の蛹ケースを画像化キイロショウジョウバエ
2014年1月23日
本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。
このビデオでは、ショウジョウバエMelanogasterの構造的完全性を損なうことなく、Drosophila Melanogasterのpubeを画像化できる新しい技術を紹介します。瞳孔ケースを無傷に保つことにより、蛹の発達と生存率に対するイメージングの影響を最小限に抑えます。イメージングには、共振走査型 8 、 000 ヘルツの共焦点顕微鏡を使用します。
重要なのは、この顕微鏡の非常に速いスキャン速度と高感度により、漂白が大幅に減少し、長時間の観察が可能になることです。この方法により、挙動、fop、足病、形態形成、食作用、有糸分裂など、さまざまな細胞生物学的プロセスを視覚化することができました。この技術により、生物に損傷を与えることなく、その場で長期間イベントを観察することができます。
これらの方法から得られた観察は、ショウジョウバエの発達、チーズの人々、適切な段階で、この比較的アクセスしにくい段階での生物学的現象の様々な理解に使用することができます、我々はまだバイアルで細胞分裂を研究するために発生段階で主要な指標を探しながらそれらを調べます、我々は彼らの頭を避けた琵琶を探しています、 しかし、それでも緑色のパケットと胎便と背腹部は見えません。湿った絵筆で覗きケースに触れ、水を移して唾液のりを溶かすことで、個体をほぐします。その後、琵琶を軽くつまんで自由にし、絵筆でつまみ、水の入ったペトリ皿に移します。
人々は食べ物や破片のケースをきれいにするために水で徹底的に洗われます。次に、背側を上にして並べて、正しいステージにあることを確認します。取り扱いには十分注意してください。
パイプに小さな穴が開いているだけでも簡単に死んでしまいます。選択された個人は、慎重に配置され、ガラス底のペトリ皿と、関心のある特徴がカバースリップに最も近く、表面にできるだけ平行になるようにそれを向きます。瞳孔の翼を観察するために、蛹を細い長さ、モデリングクレイ、歯科用ワックスなどの支持体に支え付け、向き付け後に動かないようにします。
次に、関心のある特徴が目に見え、向きがよくなっていることを確認するために、料理を招待します。通常、一度に複数のピパをマウントすると、1つが蛍光タンパク質を発現していない、または目的の段階にない可能性を防ぐことができます。琵琶がすべて取り付けられ、適切な向きになったら、純粋な油の屈折率に一致する無毒の山であるdiod dilin glycolで湿らせた絵筆で各琵琶の底に触れます。
これは、瞳孔ケースからの回折を減らし、液浸レンズの屈折を減らすという2つの目的を果たします。次に、レーザー走査型共焦点顕微鏡に移行します。レゾナンススキャナーを搭載したSPファイブのような反転式を使用しています。
皿を顕微鏡に取り付け、顕微鏡の光学系を使用して子犬の位置を特定します。蛹が見つかったら、この場合に関心のある特徴である翼が見えるようにピントを調整します。翼の中央を走る大きな気管要素の存在によって翼を識別します。
関心領域が特定され、顕微鏡の焦点が合わされたら、20 x ドライ対物レンズに進みます。ピントを再確認した後、顕微鏡を共焦点モードに切り替えます。光への露出を最小限に抑えるために、共焦点のパラメータを調整します。
光強度は透過率10%未満に保たれます。明るさを最大限に引き出すために、azuma fourの20倍レンズではピンホールを130ミクロンに開き、ゲインを900ボルトに設定します。これらの設定により、有糸分裂間隔の長さや動物の健康状態に影響を与えることなく、何時間も画像化できます。
次に、観察しようとしている生命現象の特性に合わせてZセクションの数と画像キャプチャの頻度を設定します。たとえば、1分間のイメージング間隔で細胞分裂のすべての重要な特徴を十分にキャプチャします。しかし、3秒間隔は、足葉のダイナミクスを観察するために重要です。目的の機能が見つかるまで、上皮を上下に焦点を合わせます。
必要に応じて、顕微鏡とXYZTモードを使用して、経時的にZスタックを収集します。映画の上映時間も重要なパラメータです。10時間もの動画を作りました。
複数の蛍光分子を同時にイメージングする場合、イメージング全体の持続時間を短くするよう努めています。原則として、各蛍光タグは活性酸素種の生成を増加させます。実際には、3重にラベル化されたラインを1時間以内でイメージングすることに関連する致死性は観察されていません。
標的組織またはプロセスが約5ミクロンより小さい場合は、液浸レンズを使用する必要があるでしょう。これらのレンズは、光強度を増加させ、それによってレーザーをより細かい点に集束させ、それに応じてイメージングパラメータを調整する必要があることに留意してください、ムービーは共焦点顕微鏡から高速道路の画像分析プログラムを実行しているコンピュータに転送されます、フィジー。フィジーを使用すると、共焦点によって生成された多次元画像の特徴を開き、測定し、操作できます。
このイメージング方法により、細胞周期に対する核の位置を研究することができました。瞳翼では、上皮の上部から観測可能な最下部の原子核まで、1分間隔でZスタックを収集しました。これらの動画では、左に示した頂端共焦点切片で分裂が起こっているだけを観察しており、右に示した基底切片では、表層から新たに分裂した核が戻ってくることが明らかになっていますが、有糸分裂の他の特徴は含まれていません。
これらのデータは、急速に分裂する瞳孔翅上皮が幼虫の翅椎板や他のMedOneと類似していることを示しています。その核の上皮は、有糸分裂中に上皮の頂端表面に移動します。この共通性にもかかわらず、瞳孔翅上皮は比較的非成層化されており、ほとんどの核が最上層に非常に近い
。瞳孔の発達の初期段階でショウジョウバエを画像化する従来の方法は、主に瞳孔の症例を切除または貫通しようとする試みのために妨げられてきました。ここでは、生物の生存率に影響を与えることなく、発生中の成体細胞を視覚化できる新しいアプローチについて説明します。私たちの方法は、瞳孔ケースを完全に無傷に保つという点で、他の方法とは質的に異なります。
共焦点顕微鏡と共鳴走査の組み合わせにより、瞳孔ケースから20ミクロン以内で発生中の組織を視覚化することができます。解像深度の主な制限は、レンズの作動距離と、ケースから組織内での散乱です。しかし、私たちの方法では、上皮細胞の頂点から基部までの特徴を分解することができます。
この手法を使用して、有糸分裂、葉状、足病、形態形成、および食作用を観察しました。これに加えて、1つのサンプル中に3つの異なる蛍光タグを研究しました。ここで説明したアプローチは、瞳孔発達の初期から最外皮層の研究までを開いたと考えています。
geal遺伝学の力と組み合わせると、このアクセシビリティは、成人の発達についての私たちの理解をさらに向上させる可能性があります。
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概要
この研究は、高速走査共焦点顕微鏡を用いた新しいイメージング技術を用いて、ショウジョウバエの蛹の構造的完全性を損なうことなく観察することを実証しています。この方法により、発生の重要な段階における動的な細胞プロセスの可視化が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- イメージング技術
背景
- 蛹のイメージングは、その繊細な構造のため困難です。
- 従来のイメージング方法は生体にダメージを与える可能性があります。
- 蛹の殻の完全性を保つことは、正確な観察に不可欠です。
- 高速イメージング技術は、光減衰を減少させ、観察時間を延長することができます。
研究の目的
- ショウジョウバエの蛹をその生存能力を損なうことなくイメージングする方法を開発すること。
- 様々な細胞生物学的プロセスをin situで可視化すること。
- 動的な細胞イベントの観察期間を延長すること。
使用した方法
- 8,000ヘルツで動作する共鳴走査共焦点顕微鏡。
- 蛹の発育への影響を最小限に抑えるイメージング技術。
- 細胞挙動、形態形成、有糸分裂の観察。
- 動的なプロセスを捉えるために延長されたイメージングセッション。
主な結果
- 細胞吞作や有糸分裂などの細胞挙動の成功した可視化。
