Name: 脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ脂質ナノチューブ上の血液凝固第VIII因子の螺旋構造解析法。低温電子顕微鏡とヘリカル3D再構成アルゴリズムを組み合わせて膜結合タンパク質の構造を解明し、構造生物学と血液凝固研究の新たな知見を提供します。

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10SDG3500034とUTMB-NCB SSMに資金を起動します。この作品は、米国心臓協会から全国科学者開発助成金によってサポートされています。著者は、シーリーUTMBでの構造生物学研究センター（AT低温電子顕微鏡および科学計算施設を認める<a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ）だけでなく、博士。 2次元と3次元の螺旋再構成アルゴリズムのヘルプのためのスティーブLudtkeとエドEgelman。

1。サンプルの調製<ol><li> HBS-CA緩衝液に対する緩衝為替ヒトFVIII-BDD 14とブタFVIII-BDD 15（20のHEPES、150mMのNaCl、5mMのCaCl 2、pH値= 7.4）および1.2 mg / mlのに集中する。 -80℃でタンパク質溶液を保持</li><li> 1：04 W /クロロホルム中w比でガラクトシルセラミド（GC）およびホスファチジルセリン（PS）を混合することによって、脂質​​ナノチューブ（LNT）を準備します。アルゴン下でクロロホルムを蒸発させ、1 mg / mlのにHBS緩衝液中の脂質を可溶化する。 4℃でLNT溶液を保つ</li></ol> FVIII-LNTの2。低温電子顕微鏡<ol><li>低温電子顕微鏡サンプル調製<ol><li> 300は、50 W.で10秒間のO 2とH 2ガスの混合物中のQuantifoil R2 / 2銅グリッド（炭素側アップ）メッシュグロー放電</li><li>のw / w比1:1のCa-HBS緩衝液中のFVIIIおよびLNT溶液を混合し、室温で15分間インキュベートする。 </li><li> 2.5μLのドロップを適用VitrobotマークIV加湿チャンバー（100％湿度）における親水電子顕微鏡グリッドにFVIII-LNTサンプル。 </li><li>ブロットおよびFlashは、液体、C 2 H 6グリッド（3.5秒1ブロット、しみ力1）を凍結、アモルファス氷を得るために、液体N 2で冷却。 </li><li>液体N 2（LN2）下収納ボックスに保管してグリッド。 </li></ol></li><li>低温電子顕微鏡データ収集 NOTE：JEM2100-LaB 6の（2010年）は、電子顕微鏡、真空系、照明系、HT、レンズ電流と、いわゆるオンを読み取る窓がスクリーン、二つに接続されたコンピュータからなる​​TEMCONオペレーティングシステムが装備されているパネル：LEFTおよびRIGHT、列の両側に配置された。 X、Yのノブ（シフトY、SIFT Y）および多機能（DEF / STIG）ノブが両方のパネル上にあるビームシフト。左側のパネル上の照明（BRIGTHNESS）ノブです。右側のパネルで以下のとおりです。倍率（MAG / CAMの長さ）、フォーカス（FOCUS）ノブと3イマジンG（MAG1、MAG2、LOWMAG）と回折（DIFF）モードボタン。私たちは、アルファ2でMAG1で私たちのデータを取得する。低温電子顕微鏡データの取得に必要な最低限の線量照明条件（MDS）は、右側のパネルにF6ボタン、一番上の行を通じてF1を設定されている。このプロトコルでは、一般的な設定が使用されています。F1 - /下画面を上げ、F2 - 検索モード、F3 - フォーカスモード、F4 - 写真モード、F5 - MDS ON / OFFおよびF6 - 放射線から標本を遮蔽するために使用されるビームBLANK、ビームを偏向による損傷。 <ol><li>低温ステーションにクライオホルダーを配置し、ホルダーとLN2とのクライオ駅のデュワーを埋める。温度が-192℃、ホルダー先端の開いたシャッターに到達すると、場所は以前に指定された場所に低温電子顕微鏡グリッドを凍結させ、リングクランプで固定します。 </li><li>電子顕微鏡にクライオホルダーを挿入します。クライオホルダーとLN2と反汚す人室のデュワーを補充します。保有者が30〜60分間安定するのを待ちます。そして上のF6キーを押しますフィラメントの電源を入れます。グリッドを表示するには、ホルダーのフィラメントが飽和し、F6キーを押しオフ、オープンシャッター。 </li><li>を押して、低マグ/アルファ1（200×等で設定される）し、グリッド上に薄い氷の領域を探します。 </li><li>最小用量（MDS）モードを設定し、試料を損傷することなく、低電子用量でクライオEMデータを取得するMAGの1/alpha 2に切り替える。 <ol><li> F2キーを押して検索モードを設定します。 40,000 xで倍率を設定します。 / A 2·sの-最小の電子線量にBRIGTNESSノブ〜0.04 eでビームを拡大します。を押しDIFFは、回折モードに切り替えます。 MAG / CAMの着丈ノブ120 cmのカメラ長を設定します。カーボン膜の穴に脂質ナノチューブを持つLOWMAGで事前選択された領域内でグリッド上の領域の位置を確認します。 </li><li> F4キーを押して40,000倍の倍率でのフォトモードを設定し、16〜25 Eの投与量での輝度つまみで照明を設定する- / A 2·sである。 Z高さを調整するフォーカス条件を設定するのプレス標準フォーカスボタンZ UP / DOWNボタン（右側のコントロールパネル）で試料の。 -1.5と-2.510μmのデフォーカスを設定します。 </li><li>写真モードでは、画像化される領域に対応する検索モードでのデジタルカメラの液晶モニターにライブビュー]ウィンドウの四角形を描画して検索し、写真モードに合わせます。 </li><li> F3キーを押して、10万倍の倍率でのフォーカスモードを設定します。 PHOTOモードで画像化される領域を照射しないよう - （5cmの半径〜4）および軸外CCDチップを覆うように照明を当てる。