Name: 臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学ぶ 循環腫瘍細胞（CTC）の検出・計数・特性評価法。CellSearchシステムを用いてヒトおよびマウス異種移植血液サンプルからCTCを検出し、標的治療薬選択に有用な分子特性解析プロトコルを確立する方法です。

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この作品は、癌研究のオンタリオ研究所（＃08NOV230）、イノベーションのためのカナダ財団（＃13199）、前立腺がんカナダ、ヤンセン腫瘍学、ロンドンリージョナルがんプログラム、およびジョンとドナブリストルからドナーの支援を通じてからの補助金によって支えられて（ALA）は、ロンドン健康科学財団。 LELは、フレデリック·バンティングとチャールズベストカナダ大学院奨学金博士賞でサポートされています。 α-リノレン酸は、CIHR新しい研究者賞と研究とイノベーションのオンタリオ州省か​​らの早期リサーチャー賞でサポートされています。

本稿で説明したすべてのヒトでの研究は、ウェスタン大学の人間研究倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物への使用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアカナダ評議会の勧告に従って行った。 1。 CSSを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙 1。準備インストゥルメントの処理のための人間の血液サンプル採取と準備<ol><li>標準的な無菌瀉血技法を使用して、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および独自の細胞保存剤を含有する（以下、CTC防腐チューブともいう）を、10ml CellSaveチューブにヒト血液8.0mlの最小を描く。血液の凝固を防ぐために、チューブの5倍を反転します。サンプルはすぐに処理されるか、最大96時間室温で保存することができる。 </li><li>リムーバブル冷蔵庫から電子のCSS試薬およびそれらを使用する前に室温に温める。 </li><li>使い捨ての10ミリリットルピペットや自動分注器を使用して、CTCの防腐管からの血液7.5ミリリットルを収集し、徐々に適切にラベル作成機器の処理チューブに血液を分注する。 </li><li>各サンプルに希釈緩衝液6.5ミリリットルを追加します。サンプル5X転倒混和する。 「オフ」の位置にブレーキをかけながら10分間800×gで遠心分離サンプル。処理のためにシステムにすべての患者サンプルをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。サンプルは、準備の1時間以内に処理されなければならない。 </li></ol> 2。準備インストゥルメントの処理のための制御の準備<ol><li>優しくコントロールバイアルをボルテックスし、混合することが5倍に反転。 </li><li>慎重にコントロールバイアルからキャップを外し、キャップを外し、バイアルの上に反転準備計器処理チューブを配置します。 1迅速な運動では、反転バイアルを制御し、処理チューブに内容物を注ぐ。反転しながら、ゆっくりと残りの内容物を放出するために、制御バイアルの側面をフリック。 </li><li>慎重に、処理チューブから反転制御バイアルを取り外し、液体が失われないことを保証し、脇に置きます。千μLピペットを用いて、処理チューブにバイアル蓋と静かにピペットから、残りの内容を収集します。 </li><li>処理のためのシステムにコントロールをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。 </li></ol> 3。分析計測器上のサンプルのスキャン<ol><li>システムからすべてのサンプルをアンロードする準備機器で画面上の指示に従ってください。ゆるく各磁気デバイスカートリッジにキャップをし、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと私は、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、室温で少なくとも20分間、暗所ncubate。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。 </li><li>分析装置の電源を入れ、ランプを初期化します。一回（15分〜）温め、分析機器へのシステム検証カートリッジをロードし、QCテスト ] タブを選択します。必要な品質管理対策を行うために、画面上の指示に従ってください。 </li><li>分析装置にサンプルをロードして、 患者のテスト ] タブを選択します。製造器具からすべての保存された情報が表示されます。サンプルのスキャンを初期化するために、開始をクリックします。システムは、磁気デバイスカートリッジに粗い焦点およびエッジ検出を実行する。 </li><li>方向キーを使用して、必要に応じてすべてのエッジを調整します。選択して受け入れます 。システムは、ファインフォーカスを実行し、サンプルのスキャンを開始します。 </li><li>結果をスキャンし、以下のような制御は、高（CK + DAでスパイク細胞について定義された基準を使用して検証する必要がありますPI + CD45 - APC +）、低（CK + DAPI + CD45 - FITC +）濃度。結果をスキャンして、次の患者のサンプルは、定義されたCTCの基準（CK + DAPI + CD45 - ）を使用して収集したCTCのために見直すべきである。 </li></ol> 2。 CSSを使用してユーザー定義マーカーのCTC特性評価 1。ユーザー定義のマーカーとインストゥルメントの初期化の準備<ol><li>作業濃度は、試料に加えた後、抗体の濃度であり、ストック濃度は、抗体の濃度である以下の式を用いて、標識試薬カップに所望の濃度にボンド一次抗体希釈液を用いて目的の抗体を希釈試薬カップ。複数のサンプルについては、 表1に記載したように、抗体のボリュームを調整する。試薬カートリッジとLの位置1に標識試薬カップを置くCSSにカートリッジをOAD。 ストック濃度=（作用濃度X 850μL）/ 150μL </li><li> 、採血試料を作製し、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙上記で説明したように、準備測定器をロードします。