク質を直接、選択的スプライシングを受けたmRNAをコードする天然に存在するDNAを結合することによって設計されました。 TriTag-3は、選択的スプライシングに依存しており、中のNa葉緑体標的化配列で構成されていませんturally構造化されていない部分は、ペルオキシソー...

この作品は、植物細胞が複数の細胞小器官ではなく、単一のDNA構築物でレポータータンパク質を発現するように遺伝子操作される代謝工学/合成生物学のプロジェクトです。 複数の場所へのタンパク質を標的化するための一つのアプローチは、複数の遺伝子のコピー、異なる局在化ペプチドを含むそれぞれクローニングすることを含む。各コピーは、単一のトランスフォームを1戻し交配によって、あるいは連続的な再変換によって導入するか、しなければならない。これは、追加のクローニングを必要とし、末端ごとに1つのローカライズタグによって制限されます。 複数の場所にタンパク質を局在化する別の方法は、選択的スプライシング2-5を介してである。 RNAは、単一の遺伝子から転写されるが、転写産物の異なるコピーは、セルごとに複数の方法で、多くの場合、異なる方法で処理されます。これは、単一の遺伝子から転写されたセル内の複数のメッセンジャーRNAをもたらすことができる。これらの異なるmessengeR RNAは、同じタンパク質、またはフレームシフトの場合は、全く別のタンパク質の異なるアイソフォームをコードすることができます。選択的スプライシングは、長年にわたって文献に記載されているが、作用及び保存された供与体および受容体スプライス部位のメカニズムは、より最近6解明されている。これらのサイトは、より良い説明されているように、彼らは、エンジニアリングのための機会を開く。 複数の細胞小器官にタンパク質を発現する際に植物代謝エンジニアが課題に直面しています。複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質を、技術者は、対象とする細胞小器官にそれを指示する別々のシグナル配列と、同じ遺伝子のそれぞれを複数回複製しなければなりません。 3オルガネラにおける単一遺伝子の場合、これは単に三つの遺伝子である。しかし、6個の遺伝子の代謝経路のために、これは18の遺伝子、かなりのクローニングの努力に展開されます。シングル、選択的にスプライス遺伝子記号に複数の局在化配列を結合するificantlyこの努力が削減されます。例えば、リエンジニアリング光呼吸7,8およびイソプレノイド合成9,10は葉緑体およびペルオキシソームの両方を含む。天然のシロイヌナズナ系で観察されるように我々のケースでは、先に6に記載のスプライス部位を利用した。当社は、合理的にだけでは自然なスプライス部位を残してmRNA配列を再設計したが、選択的にスプライスイントロン（ 図1）内の葉緑体またはペルオキシソームターゲティングタグをコードするであろう配列が配置されます。発現されたタンパク質は、またはそれをエンコードされたmRNA前駆体はイントロン（ 図1Gおよび1H）として切り出したかどうかに応じて、タグを持っていない可能性があります。この作品で提示コンストラクトのデザインの詳細については、関連記事11を参照してください。 これはまだかなりのクローニングの努力、ギブソンアセンブリ、DNA構築物をクローニングするための新しい方法であるため、uは建設中のsed。ギブソン方法に関わらず、制限部位（ 図2）12〜14、任意の配列のために使用することができる。酵素の具体的なミックスは、ワンステップ、等温アセンブリを可能にします。この方法では、いくつかの二本鎖の線状DNA部分は、それらが約50塩基対の配列が重複しているように設計されている。ギブソン·アセンブリ酵素混合物は、部分的相同配列の一本鎖を露出させる、直鎖DNA部分を消化する。これらの部分的な一本鎖配列は、迅速なワンステップ、配列に依存し、ライゲーションフリーサブクローニング反応において得られた反応混合物に再アニールされる。 この作品は、ギブソンのアセンブリの新しいライゲーションのないメソッドを使用して、1）合理的な設計選択的スプライシングを受けた植物の葉緑体、ペルオキシソーム、およびサイトゾルでの発現のための構造、2）そのクローニング、遺伝子銃でタバコの葉の細胞への3）の配送を説明し、 GFPで観察されたように、オルガネラターゲティングを示す4）結果および共焦点顕微鏡。