フォーカスノブとDEF / STIGノブと画像の乱視の正しいで〜-1.5 -2.5μmのデフォーカスを調整します。 </li></ol></li><li> FVIII-LNTデジタルカメラのモニターにライブビュー]ウィンドウでライブ画像を取得することにより、検索モードで画像化することを選択します。ライブビュー画面上に描かれた正方形の中のFVIII-LNTを中央に。 </li><li>写真モードに切り替えるとACQUIRをクリックすることで、52000 X実効倍率と0.5秒の露出で、CCDカメラ上でデジタル画像を記録デジタル顕微鏡のカメラの画面にはEボタン。画像取得条件は、画像をPHOTOモードで取得された場合にのみオープンビームブランク（シャッタ）として設定される。 </li><li>高速フーリエ変換（FFT）を得るために、Ctrl + Fキーを押すことによって取得された画像の質とフォーカスをチェックしてください。 </li></ol></li></ol> 3。3次元再構成注：2次元および3次元解析に用いた画像解析ソフト：EMAN2とIHRSRが自由に​​利用できます。 EMAN2はhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Installからダウンロードすることができます。 egelman@virginia.edu：IHRSRソフトウェアはEgelman教授から得ることができる。最終IHRSRの改良がテキサスで実行されるコンピューティング·センタークラスター拡張：テキサス州、オースティン大学でhttp://www.tacc.utexas.edu/を。 図1に示した3次元再構成アルゴリズムは、主に2つのステップで構成されます。最初に2次元のリファレンス無料alignmeとらせんセグメント（粒子）の均質なセットを選択するNT（RFA）のアルゴリズムは、第二の螺旋のパラメータとIHRSRに内蔵された逆投影アルゴリズムに基づいて3次元再構成を実現し、EMAN 2に実装されています。 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2：最初のステップは、単一粒子のSPA EMAN2は、具体的に開発され、配布されたため（アルゴリズム）と3次元再構成のため、均一な粒子のセットを選択するために開発されたプログラムを利用しています。このステップは、低温電子顕微鏡データに適応されています。第二工程は、特に組換え第VIII因子形態を用いて得られた螺旋状アセンブリのタイプのために設計されてIHRSRアルゴリズムを用いて達成される。このアルゴリズムは、科学文献12を通して広範囲に文書化されています。 <ol><li>均質な粒子の螺旋再構成のために（ヘリカルセグメント）のセットを選択することがhttp://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16：EMAN2科学的な画像処理スイートを2次元画像解析を行う。 <ol><li> straigと低温電子顕微鏡顕微鏡写真を選択します。HTおよびデジタルカメラのソフトウェアおよび視覚化ツールを使用してらせん状のチューブをよく組織。 </li><li>反転、e2workflow.py GUIのX線ピクセル、単一の粒子の再構築（SPR）のオプションを標準化し、フィルター：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> e2helixboxer.py GUI で 、反転し、正規化し、X線ピクセルがフィルタ処理した画像をインポートします。使用して90％のオーバーラップで256×256ピクセル（2.9Å/ PIX）で、FVIII-LNTのヘリカル管とセグメントを選択します。http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li>オリジナルの写真からフォーカスを評価しe2workflow.pyに組み込まe2ctf.pyオプションを使用して、同じ写真かららせんセグメントにコントラスト伝達関数（CTF）修正（のみ位相補正）を適用：http://blake.bcm。 edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf。 </li><li>初期粒子（らせんセグメント）を生成e2workflow.py GUIで設定します - SPRオプション：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow。 </li><li> ITER = 8 - &#39;e2refine2d.py：e2refine2d.pyアルゴリズムはスクリプト以下、同じ直径のLNTとヘリカル秩序度（ 図2）との均質なデータセットを選択するために、参照の無料K-平均の分類を適用することで、2Dクラス平均を計算する - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - パス= r2d_001 - 入力= INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp =ドット - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp =ドット - classraligncmp =位相 - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager =平均 - normproj-classkeepsig &#39;、それに応じてNCLS値を変更する。 <ol><li>クラス平均に80％未満の類似性を持つ粒子は特定のクラスから除外されていることを意味し、 &#39;classkeep = 0.8」と8回の繰り返しオーバー150クラス&#39; = 151 NCLS &#39;に設定された初期データを分類します。 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li>クラス平均から粒子をマージ中間データセットを作成するe2display.pyの顕著なヘリカル回折と。 </li><li>注文の同径と学位を持つクラスを区別するために50のクラス &#39;= 51 NCLS&#39;に設定された中間データを分類する。 </li><li> http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector：同じ直径と3次元再構成のための最終的なデータセットを作成するe2display.pyにおける秩序度を持つクラスからの粒子をマージします。 </li></ol></li></ol></li><li> Egelman 17、18で説明したように、反復ヘリカル実空間の再構築（IHRSR）アルゴリズムで螺旋再実行してください。 <ol><li>上昇を推​​定、組み合わせた変換からのFVIII-LNTヘリックスのΔzの（A）は、最終的なデータセットの中の粒子の変換。 </li><li> 5からΔΦを高め、一定のΔzのと並行してIHRSRの改良を実行することで、方位角ΔΦ（度）を定義76; 5°刻みで60°である。 </li><li> 3.2.1で定義された初期容量および初期ヘリカルパラメータΔzのとΔΦなどの特徴のシリンダーと、各最終的なデータセットのために100個の連続IHRSRサイクルを実行します。および3.2.2。 </li><li>クラス最終データセットの2D分類からの平均と最終IHRSR再建から突起間のらせん状のパラメータとの対応関係の収束のために最終的なボリュームを検査します。 </li><li>最終的な非対称の3Dボリュームで観察非対称単位分布に対応し、最終的な3D再構成に対称性を課す：ヒトFVIII-LNT用の4倍とブタFVIII-LNT用の5倍。最終的な対称3次元再構成を生成するために、別の100の改良サイクルを実行します。 </li><li>最初の偶数奇数で設定した対応するデータを分離することにより、両方のボリュームのためのフーリエシェル相関曲線を計算します。 &#39;e2proc2d.pyで、&lt;infile&gt; &lt;OUTFILE&gt; - スプリット= 2 &#39;。 3.2.3で説明したように、その後100 IHRSR連続した改良を実行します。奇数と偶数のデータセットから作成された3DボリュームのFSCを計算します。 &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;。 </li></ol></li><li> CHIMERAにより作成中のFVIII-LNTボリュームを視覚化し、セグメント。 </li><li><ol><li>ステップ3.2.5からの最終的なボリュームを開きます。 CHIMERAにより作成中とツール&gt;ボリュームデータ]&gt; [ボリュームビューアオプションで0.005にコンターレベルを設定します。 </li><li> [ツール]&gt; [ボリュームデータ&gt;セグメントマップ、セグメントマップ]タブで選択して音量やセグメントにセグメント上のボリュームをクリックします。 </li><li> CtrlキーとShiftキーとクリック·グループに選択して、1単位セルに対応するグループのセグメント。 </li><li>単位セルによってセグメントを色と構造的特徴を強調するためのアクション&gt;カラーオプションを指定してヘリックス。 </li></ol></li></ol> 4。電子トモグラフィー<ol><li>ネガティブ染色FVIII-LNTサンプル調製<ol> &lt;李は&gt;低温電子顕微鏡実験用としてFVIII-LNTのサンプルを準備します。 </li><li>グロークライオEM実験用として、50 Wで10秒間のO 2とH 2ガスの混合物中の炭素被覆300メッシュの銅グリッド（炭素面を上）に排出する。 </li><li> 、グリッドに6nmの金コロイドナノ粒子を2.5μlのFVIII-LNT懸濁液の滴を適用し、過剰の液体をブロットし、負に2分間、5μlの1％酢酸ウラニル溶液を適用することによって染色する。グリッドを乾燥させ、過剰な液体と空気ブロット。 </li></ol></li><li>電子断層撮影データ収集<ol><li>シングルチルトホルダーにグリッドを転送します。 </li><li>電子顕微鏡でホルダーを転送します。 </li><li> 、52000 X実効倍率でCCDカメラで60°と記録画像にSerialEMソフトウェアと共に自動的に-60°の角度範囲にわたって19°2でカウントをチルトシリーズを収集-6 -10ミクロンのデフォーカスと150の電子線量に - 170エレメントctrons / A 2·sの断層ごと。 </li></ol></li><li> FVIII-LNTの電子トモグラフィー再構築 注意：4.2で取得pFVIII-LNTとhFVIII-LNT傾斜シリーズを再構築。 http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html：チュートリアル次のIMODソフトウェアのETomoオプション付き<ol><li>ターミナルウィンドウを使用して、3DMODに断層を開きます。 http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html。 </li><li>ビンはIMOD BINVOLで4による断層は断層像のサイズを小さくするコマンド。 </li><li> IMOD ROTATEVOLコマンドを使用して、ビン化断層像にY軸に沿った脂質ナノチューブを回転させるために適切な角度を選択する。 </li><li> IMOD ROTATEVOLコマンドを使用して完全な断層像を回転させます。 </li><li> IMODクリップresizeコマンドでY軸に沿って配向選択した脂質ナノチューブをトリミング。 </li><li> 3DMODでトリミングされたサブ断層を開きます。 </li><li>に沿った第VIII因子分子の配置を可視化するために断層像をクリックしてくださいZ軸方向のサブ断層像ボリュームにおけるY軸に沿ってスライス。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないし、彼らがこの原稿に公開された手順のいずれかについて、直接接触させることができることを宣言します。