準備機器によって要求されたら、カスタムマーカー追加を有効にするには、[ユーザーは、アッセイを定義しました 。入力マーカー名および[保存]を選択します。サンプルは、機器にロードされるように、オペレータは、必要に応じていいえを選択するかによって、カスタムマーカーを受け取るべきかを示すプロンプトが表示されます。 </li></ol> 2。分析計測器上のユーザー定義マーカーのサンプルスキャン<ol><li> CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化し、品質管理とシステム検証を実行</strong&gt;プロトコル。 </li><li>分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 FITCチャンネルを初期化するには、 試験プロトコル]セクションの下にキットのIDとしてCellSearch CTCを選択します。このメニューから、CTCの研究を選択し、[編集]ボタンをクリックし、必要に応じて露光時間を設定します。これは、CTCの識別に利用される他の蛍光チャンネルにブリードスルーを増やすことができますように、CSSのCTCキットを使用する際に1.0秒の露光時間を超えないことをお勧めします。 </li></ol> 3。前臨床マウスモデルで使用するための標準CSSProtocolの適応 ** Veridexマウス/ラットCellCaptureキットからの適用（もはや商業的に入手可能） 1。マウス採血および保管<ol><li>採血前、0.5M EDTAを30μlのは、ハブ中のEDTA、少量を残して、前後に22 G針を通して〜を実行します。 </li><li>以前同所、尾静脈、または心臓内経路を介してヒト腫瘍細胞を注射したマウスからマウスの血液を50μlの最小値を収集します。 （シリアルCTC分析用）伏在静脈から、または（端末のCTC分析用）心臓穿刺により血液を収集します。針を外し、1ミリリットルのEDTAマイクロテイ採血管に血液を分注する。血液の凝固を防ぐために、反転やそっとフリックチューブで混ぜる。血液はCytoChexセルラ防腐剤、等量の添加直後に処理されるか、最大48時間室温で保存することができる。 </li></ol> 2。 CTCの濃縮<ol><li>冷蔵庫からCSSの試薬を除去し、それらを使用する前に室温に加温することができます。 </li><li> 12ミリメートル×75ミリメートル、フローサイトメトリーチューブに全血50μlのと同等のものを転送します。チューブの両側に残っているいずれかの血液を下洗い、各サンプルに希釈緩衝液500μlを追加します。必要に応じて、短い遠心スピン残りの血液を採取するために使用することができる。 </li><li>優しく抗EpCAM磁性流体を渦を直接試料にピペットの先端を配置することによって、各サンプルに25μlを加える。穏やかに混合するキャプチャ強化試薬と渦の25を添加する。 15分間、室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li>磁石へのサンプルチューブをセットし、10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。 </li></ol> 3。 CTC染色<ol><li>核酸染料、染色試薬、抗マウスCD45-APC、抗ヒトHLA-アレクサフルーア488、および透過100μlを5.0μLの1.5μlを50μlを50μlの磁石を再懸濁からサンプルチューブを取り外す試薬。複数の試料については、これらの試薬は、予め混合してもよいし、混合物の206.5μlを各チューブに添加してもよい。穏やかに混合する渦暗所で室温で20分間インキュベートする。 </li><li>希釈緩衝液500μlを加え、ボルテックス優しく、磁石への場所のサンプルチューブを、そして10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。磁石からサンプルチューブを取り外し、希釈緩衝液350μlに懸濁します。渦を静かに混合する。 </li></ol> 4。磁気デバイスのロード<ol><li>ゲルローディングチップを使用して、慎重に磁気デバイス内のカートリッジにサンプルチューブからボリューム全体を転送します。カートリッジの下部に起動し、サンプルが分配されるように、ゆっくりと先端を引き出す。 </li><li>サンプル全体が転送されると、緩く磁気デバイスカートリッジにキャップをし、切開の説明に従って、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップしますN CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.1。 </li><li>ベベルとカートリッジの縁との間に、それらを捕捉することによって、滅菌22 G針を使用して、任意の気泡をポップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、少なくとも10分間、暗所でインキュベートする。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。 </li></ol> 5。分析計測器で手動で分離されたサンプルのスキャン<ol><li> 、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化して、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、品質管理とシステムの検証を行う。 </li><li>分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 フォーマットのサンプルボタンをクリックすることにより、磁気デバイスのデータボタン上の既存のデータをクリアします。 FITCチャンネルAを使用可能にCSSを使用してユーザー定義のマーカーについて、CTCの特徴付けのセクション2.2で説明したようにND 1.0秒の露光時間を設定します。 </li><li> 患者の試験タブをクリックして入力するサンプル情報を編集]を選択します。 試験プロトコルとしてキットIDとCellSearch CTCとCTCの研究を選択します。入力アスタリスクとして示されているように、残りの必要な情報。サンプル情報を保存し、[開始]をクリックします。 </li></ol>

