Name: 術後免疫抑制のメカニズムを探索し、新しい周術期免疫療法を評価するための手術侵襲のマウス腫瘍モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学ぶマウス腫瘍モデルを用いた周術期免疫療法の評価方法。手術侵襲による免疫抑制と転移増悪のメカニズムを探索し、オncoliticウイルス療法の効果を検証する技術を解説します。

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著者は、あなたが動物の手術の支援のためにキム·イェーツ、アイリーン·フランクリン、とレベッカTjepkema（動物管理獣医サービス、オタワ大学）に感謝したい。リー·ファタイはフォン·ド·RECHERCHEサンテケベックフェローシップでサポートされています。リーダーの機会グラントはレベッカアウアーに - この作品は、カナダの癌協会総合研究所イノベーション·グラント、オンタリオ州省の研究開発の初期の研究者賞、イノベーションのためのカナダの財団から操作する補助金によって支えられている。

1。 in vitroで 4T1腫瘍細胞を維持する<ol><li> 10cmの組織培養プレート中の完全DMEMで培養未修飾4T1腫瘍細胞（DMEM、10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン）。 37°C、5％CO 2組織培養インキュベーター中でインキュベートする。 </li><li>スプリット培養2〜3回/週。最適な生存細胞を維持するために80％コンフルエンスを超えてはならない。培養は&gt; 1ヶ月、in vitroで継代された場合には、これは、以前の継代した細胞よりも悪性度や転移の可能性を減少させるように、生体内の原発腫瘍を確立するための細胞を使用しないでください。 </li></ol> 2。注射用収穫4T1腫瘍細胞<ol><li>パスツールピペットを用いて組織培養プレートから吸引し、培養培地。 </li><li> 2ミリリットルのEDTAを含む1Xの滅菌PBS 10ミリリットルを追加します。 PBS溶液を37℃で5-7分間、5％CO 2組織培養インキュベーターにてプレートでインキュベートしましょう。 </li><li>プレートから収穫PBS溶液、R溶液を用いて、プレート2〜3倍をinsing、15ミリリットルコニカルチューブに移す。 </li><li>ベンチトップ遠心分離機で4℃、500×gで5分間、遠心細胞。 </li><li>上清を吸引し、無血清DMEM中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>細胞カウンターを用いて細胞濃度を決定する。 </li><li> 1×10 6 cells/500に無血清培地で細胞を希釈して氷上に注入し、場所細胞についてμL（1×10 5 cells/50μL（。 </li></ol> 3。 4T1腫瘍細胞をマウスに注射実行されたすべての動物実験は、同所注射または腫瘍移植を受けたすべての動物のためのオタワの勧告の大学の動物ケア獣医サービスの施設のガイドラインに従った。 <ol><li>疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。 </li><li> injecの期間中に2.5％イソフルランを使用して麻酔下でマウスを誘導し、維持するTiONから。反射反応を検出するために、マウスの足蹠ピンチ。何も検出されない場合、有効な麻酔レベルが達成される。無菌眼用潤滑剤は、次いで、角膜の乾燥を防ぐために適用される。 </li><li> 30 Gをロード½細胞懸濁液を正確に50μLの「超微細」注射器に。すべての気泡が気泡を取り除くために、注射器の側面をタップして、注射器の列から削除されていることを確認してください。 </li><li>腹側を上に（麻酔下）にマウスを置きます。 </li><li>アルコール綿を使用した注射部位をきれいにし、第4回乳房脂肪パッドに水平に直接針を導入し、ゆっくりとシリンジ容量を分注する。 </li><li>すべての可能な漏れをきれいに綿棒を使用してください。 </li><li>マウスは麻酔から回復することができます。 </li><li> 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。 </li></ol> 4。 BALB / cマウスベアリング4T1腫瘍における周術期治療を施す<ol><li> 13日後に腫瘍細胞注射では、外部のキャリパーを使用して、原発腫瘍を測定します。ノギスでの最大の長径（長さ）および最大横径（幅）を測定します。修飾された楕円の式は、腫瘍体積（ 腫瘍体積 = 1/2（ 長さ Ã 幅 2）を計算するために使用される</li><li> 13日後に腫瘍細胞注射では、原発腫瘍が約1cm 3を測定する必要があります。この腫瘍測定が達成されたときに、周術期治療試薬を調製する。 </li><li>腫瘍溶解性ウイルスは、1が周術期に管理することができます1の革新的な治療である。注射の前に氷上で1×滅菌PBS、所定の位置に腫瘍溶解性ウイルス（1×10 9 PFU / 1ミリリットル）を準備します。 </li><li>安全で場所をマウス静脈内尾部静脈注射のために拘束。 </li><li>穏やかに外側尾静脈を可視化するために温かい水道水でマウス尾を加熱する。 </li><li> 27 Gをロード½ &quot;インスリンシリンジ」の腫瘍溶解性ウイルス療法の正確100μlで。すべての気泡がシリンジカラムから除去されていることを確認。 </li><li>外側尾静脈のいずれかに1×10 8 PFU/100μL/マウスでマウスを注入。針が適切に横静脈に挿入されている場合は、注射器を押し下げたときに、全く抵抗が感じられてはならない。 </li></ol> 5。原発腫瘍の切除や腹部、左腎摘出を完了<ol><li> 14日後に腫瘍細胞注射で、オタワ動物管理獣医サービスの大学のプロトコルを承認し、次のルーチン周術期のケアを開始します。疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。誘導し、手術中に2.5％イソフルランを使用して麻酔を維持。 UNDER条件を滅菌し、無菌手術器具を使用して、手術部位を剃毛し、スクラブされています。動物は、手術前に皮下流体および眼の潤滑剤を投与する。 </li><li>穏やかに完全に乳房脂肪体から原発4T1腫瘍を除去するために小さな切開（長さ1〜2センチ）を作る。 </li><li> 2月3日9ミリメートルのステープルで切開を閉じます。 </li><li>マウスの腹側正中線に沿って皮膚および皮下層を介して切断することにより、腹部を公開します。 </li><li>マウスの腹膜にアクセスするための白線（3-4 CM）で切開する。 </li><li>側に覆って腸を動かすことで、腹部の左側内側を公開します。腸を生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで湿った保たれていることを確認します。 </li><li>外科鉗子の鈍ペアを使用して、静かに左腎臓を把握する。 </li><li>ループに縛ら3-0ワックスコーティングされた編組絹縫合糸を使用して、左腎臓の門を連結し、3外科結び目で固定します。 surgiで左腎臓を削除CALはさみ。 </li><li>十分な止血が達成されることを保証するために慎重に縫​​合タイを点検します。 </li><li> 9ミリメートルのステープルを使用して5-0編組吸収性、そして定番スキン層を使用した連続ループ縫合糸で皮下層を閉じます。 5.10への5.2は10分/動物を必要としなければならない手順。 </li><li> 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。 </li></ol> 6。安楽死マウスとその処理と肺腫瘍負荷の定量化<ol><li> 4T1腫瘍注入後28日目に、オタワ大学の動物管理獣医サービスのプロトコルに従ってマウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールでマウスを下にスプレーします。 </li><li>ちょうど肋骨の下にはさみで最初の切開を行います。 </li><li>マウスの胸腔の腹側正中線に沿って皮膚と皮下層を切断することで胸郭を公開します。 </li><li> NEまでそれぞれの側の皮膚や組織を通って横方向の切開を作るマウスのCK。 </li><li>肺の上下に結合組織を離れて切り取るながら優しく肺をつかんで、肺を解剖する。 </li><li>予浸を10％緩衝化ホルマリン中に置き、次いで、残留血液を除去し、冷PBSで肺を抽出した。 </li><li>腫瘍転移の評価のための各肺を撮影。腫瘍量の定量化のために肺の重量を量る。 </li></ol>