<table><tbody><tr><td>オリゴヌクレオチドプライマー</td><td>IDT</td><td>(カスタム)</td><td>コンストラクト専用の設計</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(カスタム)</td><td>500 bp オリゴヌクレオチド</td></tr><tr><td>ApEソフトウェア</td><td>U Utah</td><td>(ダウンロード)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinEluteキット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>PCR産物の精製に使用</td></tr><tr><td>QIAprepスピンミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>クローニングに適した量のプラスミドを調製するために使用</td></tr><tr><td>Phusion GCバッファー入りマスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>目的遺伝子のPCR増幅に使用</td></tr><tr><td>Gibsonアセンブリ反応ミックス</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>次の9成分のマスターミックス</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson アセンブリミックス</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G バイオシエンス</td><td>82023-086</td><td>ギブソン組立ミックス</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson 組立ミックス</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>ギブソン組立ミックス</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>ギブソン組立ミックス</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>ギブソン組立ミックス</td></tr><tr><td>T5 エキソヌクレアーゼ</td><td>震源</td>地 <td>T5E4111K</td><td>ギブソン組立ミックス</td></tr><tr><td>Phusion ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>ギブソンアセンブリミックス</td></tr><tr><td>Taq DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>ギブソンアセンブリミックス</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>計算を簡素化するウェブサイト</td></tr><tr><td>プラスミドプラスマキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>遺伝子銃の弾丸のDNAを調製するために使用されます</td></tr><tr><td>遺伝子銃システム</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>必要なすべての部品が含まれています</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/</td><td>a)(n/a)</td><td>Gift of Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>結果細胞のイメージング</td></tr><tr><td>ディープウェルスライド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71561-01</td><td>共焦点イメージングに使用</td></tr><tr><td>A プラスミドエディター (ApE) </td><td>ユタ</td><td></td>大学 <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:ライゲーション計算機</td><td></td><td></td><td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

複数の細胞内小器官への単一のタンパク質を標的化するために、植物は典型的に関連性のある遺伝子を複製し、差動プロモーターおよび/またはシグナル配列を含む複雑な調節戦略を用いて別々に各遺伝子を発現する。メタボリックエンジニアや特定の細胞小器官に酵素を標的とすることに興味の合成生物学者は、チャレンジに直面している：複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質のために、エンジニアは、同じ遺伝子を複数回複製しなければなりません。この作品は、この戦略に対する解決策を提示：mRNAの選択的スプライシングを利用する。この技術は確立された葉緑体およびペルオキシソーム標的化配列を利用して、選択的にスプライシングされた単一のmRNAにそれらを組み合わせたものです。いくつかのスプライスバリアントは、葉緑体、ペルオキシソームにいくつか、および細胞質ゾルへのいくつかに送信されます。ここで、システムは、複数のオルガネラが選択的スプライシングに標的化するために設計されている。本研究では、GFPは、exprがあると予想された合理的に設計された5 &#39;のmRNA一連のタグによって葉緑体、細胞質ゾルおよびペルオキシソームでessed。これらのタグは、異種遺伝子は、複数の細胞内小器官で発現されることが必要なときに必要なクローニングの量を減少させる可能性を有する。構築物は、以前の研究11で設計し、ギブソン·アセンブリ、制限酵素を必要とせず、ライゲーション非依存性クローニング法を用いてクローニングした。得られたプラスミドは、改変された遺伝子銃プロトコールでベンサミアナタバコ葉表皮細胞に導入した。最後に、形質転換された葉を共焦点顕微鏡で観察した。

設計作業は、重要な計画の結果であった。このプロジェクトへの新規で示差的に発現するタンパク質に翻訳されるmRNA前駆体を作成するための選択的スプライシングを使用することである。これらのタンパク質は、この場合には、異なる細胞小器官で発現される葉緑体、ペルオキシソームおよび/または細胞質ゾル。我々は、代わりに6を接合される天然のシロイヌナズナ遺伝子を適応し、かつ17が代替エクソン（TriTag-1とTriTag-2）中の配列を標的知ら葉緑6とペルオキシソームを置いた。 TriTag-3は、葉緑系列の低複雑領域内に埋め込まれたペルオキシソーム信号で構成されています。これらは、GFP（ 図1）とインフレームで配置した。 PIMT2遺伝子 6、配列を標的とする葉緑体およびペルオキシソーム、GFP、およびプラスミド骨格からネイティブの選択的スプライシングの養生法：本研究で用いたプラスミドは、このようにいくつかの要素を含んでいた。各々が非常...