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著者（ALA）は、その親会社ジョンソン·エンド·ジョンソンはまた、この記事で使用した試薬や器具を生産ヤンセン診断LLCを所有ヤンセン腫瘍学、提供された資金を受け取った。

2004年には、CSSが導入されて以来、多くの新しいCTC技術の開発にもかかわらず、この技術は、現在も市場で唯一の臨床的に承認の技術であるため、それは、CTCの検出および計数のための現在のゴールドスタンダードと考えられている。この原稿は、CSSが厳格な品質管理基準を有しているが、それが解釈バイアスの対象とし、患者サンプル中のCTC識別が添加サンプルの身分と大きく異なっていることができることを実証しました。一般的に矛盾した項目の6つのカテゴリーは、CTCの誤分類が発生する可能性がありますが同定された。これらの矛盾の項目は、本機で処理された各患者の試料に複数のレビューの必要性を強調している。また、CTCのを得られた患者に対してスパイクで観察された差異は、スパイクと患者の両方のサンプルで検証する、新しいCTCの技術の必要性があることを実証している。また、これらの新技術は、aがbなければならないEスパイクサンプルからの効率的なCTCキャプチャのみ必ずしも患者サンプル中のCTC捕獲効率を反映していないとしても、スパイクと患者サンプルの分割サンプルテストを使用して、ゴールドスタンダードのCSSに比べて。 <p class="jove_co...