- イメージング中の光減衰の減少により、長時間の観察が可能になりました。
- 動的なプロセスは、生体を傷つけることなくin situで観察されました。
- 蛹の殻を通じたイメージングの実現可能性を実証しました。
結論
- 開発されたイメージング技術は、ショウジョウバエの発育の研究に効果的です。
- この方法は細胞生物学の研究に新しい道を開きます。
- 構造的完全性を維持することは、正確な発生研究に不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Imaging through the intact pupal case of Drosophila melanogaster enables non-invasive observation of dynamic cellular processes during a critical developmental window. This approach supports target validation and phenotypic screening by providing quantitative, time-resolved data on mitosis, morphogenesis, and phagocytosis in a disease-relevant system. The method enhances predictive confidence in preclinical models by preserving biological integrity while capturing subcellular dynamics over extended periods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing protein dynamics and cellular behaviors in situ.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of mitotic events and pathway activity.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a native tissue context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening with standardized mounting and imaging protocols.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of nuclear positioning, membrane dynamics, and fluorescent protein localization over time.
- Scalability: Allows parallel mounting of multiple pupae to increase throughput and reduce variability in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a physiologically relevant system for studying cell cycle regulation and cytoskeletal dynamics in epithelial tissues.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by capturing dynamic processes that inform biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing mechanistic insights into cellular responses to genetic or pharmacological modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling real-time, quantitative readouts of cellular dynamics in a native tissue environment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing mitotic events and protein localization in pupal epithelia.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible mounting, standardized imaging parameters, and compatibility with multiple fluorescent tags.
- Analytics: Generates Z-stacks and time-lapse data that allow teams to compare conditions and track nuclear movement, phagocytosis, and morphogenesis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing disease-relevant insights into epithelial cell behavior and cytoskeletal dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying developmental processes across multiple projects and fluorescent reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cell cycle and cytoskeletal regulation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and extended observation times through resonant scanning and refractive index matching.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling long-term imaging without compromising organism viability.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by revealing dynamic phenotypes that correlate with genetic or pharmacological interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, sample mounting, and fluorescent protein handling.
- Needs a resonant scanning confocal microscope capable of 8,000 Hz operation and appropriate objectives.
- Demands cross-team standardization of mounting orientation, imaging intervals, and z-stack parameters.
- Involves adaptation considerations for different fluorescent tags and tissue depths beyond 20 µm.
- Limited to superficial epithelial layers due to scattering and working distance constraints of conventional objectives.