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

本実験の全体的な目的は、タバコ葉の表皮細胞においてGFPタグ付きレポーターの一過性遺伝子発現を観察することです。まず、葉緑体およびペルオキシソームで発現するDNAコンストラクトを設計します。次に、PCR増幅とGibsonアセンブリを用いて、このコンストラクトを構築します。次に、ジーンガンを用いて構築物をタバコ葉の表皮細胞に導入します。最終的に、共焦点顕微鏡でタバコ葉を観察すると、葉緑体およびペルキシソームにおけるGFPの発現が確認されます。古典的なクローニングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、制限酵素を必要としないため、PCRで増幅可能なあらゆる配列をクローニングできることです。遺伝子設計の柔軟性により、これらの手法の応用範囲はより大規模なスケールへと広がっています。農作物の遺伝子工学においては、まず植物細胞内の最終的なタンパク質発現部位を決定することから本プロトコルを開始します。本研究では、葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質への発現を標的とします。次に、発現コンストラクトを設計します。コンストラクトには、プロモーター、検出可能な遺伝子、およびターミネーターを単一のプラスミド内に含める必要があります。本例では、構成的プロモーターであるP end cup twoがGFPの発現を誘導し、その後にNolene Syntheターミネーター（またはnos t）が続きます。本実験では、葉緑体およびペルキシソームでの発現を目的として、GFPのC末端に融合させて発現させる一連のtritタグ（1つ、2つ、および3つのタグ）をテストすることに注意してください。ギブソンアセンブリ法は、調製済みのミックスに含まれる複数の酵素の作用により、二本鎖DNAの末端を部分的に消化し、隣接するDNA配列の相補的な塩基対のアニーリングを促進することによって機能します。最終的なコンストラクトは3つのパーツで構成されており、ギブソンアセンブリの前に4回のPCR反応で増幅させる必要があります。第1および第2の反応では、GFP NOS Tおよびcany耐性マーカーを含む8,000 bpのプラスミドベクターPOREを増幅します。この耐性マーカーは、この大きなDNAを、PCR増幅がより容易な2つの小さなテンプレートに分割するのに適した箇所です。第3の反応ではプロモーターP end cup twoを増幅し、第4の反応ではtriag oneを増幅します。これらはape designなどのin silico設計ソフトウェアを用いて、各断片間に50 bpのオーバーラップができるよう塩基単位で構築されています。PCR用のプライマーを注文する際は、50 bpのオーバーラップ部分を、各方向25 bpずつのプライマーとして使用することが可能です。各コンポーネントを増幅させるためのPCRを行った後、PCR産物を個別に精製し、脱イオン蒸留水で希釈します。PCRテンプレートにE. coliからのミニプレップを用いた場合は、制限酵素DpnIで処理することで、混入したテンプレートDNAを除去します。次に、各DNA断片の濃度を測定します。コントロールを含む、アセンブリを行う各コンストラクトのベクター濃度を約150 nanograms per microliterに調整し、Gibson Assembly mixの15 microliter分注液をフリーザーから取り出して氷上で融解させます。オンラインのオープンソースツール@gibbon. orgを使用して、各フラグメントを等モル量にするための液量を決定します。計算した各フラグメントの量を、15 µLのGibsonミックスに加えます。また、ベクターDNAのみのコントロールも調製します。各反応の総量は20 µLとなるようにしてください。必要に応じて、水を用いて液量を調整します。チューブを50〜55 °Cで30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを再び氷上に置きます。-80 °Cのフリーザーから、市販の塩化カルシウム処理済みコンピテントE. coli 200 µLが入ったマイクロ遠心チューブを取り出し、手の中で軽く温めます。次に、反応液20 µLすべてをE. coliに加えます。培養物を氷上で30分間インキュベートし、その後42 °Cのウォーターバスに移して60秒間ヒートショックを行います。エレクトロコンピテントセルは使用しないでください。塩濃度が比較的高く、DNA濃度が低いため、形質転換後にセルにアーク放電が発生する可能性があります。形質転換後、培養物を2分間氷上に置き、その後750 µLのSOCまたはLB培地を加えて37 °Cで30分間回復させてください。次のプレートとして、canyまたはその他の適切な抗生物質を含むLBプレートに混合液を播種し、37°Cで一晩培養した後、10個のコロニーをシーケンシングによりスクリーニングします。