2013年には580350人々が癌で死亡すると推定されており、この病気のこと1660290新しい例は、一人で1米国で診 ​​断されます。これらの死亡の大半は転移性疾患2の開発に続いて起こる。転移および転移カスケードの限られた理解の治療に有効な治療法の現在の不足は、病気のこの段階は非常に致命的なことができます。血流内の腫瘍細胞（CTCの）の循環の存在は、転移性疾患3と相関することが実証されている。これらの細胞は非常にまれであり、その検出は、転移性乳癌4、前立腺5で全生存期間を示すものであり、大腸癌6。少ないまたはSAMにおいて検出のCTCを有する患者と比較した場合、これらの患者では、血液7.5mlの中≥5（乳癌および前立腺）の存在下または≥3（大腸）のCTCは、予後不良の指標であるEの血液量。また、治療的介入の間または後のCTC数の変化は、しばしば、より早く現在利用技術7-10よりも、治療応答の予測因子として有用であることが実証されている。 それは、転移癌患者において、CTCのは10 5〜10 7血単核細胞当たり約1 CTCの頻度で発生し、限局性疾患を有する患者において、この周波数は（1〜10 8で〜）であっても低くてもよい、と推定されている。これらの細胞のまれな性質は、それが困難で正確かつ確実11のCTC を検出し、分析することができる。 （以前は12〜14日）のいくつかの方法は、血液成分を囲むと区別する特性を利用することにより、これらの細胞を濃縮し、検出するために利用されてきた。一般的には、CTCの列挙は、濃縮工程と検出工程の両方を必要とする2段階のプロセスである。伝統的に、濃縮のステップは、物理の違いに依存しているCTCの（細胞の大きさ、密度、変形能）またはタンパク質マーカー発現に対する（ すなわち、上皮細胞接着分子[EpCAMの】サイトケラチン[CK]）のiCalの特性。濃縮後、CTCの検出は、核酸に基づくアッセイおよび/またはフローサイトメトリーアプローチである最も一般的なものは、異なる多くの方法で行うことができる。これらの戦略はそれぞれ異なる利点と欠点を持つが、それらすべてが標準化を欠いている、ユニークである。臨床現場への進入のための必要性。 CellSearchシステム（CSS）は、したがって、蛍光顕微鏡および抗体ベースの技術4-6を用いて、ヒト血液中の希少なCTCの検出および計数のための標準化された方法を提供することを目的に開発されました。このプラットフォームは現在、CTCの列挙型のゴールドスタンダードとみなされ、診療所15で使用するために米国食品医薬品局（FDA）によって承認された唯一の技術です。 CSSは、2コンポーネントのプラットフォームconsistinですgの、ヒト血液試料の調製を自動化（1）CellTracksオートプレップシステム（以下、製造装置ともいう）と、これらをスキャンし、（2）CellTracksアナライザーII（以下、分析装置と称す）調製後のサンプル。準備器具白血球を汚染するのCTCを区別することは、抗体媒介性、磁性流体ベースの磁気分離手法及び示差的な蛍光染色を使用する。最初に、システムは、鉄ナノ粒子にコンジュゲート抗EpCAM抗体を使用したCTCを標識する。次いで、試料を磁場中でインキュベートされ、全ての未標識細胞が吸引される。選択された腫瘍細胞は、蛍光標識抗体と核染色試薬からなる差動蛍光染色に再懸濁し、インキュベートする。最後に、試料を、磁気カートリッジに移し（以下、磁気装置ともいう）と呼ばれるMagNest、およびscさ分析機器を用いてanned。 分析装置は、10X対物レンズを用いて、異なる蛍光フィルターを用いて調製されたサンプルは、適切な蛍光体粒子に最適化された各々をスキャンするために使用される。 CTCのは、抗EpCAM、抗パン-CK-フィコエリスリン（PE）が結合する細胞（CK8、18、および19）、および核染色4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）として識別される。逆に、混入白血球を、抗CD45-アロフィコシアニン（APC）およびDAPIが結合する細胞として同定される。走査に続いて、コンピュータで定義された潜在的な腫瘍細胞がユーザに提示される。これらの画像から、ユーザは、CTCのあるイベントを決定するために、上記の定義されたパラメータと差動染色を用いて定性分析を採用する必要があります。 CTCの計数のために標準化された方法を提供することに加えて、CSSは、目的のタンパク質マーカーに基づいて、CTCの分子特徴づけを可能にする。この呼び掛けCCTCの同定16には必要ないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）蛍光チャンネルを使用して、単一細胞レベルで実行することができる。このプラットフォームは、分子特性解析のための能力を提供するが、プロトコル開発および最適化の詳細な処理は、明確に定義されていない。 3種の市販のマーカーは、上皮成長因子受容体（EGFR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）、およびインスリン様成長因子1受容体（IGF-1R）を含む、CSSでの使用のために製造業者によって開発されている。 HER2分析は、CSSと組み合わせて、臨床意思決定を通知するために、潜在的に既存の治療ガイドラインを変更するCTCの特徴づけの可能性を例示するためにいくつかのグループによって利用されてきた。例えば、Fehm ら は、HER2-17原発腫瘍を有する乳癌患者の約3分の1は、HER2 +のCTCを有していたことを実証した。また、Liu ら。18は最近、HER +転移性乳癌患者の最大50％がHER2陽性のCTCを持っていなかったことを報告した。ハーセプチン、大幅に腫瘍がHER2の十分なレベルを発現、HER2陽性原発腫瘍19〜21の患者さんのために一般的に利用され、治療された患者に利益をもたらすことが実証モノクローナル抗体を妨害HER2受容体。しかしながら、これらの研究は、ハーセプチンは、サブ最適に利用し、CTCの特徴づけは、治療応答の予測を助けることができることであることができることを示唆している。最終的に、CTCの特徴づけは、パーソナライズされたケアを改善する可能性を有していてもよい。 それは主にベッドサイド·ツー·ベンチトップアプローチを利用しているという点で、CTCの研究がユニークです。この方法は、多くの場合、患者のケアに影響を与えるには何年もかかることができ、ベンチトップ·ツー·ベッドサイドの研究とは異なり、臨床現場へのCTCクイック入力を可能にした。