人間とブタFVIIIの自己組織化、人体に遭遇する条件で脂質ナノチューブ上：この作品では方法論は、高度に相同タンパク質の2膜結合組織を区別するために提示されている。 記載されている手順では、ヒトとブタFVIIIが正常に最も重要なステップである、脂質ナノチューブに螺旋状に整理されています。次の重要なステップは、近い液体N 2温度で瞬間冷凍により薄いアモルファス氷中に試料を保存することです。アモルファス氷と液体窒素温度でサンプルを保存することで水和ヘリカルチューブとタンパク質 - 脂質巨大分子集合体は、生理活性保ちます。最後の重要なステップは、近LN2温度で高解像度の3D構造のために十分な量及び質のクライオEMデータを取得する。近い液体窒素温度でのデータを収集すると、さらに高いV試料の脱水を防ぐ電子ビームから顕微鏡や放射線損傷のacuum。 FVIIIの膜結合構造を計算するには最初の重要なステップは...

血液凝固第VIII因子（FVIII）は、6つの領域で編成2,332アミノ酸の大きな糖タンパク質である：A1-A2-B-A3-C1-C2 3。トロンビンの活性化FVIIIは膜結合テナーゼ複合体中の第IXa因子の補因子として機能したら。膜に依存した方法でのFIXaに活性化FVIII（FVIIIaの）の結合は、効率的な血液凝固4のために重要である、FIXaのタンパク質分解効率を10以上の5倍を強化します。 FVIIIは、凝固およびテナーゼ複合体形成に果たす重要な役割にもかかわらず、機能的な膜結合FVIII構造が解決されていている。 これに対処するために、高親和8,9とFVIIIと結合し、活性化血小板表面に似ていることが可能なホスファチジルセリン（PS）に富む単一脂質二重層ナノチューブ（LNT）は、10が開発されている。 LNTにバインドされたFVIIIの連続した​​螺旋状の組織がeffectiであることが証明されました低温電子顕微鏡5によるFVIII膜結合状態の構造決定のためのVEの。官能化されたLNTは低温電子顕微鏡11、12によって螺旋状に編成膜関連タンパク質のタンパク質-タンパク質及びタンパク質-膜の相互作用を研究するために理想的なシステムです。試料を添加し、同位体なしで生理的環境（バッファ、膜、pH）で、最も近いで保存されているように低温電子顕微鏡は、X線結晶解析やNMRなどの伝統的な構造的な方法に比べて利点があります。 LNTは、サイズ、形状および組成テナーゼ複合体がインビボでアセンブル活性化血小板の偽足により密接に似ているように、FVIIIの場合、この手法で膜結合構造を研究することは、さらにより生理学的に関連する。 欠陥およびFVIIIの原因血友病A、人口4、6の1 5000の男性に影響を与える重大な出血性疾患の欠乏。ほとんどの電子血友病Aのffective療法は、組換えヒトFVIII（hFVIII）の生涯にわたる投与である。組換え第VIII因子血友病A治療の重要な合併症は、血友病A患者13の約30％に影響を与える人間の形に阻害抗体の開発である。ブタFVIIIがヒトFIXaを7ヒトFVIIIおよびフォームの機能的複合体に対する阻害抗体との低い交差反応性を表示するように、この場合には、ブタFVIII（pFVIII）濃縮物を、使用される。ブタおよびヒトFVIIIの両形態の膜結合組織を確立することは、FVIII補因子機能と血液止血のための含意の構造的基礎を理解することが重要です。 本研究では、脂質ナノテクノロジー、クライオEM、及び2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合組織を解決するために設計された構造解析の組み合わせを記載している。螺旋状に組織化さporciに提示低温電子顕微鏡データと3次元構造負に帯電したLNT上のNEとヒトFVIIIはFVIIIおよび生理的膜環境における膜結合型凝固因子との複合体の構造決定のための基礎として提案されたナノテクノロジーの可能性を示す。