<ol><li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+postoperative+metastatic+disease+by+inhibiting+surgery-induced+dysfunction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preventing postoperative metastatic disease by inhibiting surgery-induced dysfunction in natural killer cells.</a> Cancer Res. 73, 97-107 (2013).</li>
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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

外科的切除は局所的な固形悪性腫瘍患者のための治療の中心です。でも、完全切除して、多くの患者は、転移、再発を開発し、最終的には自分の病気で死亡する。手術直後の期間は術後、NK細胞の抑制によって大部分が変調されたがんの転移の形成、、、のための理想的な環境を提供します。これにもかかわらず、それはほとんど無視されている治療ウインドウのまま。 術後の転移を防ぐことを目的とした標準的な周術期の抗癌治療は現在ありません。現在の課題は、それによって微小転移疾患の確立を防止し、周術期にNK細胞を活性化します安全かつ有望な治療法を特定することである。これらの治療法は、厳密に前臨床動物モデルでの安全性と有効性について特徴づけした後、考え込むように設計された臨床試験に翻訳されなければならない。 原発比率手術侵襲のマウス腫瘍モデルを開発するnaleは、手術後の免疫抑制および転移拡散のメカニズムを探索し、原発腫瘍を除去する手術を受けている癌患者における将来の使用のための潜在的に革新的な免疫療法を評価することである。この目標を達成するために、外科的ストレスと結合4T1マウス乳癌モデルが開発された。 4T1細胞株は、マウス「乳癌」であるが、この細胞株を使用する理由は、私たちは現実的な癌モデルにおける手術侵襲の影響を評価することを可能にする自発的転移の再現性である。この文脈において、悪性腫瘍の実際の起源は、転移の可能性および腫瘍生物学よりも重要である。我々のモデルの第二の重要なコンポーネントは、密接に人間のがんの手術に似ている動物の外科的処置の開発である。それが1cm 3に達した後、この動物の外科的ストレスモデルにおいて、一次4T1乳房腫瘍が切除される。なぜならヒト患者における癌の手術は、「外科的ストレス」治療群で開いている腹部腎摘出術がさらに行われ、有意な免疫抑制を伴う。それは、ヒトにおいて、より従来型の腫瘍切除に匹敵するように、完全な左腎摘出術の侵襲的な性質は、結腸直腸癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌および食道の手術を含む固体悪性腫瘍に対する外科的治療の多くのタイプに非常に匹敵するがん。加えて、我々は開腹+腎摘出による手術時に発生する重大な生理学的変化は、十分にほとんどの固形悪性腫瘍に対する侵襲的手術後に発生する圧倒的な生理学的変化を再現することを主張するだろう。過大な手術侵襲と死亡率、麻酔や手術時間につながり、手術中に体温を維持できた周術期の要因を制御するには、正確に定義されている。すべてのこれらのパラメータを正確に実行されますDは、ヒト癌患者におけるルーチン周術期のケアをミラーリングする私たちの手術プロトコルで定義されている。 周術期治療のタイミングは、周術期の救助·モデルに追加の重要なコンポーネントです。 4T1腫瘍を有するマウスは、以前にインフルエンザワクチンの3レジメンで治療されています：ネオアジュバント（手術前に5日間与えられた）、周術期（手術の同じ日に与えられた）、手術の日に与えられた周術+マルチドーズは（2に続く追加投与）は5日間隔で与えられた。驚くべきことに、ワクチン治療のすべての3つのモードが大幅に肺転移22減少した。しかし、インフルエンザワクチンは、転移の最も効果的に低減する単回用量として手術時に投与。