しかし、医師は患者の治療の意思決定MAKで、CTCの分析の結果を使用して躊躇しているそれらの基礎となる生物学の理解の不足のためにING。したがって、転移および相補CTC分析技術の適切な前臨床マウスモデルが、これらの未解決の疑問を調査するために利用されなければならない。一般的には、転移カスケードのすべてのステップの研究を可能にする転移カスケードを研究するために使用される前臨床モデルの2つのタイプ、（1）自然転移モデルは、存在のみを可能にする（2）実験的転移モデルこのような血管外漏出と二次腫瘍形成22として、転移プロセスの後の段階の研究。自然転移モデル（前立腺癌の研究のための前立腺に前立腺癌細胞の例えば、注射）の適切な位置に同所性腫瘍細胞の注射を伴う。次いで、細胞を、原発腫瘍を形成し、自発的に、骨、肺、およびリンパ節などの二次部位に転移する時間が与えられる。でこれに対し、実験的転移モデルは、（特定の場所に細胞を標的とする尾静脈や心臓内注射を介してなどして ）血流への腫瘍細胞の直接注入を含んでいるため、二次的な器官22に血管内および普及の初期段階をスキップします。これまでのin vivoモデル系においてCTC解析の大部分は、フローサイトメトリーベース23又はヒト適合CTCベースの技術（ 例えば AdnaTest）24のいずれかを用いて行われた。有用ではあるが、これらの技術はいずれも、適切にゴールドスタンダードのCSSを使用して、CTCの列挙を反映していない。結果は、匹敵するであろうように、臨床承認、標準化された性質、及びCSSの広範な使用に基づいて、 インビボためのCTC捕捉および検出技術の開発が同等の試料調製、処理、および識別基準を利用してモデリングが有利で ​​あろう患者試料から得られた。しかしながら、ボリュームREQに準備器具のuirementsは、この自動化されたプラットフォームを使用して少量の血液を処理することは不可能である。イリアーヌらのほかに、これまでの研究25は、マウス上皮細胞の試料の汚染（標準、CTCの定義を満たす[のEpCAM + CK + DAPI + CD45が- ]）ことを実証しています。、マウス扁平上皮細胞の誤分類につながる可能性CTCの。これらの問題のマニュアルを単離操作と組み合わせたCSSのCTCキット試薬​​の利用が開発されたことができようになった技術に対処するために。アッセイのFITC標識ヒト白血球抗原（HLA）抗体の添加は、ヒト腫瘍細胞がマウス扁平上皮細胞と区別することを可能にする。 この原稿がdiscrepan含め遭遇する可能性がある患者の血液サンプルと共通の落とし穴を、処理するための商業的に開発された標準、および最適化されたCSSのプロトコルを記述CTCの誤分類エラーが発生する可能性のT項目。また、収集したCTCのユーザ定義のタンパク質の特性を調べるためのCSSアッセイのカスタマイズおよび転移の前臨床マウスモデルにおいて少量の血液からのCTCの濃縮および検出を可能に匹敵するように適合CSS技術が記載されている。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD44-FITC</td><td>BD ファーミゲン 555478</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD44-PE</td><td>BD ファーミゲン</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>結合一次抗体希釈剤</td><td>ライカ</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave Preservative Tubes</td><td>Veridex</td><td>952820 (20 pack) 79100005 (100 pack)</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC Control Kit</td><td>Veridex</td><td>7900003</td> CellSearch CTC Kit Veridex 7900001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC Control Kit</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC Kit</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Buffer</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td><td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro;lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000&micro;l ピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm フローチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l ゲルローディングチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 in 使い捨てパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛細血管採血管 (EDTA)</td><td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Analyzer II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>マグネストと検証軟骨を含む</td></tr><tr><td>CellSearch AutoPrep System</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect Magnet&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズMAG997</td><td></td></tr><tr><td>小型ラテックス電球</td><td>VWR82024-550</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（ctc）アッセイの適応