<table><tbody><tr><td>LaB6</td><td>JEOL株式会社</td>とJEM2100<td>JEM-2100</td><td></td></tr>は<tr>、<td>日本電子(株)</td>製<td>TEMCONソフトウェアで</td>200kVで運転<td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 クライオホルダー</td><td>ガタン株式会社</td><td>626.DH</td><td>-175 &deg;C</td></tr><tr><td>温度調節器付き</td><td>ガタン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan社 4K×4K CCDカメラ</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4,096 x 4,096 ピクセル (15 μ;m/pixel 物理解像度</td></tr><tr><td>Solarus Model 950 プラズマクリーナー</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カーボンコーティング 300 メッシュ 3 mm 銅グリッド</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>プラズマ 高出力</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 メッシュ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>Q225-CR2</td><td>カーボンコーティング 300 メッシュ Cu グリッド、直径 2 mm の穴&nbsp;</td></tr><tr><td>酢酸ウラニル二水和物</td><td>テッドペラ</td><td>19481</td><td>1% 溶液、ろ過</td></tr><tr><td>されたガラクトシル セラミド</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>ジオレオイル-sn-グリセロ-ホスホ-L-セリン</td><td>アバンティポーラーリピッズ株式会社</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>EMソフト デジタルマイクログラフ</td><td>ガタン株式会社</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a</td></tr><tr><td>>EMソフトウェアEMAN</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp;</a></td></tr><tr><td>EMソフトウェア Spider</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EMソフトウェア IHRSR</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td>エドワード・H・エゲルマンから入手可能なプログラム http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>EMソフトウェア（IMOD)</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp;</a></td></tr><tr><td>EMソフトウェア(SerialEM)</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>無料ダウンロード</td><td></td><td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