まとめると、これらの実験は、転移過程に介入する狭い治療ウィンドウとして即時周術期の重要性を強調している。 このようなoncolyなどの革新的な免疫療法の周術期の使用チックウイルスおよびワクチンは、排他的に我々の研究グループに限られていた。我々は、新規腫瘍溶解性のORFとワクシニアウイルスの周術期投与が動物モデル1における手術後のNK細胞抑制を逆にすることができますことを初めて実証した。さらに重要なことは、免疫機能のこの救済は、転移の術後の形成の減少と相関している。ヒトの研究では、術後の癌の手術患者は、NK細胞の細胞傷害性が減少したと周術期のOVが著しく癌患者1にNK細胞活性を増大させる。市販の予防ワクチンを用いて、我々は、周術期のインフルエンザワクチンの投与は、有意に腫瘍転移を低減し、前臨床腫瘍モデルにおけるNK細胞の細胞障害性を向上させることを実証した。ヒトの研究において、インフルエンザワクチンは、有意に22健康なヒトのドナーおよび癌の手術患者におけるNK細胞活性を増強した。 多くのアプローチがCANCを低減するために使用されている化学療法、放射線が、これらの治療を含む、ERの再発は、通常（ネオアジュバント）の前または（アジュバント）手術後数週間から数ヶ月投与する。この分野の研究は、手術直後の期間が長期腫瘍再発率を決定する上で非常に重要であることを示している。そのため、この重要な期間中に免疫療法の形で臨床介入は、かなり長期的なメリットを持っていることがあります。自発的な肺転移および外科的ストレスのマウスモデルを用いた我々の研究は、新しい治療法を探求し、癌手術患者において周術期の免疫抑制を防止し、それによって、癌の再発率を低下させる可能性を決定するためのユニークな機会を提供する。

手術は固形腫瘍の治癒的癌治療における重要なコンポーネントですが、完全切除にもかかわらず、多くの患者は、転移、再発を開発し、最終的には自分の病気で死亡する。ますます、術後期間は、血液凝固、増殖因子の放出、及び免疫抑制を含む手術生理的ストレス応答の結果として、転移の発生のための臨界時間として認識される。われわれのグループ1,2およびその他3-5は手術直後の期間は転移の形成のために独自に影響を受けやすい時期であることを示した。 手術の前転移性の影響に関与する重要なメカニズムの一つは、ナチュラルキラー（NK）細胞が1-3の術後機能障害である。 NK細胞は、腫瘍増殖および転移6の制御に関与する先天性免疫系の細胞傷害性リンパ球である。手術後のNK細胞の機能不全iは実証されているNヒト患者1,7-9および動物モデル1,10,11両方。ヒトの研究において、周術期の間に低NK活性は癌の再発および死亡率が高い15,16に関連している術後のNK細胞の抑制は、自発的な注入された1,11-14転移の動物モデルにおいて増大した転移と相関する。 それにもかかわらず、特に直後のがんの手術を発生前転移性の変化への対応なく癌治療は現在ありません。周術期は、転移プロセスに介入するには機会の治療ウィンドウを表す。このような細胞毒性化学療法などの伝統的な癌治療法は、大手術17から回復した患者に投与されるにはあまりに毒性が考えられるが、免疫療法は、周術期投与のための理想的な候補である。組換えIL-2およびIFN-Î³の周術期の使用は私に研究されてきた術後のNK細胞の抑制を防ぎ、無増悪生存期間18〜21を改善する可能性を実証するN初期段階の臨床試験。残念ながら、今後の発展には、大手術17と組み合わせて、この非特異的なサイトカイン療法の忍容性によって妨げられてきた。ウイルスはまた、NK細胞の強力な非特異的活性化剤である。我々の研究は、以前にこのような新規の抗がん腫瘍溶解性ウイルス（OV）、およびインフルエンザワクチンのようなウイルスワクチンを、非複製などに複製するウイルスの術前投与は、手術により誘導されるNK細胞の機能不全を阻害し、転移性疾患1,22を減衰させることができることを実証しました。 このホワイトペーパーで説明外科モデルは、手術後の腫瘍細胞の広がりと成長に関与するメカニズムの理解を促進し、私たちは周術期に投与することができる新規な標的療法を探索することができました。この目標を達成するために、動物手術侵襲と自然転移札束開発モデル。自発的に肺特に複数の遠隔部位に原発乳腺から転移することが可能である - このモデルは、マウス乳癌腫瘍（4T1 BALB / c）に利用する。 0日目に、乳癌細胞をマウスの乳房脂肪パッドに移植される。 