エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

この手順の全体的な目標は、筋球を生成することです。ヒト胚性幹細胞由来の骨格筋細胞からなるEB様構造。これは、Baf 60 C.Theのレンチウイルス感染によって細胞を再プログラミングすることによって達成されます手順の2番目のステップは、同じ細胞に2番目のウイルスであるmyo Dレンチウイルスを感染させることです。

次に、感染した細胞を血清ベースの培養培地で5日間EB様凝集体を形成するように誘導されます。次に、EB培地を無血清分化培地と交換し、凝集体をさらに2週間成長させてマイオス球にします。最終的に、免疫蛍光法は、OCTに包埋された凝集体の切片を可視化するために使用されます。

この技術の主な利点は、間葉系または中胚葉系の先駆細胞からの誘導と同様に、事実の選別を必要とせず、したがって、三次元文化システムと互換性がある骨格筋細胞の高収率変性です。6つのウェルプレートでヒト胚性幹細胞への感染の前日は、ヒト胚性幹細胞のクローニングと回復サプリメントを1000×で培地に追加し、次に2マイクロモルの最終濃度を実現します日は、ヒト胚性幹細胞を高力価浴60CGFPレンチウイルスで感染させます。まず、1ミリリットルの胃袋を加え、プレートを5分間インキュベートすることにより、細胞のウェルを単一の細胞懸濁液に解離します。次に、懸濁液を集めて15ミリリットルのチューブに移します。

調製した培地の9ミリリットルを追加し、1ミリリットルの山まで待ちながら、細胞を1, 200RPMで5分間スピンダウンします。ポリブレインを6マイクログラム/ミリリットルの最終濃度で追加し、ヒト胚性幹細胞回復サプリメントを2マイクロモルで追加します。

次に、この溶液に細胞を再懸濁し、6ウェルの低接着プレートの1つのウェルに移します。次に、集中浴60Cウイルスを1億人の感染の多様性で追加します。プレートをウイルスと3時間インキュベートします。

次に、細胞を採取し、マトリゲルコーティングされた2つのプレートウェルに分割します。各プレートに、2ミリリットルのmt、SIR、1つに2マイクロモルサプリメントを加え、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、メディアを新しいメディアと交換します。

細胞は、感染の開始から48時間後にすでに凝集しているように見えます。蛍光をチェックして、感染効率を評価します。細胞が80%コンフルエンスになるまで毎日の培地交換を続け、その後、同じプロトコルを使用して細胞とmyo Dウイルスを細胞に解離します。

感染した細胞を、この成長点の前日に80%のコンフルエントに達するまで、毎日培地を交換して維持します。マトリゲルコーティングされたプレート上に1000細胞/平方センチメートルでMESをプレート化し、感染細胞をME'Sプレートに継ぎます。翌日。

トリップALIを使用してそれらを解離し、細胞を細胞への15ミリリットルのチューブに移します。9ミリリットルのヒト胚性幹細胞培地を加え、遠心分離機にかけます。1, 200 RPMを5分間追加します。

Resusは、ペレット化した細胞を新鮮な6ミリリットルのヒト胚性幹細胞培地に懸濁します。次に、mesの2つのプレートから培地を取り出し、感染した細胞をそれらに加えます。細胞を数日間インキュベートします。

一度、80% の confluence を追加します。すべてのメディアを取り出し、コラゲナーゼ4をミリリットル追加します。37°Cのコラゲナーゼで5分後に1ミリグラム/ミリグラムを加えます。

コラゲナーゼをミリリットルのヒト胚性幹細胞培地に置き換えます。次に、解剖顕微鏡で10ミリリットルのピペットチップを使用してコロニーをこすり落とし、コロニーを15ミリリットルのチューブに移して沈殿させます。3分後、上清を取り除き、細胞をヒト胚性幹細胞培地に再懸濁します。

次に、細胞をメスプレートに対して1〜4の比率でプレートします。感染した細胞は、この手順のために多数である必要があり、良質のコロニーを形成しています。各ウェルから培地を取り出し、1ミリリットルのコラゲナーゼを加えます。4。

従来通り1ミリグラム/ミリリットルの濃度を加え、5分後にコラゲナーゼ反応をEB培地に置換して行います。そして、顕微鏡を使ってコロニーを素早く削り取ります。10ミリリットルのピペットチップを使用して、細胞を小さな細胞塊に解離させることができます。

これらの凝集体を15ミリリットルのチューブに集め、約3分間落ち着いた後、上清を取り除き、細胞を3ミリリットルのEB培地に再懸濁し、すべてを6ウェルの低付着プレートの1つのウェルに移します。このプレートを翌日一晩インキュベートします。大きなコロニーチャンクがないか確認してください。

見つかった場合。5ミリリットルのピペットに数回流して、それらを分割します。浮遊する単一細胞が多い場合は、沈殿によって凝集体を回収し、新しいEB培地と交換します。

5日間の培養後、1日おきにメディアを交換してください。細胞凝集体を採取し、2ミリリットルのPBSで1回洗浄し、細胞が通常の重力下で沈殿することを確認します。次に、PBSを3ミリリットルのDM培地と交換し、次の15日間の培養で細胞を同じプレートウェルに戻します。

ミディアムは3日ごとに交換してください。この間に、中間圏が形成されます。ヒト胚性幹細胞をGFP蛍光を運ぶ浴60°Cに感染させた。

72時間後、細胞は事実を分類されました。BAF 60 Cを発現する細胞を約75%coの流暢さまで増殖させた後、myo Dレンチウイルスに感染させました。感染細胞における外因性遺伝子発現は、定量的リアルタイムPCRによって検出されました。

タンパク質レベルでの発現と分布を調べました。次にGFPはbaf 60 Cの発現に対応し、myo D抗体を用いてmyo Dの発現を確認しました。ヒト胚性幹細胞がEB様凝集体を形成し始めてから15日後。

ミオス球の一部をOCTコンパウンドに包埋し、筋原性およびミオシン重鎖マーカーに対して陽性に染色された切片を切片化した。10日目から、筋球の散発的な収縮を観察することができました。一部のミオス球は、おそらくミオス球間の融合により、異なるまたは珍しい形状を呈していました。

この技術は、さまざまな筋肉障害に罹患した患者の多能性幹細胞から筋球を生成できるため、疾患のモデリングと治療の分野での研究を前進させます。そのため、myo spheresは、薬物洗浄や疾患の病因に適した疾患インエディションモデルを提供します。