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

癌関連死の大半は、転移性疾患の発症に続いて起こる。この非常に致命的な病気のステージは循環腫瘍細胞（CTCの）の存在と関連している。これらの稀な細胞は、転移性乳癌、前立腺癌、および結腸直腸癌における臨床的に重要であることが実証されている。臨床のCTC検出および計数の現在のゴールドスタンダードは、FDA-クリアCellSearchシステム（CSS）である。この原稿は、標準を使用して、このプラットフォームが利用する標準プロトコルだけでなく、タンパク質の患者CTCの特性評価およびCTCは、血液の非常に低いボリュームをキャプチャするための比較可能なプロトコルのためのユーザー定義のマーカーの最適化の詳細な処理を記述する二つの追加適応のプロトコルの概要を説明転移のin vivoでの前臨床マウスモデルで研究するためのCSSの試薬 ​​。また、健康なドナーの血液との間のCTCの品質の違いは、患者の血液SAMPに対する組織培養由来の細胞をスパイクレスが強調表示されます。最後に、CTCの誤分類エラーにつながることができるいくつかの一般的な矛盾の項目が概説されている。まとめると、これらのプロトコルは、転移およびCTCのに関する前臨床および臨床研究に興味を持って、このプラットフォームのユーザーにとって有益なリソースを提供します。

標準CTC列挙アッセイ CSSの感度および特異性は、文献に記載されている。しかし、同等のCTCの回収を検証するために、スパイク（1,000たLNCaPヒト前立腺癌細胞）および健常ドナー由来のスパイクしていないヒトの血液サンプルは、標準的なCSSCTCプロトコルを使用して、CSSで処理した。予想されるように、スパイクしていないサンプルは、0.00±0.00％CTCの自由だった、とCTCの回収は、添加サンプル（図1A）のために86.9±4.71パーセントであることが実証された。スパイクサンプルから得られたCSSのギャラリー画像が最適な品質のものであり、CTCのは、非のCTCとの鑑別が容易であった。癌患者から得られた試料を処理する際しかしながら、CTCの同定は、多くの細胞のサイズが小さく現れると非CTCを（図1B）から容易に区別未満であると、わずかにより困難である。また、イベントの患者サンプルをレビュー6カテゴリが識別する、だった一般的にレビュー（図1C）との間に矛盾項目だったエド。これらの6...

循環腫瘍細胞（CTCの）は、いくつかの転移性癌において予後である。この原稿は、ゴールドスタンダードCellSearchシステム（CSS）CTC列挙プラットフォームについて説明し、一般的な誤分類のエラーを強調しています。さらに、2つの適合プロトコルはこの技術を用いた転移の前臨床マウスモデルでのCTCおよびCTC列挙のユーザ定義のマーカーの特徴付けのために記載されている。