14日目に腫瘍移植後に、原発乳腺腫瘍の完全切除が全ての動物で行われる。動物のサブセットは、腹部の腎摘出の形で追加的な手術侵襲を受ける。 28日目​​に、外科的肺腫瘍結節を強調し、比較しない手術対照マウスは、単離されず、定量化される。がんや手術のこの動物モデルにおいて、癌転移の手術の影響が検討されていると、ウイルスに基づいた免疫刺激剤を複製し、複製しないなど、革新的な免疫療法の周術期投与の有効性が初めてテストされています。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cell-Gro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>不活化ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Chiron, Guelph</td><td></td><td></td>RXN309968</tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター社</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>1/2 極細注射器</td><td>テルモ</td><td>30 G, SS05M3009</td><td></td></tr><tr><td>9 mm ステープルズ</td><td>ブレインツリー</td><td>ACS BX</td><td></td></tr><tr><td>5-0 吸収性編組縫合</td>糸 <td>Covidien</td><td>UL-202</td><td></td></tr><tr><td>3-0 ワックス編組シルク縫合糸</td><td>Covidien</td><td>S-194</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>フィッシャー</td><td>SF100-20</td><td></td></tr><tr><td>4T1 腫瘍細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c マウス</td><td>Charles Rivers Labs</td><td>社 コード:028</td><td></td></tr></tbody></table>

術後免疫抑制のメカニズムを探索し、新しい周術期免疫療法を評価するための手術侵襲のマウス腫瘍モデル

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

外科的切除は、ほとんどの癌患者のための不可欠な治療であるが、外科手術、免疫系における機能不全を誘導し、これは動物モデルおよび癌患者における転移性疾患の発症に関連している。我々のグループなどからの臨床前の仕事は、自然免疫機能、術後の期間に、特にNK細胞の深遠な抑制を実証しており、これは手術後の転移の強化発展に大きな役割を果たしている。比較的少数の動物試験および臨床試験は、癌手術の有害な影響を特徴付ける及び後進に焦点を当てている。自発的に転移性腫瘍および手術侵襲の厳密な動物モデルを使用して、肺転移の発生に対する癌の手術の向上が実証された。このモデルでは、4T1乳癌細胞をマウス乳腺脂肪パッドに移植される。 14日目に腫瘍移植後では、原発乳腺腫瘍の完全切除がperformeですすべての動物におけるD。動物のサブセットは、腹部の腎摘出の形で追加的な手術侵襲を受ける。 28日目​​に、肺腫瘍結節が定量化される。免疫療法はすぐに手術前に与えられた場合には、手術後に転移の発生を防ぐ免疫細胞の深遠な活性化が検出されました。 4T1乳房腫瘍の手術モデルは腫瘍転移に腹部の手術ストレスの影響のシミュレーションを可能にしている間、他の腫瘍タイプへの適用をテストする必要があります。現在の課題は、前臨床マウスモデルにおいて安全かつ有望な免疫療法を識別し、転移性疾患の再発を防止するために、癌手術患者に与えられる実行可能な周術期の治療にそれらを変換することである。