この方法は、従来のライゲーションベースのクローニングよりもバックグラウンドが高くなり、非標的組換えイベントの数が増える可能性があることに注意してください。ジーンガンを用いたタバコへのバイオティクス・トランスフェクションについては、以前にJoVEで解説されています。ここでは、従来のプロトコルからの主要なステップと相違点について概説します。コンストラクトを増幅および単離した後、woodsおよびzetoによるJoVEの記事に記載されている方法でジーンガン用弾丸を調製し、ニコチアナ・ベンハミアナ（Nicotiana benhamiana）のタバコ葉表皮組織へ形質導入するためにジーンガンに装填します。樹齢3〜5ヶ月の個体の、基部に近い大きな葉を選択してください。適切な保護メガネと耳栓を着用し、15 centimeterのペトリ皿に入れた濡れたペーパータオルの上に、葉の裏側を上にして慎重に置きます。ジーンガンのヘリウム圧を200から250 PSIに設定します。ジーンガンを葉の裏側の主脈の間に、葉から約3から5 centimeter上の位置に慎重に向けます。安全装置を解除し、粒子を葉に導入します。葉の同じ位置に、各弾丸を2回ずつ使用してください。葉が破裂した場合は、別の位置に移動してプロセスを繰り返すか、その葉を廃棄して新しい葉で開始してください。年齢や水分などの成長条件により、葉の強靭さにはある程度のばらつきがあります。すべてのショットが完了した後、葉を覆い、ベンチ上の低光量下で2〜3日間保存します。UV蛍光装置を備えた解剖顕微鏡で葉を観察し、GFPを発現している個々の細胞を探します。GFP発現細胞が見つかったら、解剖用ハサミを使用して、葉の5〜10 mmのセクションを慎重に切り出します。個々の葉の断片を、約200 µLの0.1% Triton X 100を含むディープウェル顕微鏡スライドのウェルにすぐに浸します。界面活性剤は表面への気泡の形成を防ぐ役割を果たし、ディープウェル顕微鏡スライドを使用することで、適切なフィルターと40x水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて、より広い組織領域の細胞イメージングが可能になります。本研究では、3種類の異なるGFPオルガネラ標的構築物を、タグなしGFPおよびrubis.Coagと比較しました。タグなしGFPを発現させた対照実験において、一過性変換された単一細胞のGFP蛍光を検出するために、GFP共焦点顕微鏡を用いた。蛍光は核と細胞質でのみ観察され、葉緑体では観察されない。葉緑体は、葉緑体標的型RubisCOのみを導入した細胞のこの例に見られるように、クロロフィルの赤色自家蛍光によって識別される。GFP構築物GFPは、巨大なオルガネラで発現していた。細胞は白線で囲まれています。黄色は構築物とクロロフィルの共局在領域を示しており、このtriag one導入細胞の画像に示されるように、構築物が葉緑体に標的化されていることを示しています。GFPの発現は、葉緑体、周辺部、細胞質、およびペルオキシソームと考えられる小さな点状のオルガネラに認められます。同様に、triag two導入細胞においても、葉緑体、細胞質、およびペルオキシソームでGFPが発現しています。葉緑体配列の低複雑性領域内にペルオキシソームシグナルが組み込まれたtriag threeは、葉緑体とペルオキシソームにのみ局在しました。この細胞は異なる葉層にあることに注意してください。この図は、典型的なタバコ葉表皮細胞のコンパートメントで観察された発現をまとめたものです。細胞内での相対的なサイズと位置、およびジーンガン法によるトランスフェクションと共焦点顕微鏡観察によって認められた相対的な発現レベルが示されています。タグのないGFPは細胞質と核に局在し、PIMT two GFPコントロールは葉緑体に局在し、triag one GFP、triag two GFP、およびTriag 3G FPは予測通り葉緑体とペルオキシソームに局在することに注意してください。このビデオを視聴することで、Gibson assemblyを用いてプラスミドを構築し、それをタバコ葉に弾丸法で導入し、3日以内にGFPの発現を観察する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、Gibson assemblyに150 ng/µLのベクターDNAを、またジーンガン弾の作製に最終的なDNA構築物を1500 ng/µL使用することを忘れないでください。この手順に続き、一過性ではなく安定した遺伝子発現を得るために、アグロバクテリウム法などの他の手法を行うことができます。

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

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