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

本実験では、ヒトおよびマウスのゼノグラフト血液検体から、循環腫瘍細胞を高感度に検出、計数、および特性解析することを目的としています。まず、ヒトまたはがんマウスモデルから血液検体を採取し、EpCAM陽性細胞のポジティブセレクションを用いて、混入した白血球の中からCTCを濃縮します。次に、CTCと白血球を分染することで、CTCを同定し、その数を計測します。これらの希少な循環腫瘍細胞について、研究室で目的の分子特性解析を行い、臨床におけるがん患者への標的療法の選択に役立てます。CellSearchシステムを用いて得られた結果は、CTC解析がヒトおよびマウス異種移植片の血液サンプルの両方で効果的に実施できることを示しています。CellSearchシステム上でユーザー定義のCTC特性解析プロトコルをさらに開発することで、最終的に患者への標的療法の選択に寄与することが期待されます。さらに、マウス異種移植片での利用に適応させた同等のCTCアッセイにより、これらの細胞の基礎生物学に関する理解が深まります。CTC保存チューブから血液サンプルを7.5 milliliters採取し、処理チューブにゆっくりと分注します。各血液サンプルに6.5 millilitersの希釈バッファーを加えます。5回反転させて混合し、800 ×gで10分間遠心分離します。コントロール試料の調製では、ブレーキをオフにした状態で、バイアルを5秒間穏やかにボルテックスし、5回反転させて混合します。次に、逆さまにした処理チューブでキャップトップを取り除き、素早い動作でサンプルを移します。サンプルの転送量を最大にするため、コントロールバイアルの側面を軽く弾きます。液体が漏れないように注意しながら、逆さまにしたコントロールバイアルを慎重に取り出します。バイアルと蓋に残っている内容物を回収し、処理チューブに静かに加えます。前処理装置の画面指示に従い、処理を行うため、すべてのコントロールサンプルおよび患者サンプルをシステムにロードします。次に、前処理装置の画面指示に従い、すべてのサンプルをシステムからアンロードします。その後、各磁性デバイスカートリッジのキャップを緩く締め、軽く叩いて端にある気泡を除去します。その後、カートリッジのキャップをしっかりと閉め、磁気装置を水平に置き、暗所で少なくとも20分間インキュベートします。分析装置の電源を入れ、ランプを初期化します。システム検証用カートリッジを分析装置にロードします。QCテストタブを選択し、画面上の指示に従って必要な品質管理措置を実施します。次に、分析装置にサンプルをロードし、患者テストタブを選択します。[スタート]をクリックしてサンプルのスキャンを開始します。方向キーを使用して、必要に応じてすべてのエッジを調整します。その後、[accept]を選択します。ユーザー定義マーカーを調製するには、目的の抗体をbond一次抗体希釈液で希釈します。マーカー試薬カップを試薬カートリッジのポジション1に配置し、カートリッジをcell searchシステムにロードして、カスタムマーカーの添加を有効にします。調製装置で指示が表示されたら、ユーザー定義アッセイを選択します。マーカー名を入力し、保存を選択してください。サンプルの処理が完了したら、分析装置にサンプルをロードし、セットアップタブを選択します。ZIチャネルを初期化するには、テストプロトコルセクションのキットIDでcell search CTCを選択します。このメニューからCTC researchを選択してください。編集ボタンをクリックし、露光時間を任意に設定します。1 mLのEDTA血球保存管に50 µL以上のマウス血液を採取し、凝固を防ぐため転倒混和します。CTC濃縮を行う場合は、全血50 µL相当量をフローサイトメトリー用チューブに移します。各サンプルに500 µLの希釈バッファーを加えます。チューブの側面に付着した血液を洗い流した後、anti chem thorough fluidを緩やかにボルテックスし、各サンプルに25 µLずつ加えます。また、キャプチャー増強試薬を25 µL加えます。サンプルを緩やかにボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。次に、サンプルチューブをマグネットに10分間置きます。マグネットに接しているチューブ壁面に触れないように注意して残液を吸引して廃棄し、サンプルチューブをマグネットから取り出して、核酸染料50 µL、染色試薬50 µL、anti-US CD 45 APC 1.5 µL、anti-human HLA LOR 4 88 5.0 µL、および透過試薬100 µLを添加します。穏やかにボルテックスし、暗所で20分間インキュベートします。室温で操作します。次に、500 µLの希釈バッファーを加え、ボルテックスします。サンプルチューブを磁石に静かに設置し、10分間静置します。残液を慎重に吸引して廃棄します。次に、ペレットを350 µLの希釈バッファーで再懸濁し、ボルテックスで穏やかに混合します。サンプルをゲルロード用チップで吸引し、カートリッジの底部から開始して、サンプルを分注しながらゆっくりとチップを引き上げることで、磁気デバイスに転送します。滅菌済みの22ゲージ針を用いて気泡を除去した後、カートリッジのキャップをしっかりと締め、磁気デバイスを水平に置き、暗所で少なくとも10分間インキュベートします。サンプルを分析装置にセットし、セットアップタブを選択します。