肺転移の劇的な強化をもたらし、外科的ストレスの再現性のマウスモデルが開発されている。一日に28ポスト4T1腫瘍接種（および14日後に腫瘍切除+ / - 腹部腎摘出）、肺転移のために収穫し、可視化した。手術は明らかに、肺の写真（ 図1A）、肺結節の列挙（ 図1B）及び肺重量（ 図1C）によって示されるように、未処理マウスと比較して肺転移の量を増加させる。腫瘍溶解性ウイルス不活化インフルエンザワクチンを複製術前投与は、がんの手術の前転移性の効果（ 図1A-C）を救う。 NK細胞は、ワクチン後の処理の転移の予防に媒介役割を果たしているかどうかを決定するために、NK細胞は、薬理学的に腫瘍転移モデルにおいて抗アシアロ-GM-1を用いて枯渇させた。 NKが存在しない場合には細胞は、我々は、周術期の免疫療法の治療効果の抑止（ 図2Aおよび2B）を観察した。このデータは、我々の外科的ストレスモデルにおける腫瘍転移の除去は、主としてNK細胞の腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの活性化およびその後のNK媒介性の腫瘍溶解を介して媒介されることを示唆している。さらに、腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの周術期の投与後のNK細胞機能を特徴付けるために、ex vivoでの NK細胞の死滅を評価した。手短に言えば、プールし、ソートDX5 + NK細胞は、外科的に強調し、対照マウスの脾細胞から単離した。これらは、ガンマカウンターで上清クロム放出を測定し比をターゲットに異なるエフェクターで、クロムラベルYAC-1標的細胞と4時間培養した。腫瘍溶解性ウイルスとINFLの周術期投与後のNK殺傷の有意​​な回復とともに、NK細胞の細胞傷害性の大幅な手術誘起欠陥uenzaワクチンは手術単独に比べて（ 図2Cおよび2D）が観察された。まとめると、これらの結果は、周術期のNK細胞の抑制が正常に処理し、転移性疾患の新規治療法と免疫刺激を低減することができることを実証している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> 図1。肺腫瘍の肺転移の手術誘発性増強に対する周術期治療としての抗癌腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの新規。代表肺の（A）の写真によって指示された処置群の28日目の4T1肺腫瘍転移の評価、（B）の列挙結節および（C）の肺の重み。データは3類似した実験の代表例であるN = 5-10/group（*、P = 0.01; ** P &lt;0.0001;<html> NS、有意ではない）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> 図2。外科的ストレスがNK細胞を損なうことによって、肺腫瘍転移を増加させる。 （A、B）における肺腫瘍転移の定量は、外科的に新規な周術期治療で処置したマウスを強調した（C、D）外科的により精製されたDX5 + NK細胞の能力を強調し、腫瘍細胞を殺すために、未処理の対照。 T比：示され、Eのための三重のウェルからクロム放出の - （SD + / - ）のデータは平均パーセントとして表示されます。データは、n = 4-5/group（; ** P &lt;0.005; NS、有意ではない*、P = 0.01）3類似した実験の代表である。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

手術侵襲のマウス腫瘍モデルは、術後の免疫抑制は、転移性疾患を促進する方法を探索することおよび免疫刺激周術期治療を評価するために使用される。

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

本手順の全体的な目的は、周術期に行われる免疫療法の、腫瘍および手術ストレスのマウスモデルにおける転移抑制効果を観察することである。まず、原発腫瘍を形成するために、マウスの乳腺脂肪パッドに4T1腫瘍細胞を注入する。がん手術の1日前である13日目に免疫療法を投与し、腫瘍細胞移植後14日目の術後転移性疾患を軽減させると仮説を立てている。原発腫瘍を切除し、次いで一部のマウスにおいて腹腔内腎摘出による追加の手術ストレスを加えます。最終ステップとして、すべてのマウスを安楽死させ、肺転移結節の数を定量します。最終的に、この自発的転移および手術ストレスのマウスモデルを用いて、周術期免疫療法の有益な効果を実証します。この手法は、大手術が免疫系にどのような影響を与え、その結果として術後の転移性疾患の形成にどう関与するのか、また、免疫療法を用いてこの影響をどのように軽減できるかといった、外科腫瘍学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手順のデモンストレーションは、Rebecca s 研究室のリサーチテクニシャンである Christiano 10 dusa が行います。腫瘍細胞の培養を準備します。まず、未改変の 41 腫瘍細胞を完全 DMEM 中で 10 centimeter の組織培養プレートに播種し、組織培養インキュベーター内で 37 °C、5% CO2 でインキュベートします。細胞のコンフルエンスが80%を超えないよう、必要に応じて週に2〜3回、培養細胞の継代（分割）を行ってください。細胞培養の開始から1か月以内に、組織培養プレートから培地を吸引し、腫瘍細胞の回収を開始します。2 mLのEDTAを含む1X滅菌PBSを10 mL加え、プレートを37°C、5% CO2で5〜7分間インキュベートします。その後、プレートからPBS溶液を除去し、プレートをPBSで2〜3回洗浄して、細胞を50 mLコニカルチューブに移します。次に、ベンチトップ遠心機を用いて、500 G、4 °Cで5分間、細胞を遠心分離します。上清を吸引した後、細胞ペレットを無血清DMEMで再懸濁します。次に、細胞計数器を用いて細胞濃度を測定し、無血清培地で細胞を1×10⁶ cells/500 µLに希釈し、手術の1時間前に氷上に置きます。疼痛管理のため、マウスにブプレノルフィン0.05 mg/kgを皮下注射します。2.5%イソフルランでマウスを麻酔した後、足底をつまんで麻酔レベルが十分であることを確認します。次に、30ゲージ・0.5インチの超極細シリンジに、腫瘍細胞懸濁液を正確に 50 µL 分充填します。シリンジの側面を軽く叩き、気泡を取り除きます。イソフルラン麻酔を継続しながら、マウスを腹側が上になるように手術台の上に置きます。次に、針を水平に、第4記憶脂肪体に直接挿入し、シリンジの内容物をゆっくりと注入します。注入の完了まで約1分かかります。注入後、漏れがある場合は綿棒で拭き取ってください。マウスをケージに戻す前に、麻酔から回復させます。細胞注入後13日目から2日間、8時間ごとにbuprenorphineを0.05 mg/kg皮下投与し、疼痛管理を継続します。外部カリパーを用いて原発腫瘍のサイズを測定します。ノギスを用いて、最大縦径（長さ）および最大横径（幅）を測定します。腫瘍体積の算出には修正楕円体式を用い、長さ×幅の2乗の2分の1として計算します。この時点で、原発腫瘍が約1立方センチメートルであると想定し、周術期治療薬剤として、本ケースでは1x滅菌PBSに懸濁した腫瘍溶解性ウイルスを準備しておきます。27ゲージ、0.5インチのインスリン用注射器に、腫瘍溶解性ウイルス療法の溶液を正確に100 µL充填します。注射器内からすべての気泡を除去してください。次に、マウスを拘束器に入れ、尾にアクセスできるようにします。ぬるま湯を用いて、尾部を緩やかに温めます。側尾静脈を可視化させ、側尾静脈を選択して腫瘍溶解性ウイルスを注入します。針が側尾静脈に適切に挿入されていれば、シリンジを押し込む際に抵抗が感じられないはずです。完了後、Postum細胞注入から14日後にマウスをケージに戻し、一晩静置します。疼痛管理のため、手術の1時間前にブプレノルフィンを0.05 mg/kgの用量で皮下投与し、2.5% ISOフルレインを用いて麻酔を導入および維持します。1〜2 cmの皮膚切開を加え、乳腺脂肪体からprimary four T one腫瘍全体を慎重に取り出します。腫瘍および付着した破片は、一塊として取り出される必要があります。腫瘍をホルマリンに保存し、後日免疫組織化学的解析に用います。腫瘍の摘出後、切開部位を9 mmのステープル2〜3個で閉じます。次のステップは、マウスの一部に主要な手術を行うことです。皮膚および皮下層に沿って腹側正中切開を行います。次に、腹膜に到達させるため、線状の肘の部分を3〜4 cm切開します。続いて、上層にある腸管を片側に寄せ、腹腔内の左側を露出させます。生理食塩水に浸した滅菌ガーゼを用いて、腸管を湿らせたままにします。次に、鈍端の外科用鉗子を使用して、左腎臓を優しく把持します。その後、ループ状に結んだ3.0のワックスコーティング編み絹縫合糸を用いて、左腎臓の腎門を結紮します。3つの外科結紮で縫合糸を固定します。