既存のデータを消去するには、サンプルフォーマットボタンをクリックしてください。キットIDとしてcell search CTCを、テストプロトコルとしてCTC researchを選択します。このメニューから、適切な露光時間が選択されていることを確認してください。患者テストタブを選択し、編集を選択します。サンプル情報を入力するには、指示に従って残りの必要事項を入力してください。その後、サンプル情報を保存し、「start」をクリックして検証します。循環腫瘍細胞の回収において、スパイクしたヒト前立腺がん細胞およびスパイクしていない健康なボランティアドナーからのヒト血液サンプルを、標準的なCellSearch CTCプロトコルを用いてCellSearchシステムで処理しました。予想通り、CTCを添加していないサンプルからは循環腫瘍細胞は検出されませんでした。添加サンプルのCTC回収率は86.9%でした。添加サンプルから得られたこれらのセルサーチギャラリー画像は最適な品質であり、CTCを非CTCと容易に区別することが可能です。がん患者のサンプルからのCTCの同定はわずかに困難であり、多くの細胞がより小さく見え、非CTCとの区別がつきにくくなります。さらに、患者サンプルの検討において、判定者の間で不一致が生じやすい項目として、以下の6つのイベントカテゴリが挙げられました。これらは、微小なイベント、ZI陽性イベント、サイトケラチンの染まりが弱いまたは斑状の染色、ピクセル化した画像、サイトケラチンのブリードスルー、および大きなまたは重複しないdpiです。がん幹細胞マーカーであるCD 44に対して98 4%の陽性率を示すことが知られている細胞株を用いてユーザー定義マーカーを開発する際は、CTCキットの選択を考慮する必要があります。FCIベースのCTCキットでは、CTCの69.3%しかCD 44陽性と分類されませんでした。しかし、PEベースのCX Cキットを使用すると、CTCの98.8%がCD 44陽性と分類されました。ユーザー定義マーカーを適切に最適化するには、アッセイの感度と特異性を確保するために、目的のマーカーに対する高抗原密度、低抗原密度、および陰性細胞株を用いた検証が必要です。本実験では、適合させたマウス細胞探索プロトコルの感度と特異性を評価します。予想通り、非スパイク検体では両方の分析法およびCTC回収においてCTCは検出されませんでした。適合させたマウス用キットの使用と標準的な自動システムの使用は同等であり、手動のマウス適合プロトコルを用いて得られた画像は、標準的な自動手法を用いて観察された画像と差はありませんでした。本アッセイにHLA fits Eを添加することで、ヒト腫瘍細胞をマウス扁平上皮細胞から容易に区別することが可能になり、スパイクしたマウス血液サンプルの段階希釈、および予想細胞数と回収細胞数の相関を確認できます。この手法が、少数のCTCを単離するための標準的なCSSプロトコルと同等の感度を持つことを確認してください。このビデオを視聴することで、ヒトおよびマウスのキセノグラフト血液サンプルの両方から、自動および手動でCTC濃縮を行う方法について十分に理解できるはずです。さらに、セルサーチシステムと組み合わせて使用するためのCTC特性評価プロトコルの設計および最適化に必要な手順について、より深い理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。...

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

このビデオでは、非小細胞肺がん患者サンプル中の循環腫瘍細胞上のバイオマーカーを特徴付ける技術であるCirculating Tumor...

CTC免疫蛍光アッセイ:循環腫瘍細胞の特性評価技術

循環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍の転移において重要な役割を果たすことが示されています。ここでは、肝細胞癌(HCC)転移の同系マウス腫瘍モデルの全血からCTCを単離および増殖する方法について説明する。...

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。...

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs...

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。...

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。...

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場...

汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

本プロトコルは、前処理された腫瘍細胞との同種共培養システムにおけるヒトT細胞刺激の ex vivo...

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ 循環腫瘍細胞（CTC）の検出・計数・特性評価法。CellSearchシステムを用いてヒトおよびマウス異種移植血液サンプルからCTCを検出し、標的治療薬選択に有用な分子特性解析プロトコルを確立する方法です。

臨床および前臨床研究用途のための半自動循環腫瘍細胞（CTC）アッセイの適応

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