次に、外科用ハサミで左腎臓を摘出します。止血が十分に完了しているか、結紮部位を慎重に確認してください。次に、5-0編み込み吸収性縫合糸を用いて、皮下層を連続縫合で閉じます。その後、9 mmのステープラーを用いて皮膚層を固定します。腎摘出術は、1匹あたり10分で完了するようにしてください。回復後、動物をケージに戻し、0.05 mg/kgのブプレノルフィンを8時間ごとに皮下投与して2日間疼痛管理を継続します。4つのT1腫瘍注入から28日後にマウスを安楽死させ、70% ethanolをスプレーします。肋骨直下にハサミで最初の切開を加え、肺の摘出を開始します。胸腔の腹側正中線に沿って皮膚と皮下層を切開し、胸部を露出させます。次に、皮膚と組織を通り、両側から頸部まで側切開を加えます。その後、肺をそっと掴みながら、結合組織を切り離して肺を完全に遊離させます。分岐点より上の気管を切断すると、左右の肺葉が繋がった状態で保持されます。次に、抽出した肺を冷PBSに浸して残留血液を取り除き、10%緩衝ホルマリンに浸します。最後に、肺を撮影して腫瘍転移を評価し、重量を測定して腫瘍負荷量を定量化します。4つのT1腫瘍を切除して14日後、肺を採取し、転移を確認しました。ここに、腹部腎切除を行わなかったマウスの肺を示します。いくつかの転移腫瘍が確認できます。対照的に、腫瘍切除直後に外科的腎摘除術を行ったところ、肺転移の数が目に見えて増加しました。この写真は、腫瘍切除および腎摘除後にオンコリティックウイルス治療を受けたマウスの肺を示しており、こちらに示されているのは、腫瘍切除および腎摘除後にインフルエンザワクチン治療を受けたマウスの肺です。これらの各カテゴリーにおける肺腫瘍結節数を数えると、手術を行わなかったマウスや術前に治療的介入を行ったマウスと比較して、腎摘除術を受けたマウスでは肺転移数が明らかに増加していることがわかります。腎摘除術を行い、術前治療を施さなかったマウスの肺は、他の試験カテゴリーよりも有意に重量が重くなっています。したがって、複製能を持つ腫瘍溶解性ウイルスと不活化インフルエンザワクチンの術前投与は、腫瘍切除後の大手術による前転移促進効果を著しく抑制しました。これらのグラフは、NK細胞数が正常なマウスと、anti-Asialo GM1を用いてNK細胞を薬理学的に除去したマウスにおける肺腫瘍数を示しています。NK細胞除去マウスでは、周術期の腫瘍溶解性ウイルスまたはインフルエンザワクチン免疫療法の治療効果が低下していました。この結果は、ワクチン投与後の転移抑制においてNK細胞が介在的な役割を果たしていることを示唆しています。NK細胞の機能をさらに詳細に検討するため、外科的ストレス群および未処理のコントロール群から精製したDX5陽性細胞をYAK-1標的細胞とともに共培養し、ex vivoでのNK細胞による殺傷能を評価しました。黒の実線は未処理マウス由来のNK細胞の殺傷能を、黒の点線は外科的ストレス群マウス由来のNK細胞の殺傷能を示しています。黒の実線から黒の点線への下方へのシフトで示される細胞毒性率の低下は、手術後のマウスにおけるNK細胞の細胞毒性機能の欠損を実証しています。グレーの実線は、手術は行わず、腫瘍溶解性ウイルスまたはインフルエンザワクチンのいずれかの免疫療法を受けたマウスのNK細胞による殺傷能を示しています。グレーの点線は、周術期免疫療法と手術の両方を受けたマウスのNK細胞による殺傷能を示しています。灰色実線から灰色点線への下方シフトによって示される細胞毒性率の低下は、周術期免疫療法を受けたにもかかわらず、手術後のマウスにおいてNK細胞の細胞毒性機能に欠損があることを示しています。最も重要な点は、灰色点線が依然として黒色点線よりも大幅に高いことです。このことは、周術期免疫療法によって、手術誘発性のNK細胞細胞毒性機能不全を回復させることが可能である可能性を示唆しています。このビデオを視聴することで、原発性腫瘍を形成させることにより、自然転移および手術ストレスの動物モデルを作製する方法について深く理解することができます。原発腫瘍を切除し、腎摘出によってさらなる手術ストレスを誘発させ、エンドポイントで肺転移腫瘍結節を評価します。さらに、このモデルを用いて、手術が自然免疫系に及ぼす抑制効果や、免疫療法がこの効果を反転させる能力をどのように研究できるかについても理解することができます。

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