脂質ナノチューブ上血液凝固第viii因子の螺旋組織

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html>低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡）1は、水和状態と膜環境2内のタンパク質との複合体の機能的な構造を調査するための強力なアプローチである。 凝固因子VIII（FVIII）3は、マルチドメイン血漿糖タンパク質である。重度の出血性疾患 - FVIIIの欠損または欠乏が血友病A型の原因である。タンパク質分解活性化されると、FVIIIは正常な血液凝固4のために重要である、負に帯電した血小板膜上のセリンプロテアーゼIXa因子に結合する。 FVIII凝固で果たす重要な役割にもかかわらず、その膜結合状態の構造情報は、5不完全です。組換えFVIII濃縮物は、血友病A型に対する最も有効な薬物であり、市販のFVIIIは、ヒト又はブタ、ヒト第IXa因子6,7の両方の機能的複合体を形成するように表すことができる。 &quot;&gt;本研究では、低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡）の組み合わせを提示し、脂質ナノテクノロジー、構造解析は、2つの高度に相同的FVIII形の膜結合構造を解決するために適用される：ヒトとブタの研究室で開発された方法論螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）に二つの機能の​​組換えFVIIIフォームを整理することは記載されている。代表的な結果は、我々のアプローチは、シーケンス内の高度に相同性2（86％の配列同一性との間に螺旋状の組織の違いを定義するのに十分に敏感であることを証明している）タンパク質ヘリカル組織、低温電子顕微鏡と電子断層撮影（ET）データ取得のための詳細なプロトコールは、二次元（2D）所与の三次元（3D）構造解析は、ヒトおよびブタの3次元再構成を得るために適用されるFVIII-LNTが議論されている。提示、ヒトとブタFVIII-LNT構造はcalculatするために提案手法の可能性を示す高解像度での血液凝固因子VIIIのe機能、膜結合組織。

組換えヒトとブタFVIIIが正常に悪影響を活性化した血小板表面に似た、単一の二層LNTを請求螺旋状に組織された。人間とブタFVIII-LNTのらせん組織は（ 図2）収集したデジタル顕微鏡写真を通じて一貫していた。制御LNTと人間とブタFVIII-LNTヘリカルチューブはe2helixboxer.py GUIとe2workflow.py GUI、単一粒子のオプション（ 表1）で作成した初期データセットを選択し、セグメント化された。 膜結合型ヒト及びブタFVIII-LNTの螺旋順序はe2display.py GUI（EMAN2）（ 図3）を使用してクラス平均像のフーリエ変換から評価した。最高の制御LNTの2Dクラス平均での脂質二重層はよく定義されています。内側と外側のリーフレットと膜の疎水性コアの低密度が（はっきりと見える<strong&gt;図3A）。に向かって、膜表面に対して垂直方向に配向膜結合ヒトおよびブタFVIII分子の投影された密度は、十分に...

ヒトおよびブタ：我々は、2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合構造を解決するために適用クライオ電子顕微鏡法、脂質ナノテクノロジー、および構造解析の組み合わせを提示する。螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）上の二つの機能の​​組換えFVIIIフォームを整理するために私たちの研究室で開発された方法論が記載されている。

脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

この手順の全体的な目標は、クライオ電子顕微鏡法によって脂質ナノチューブ上に組織化された第VIII因子ヘリの構造を定義する方法を示すことです。これは、まず脂質ナノチューブ上にヘリック精製第VIII因子を組織化し、液体窒素温度および低電子線量でクライオ電子顕微鏡データを収集することによって達成されます。次に、第VIII因子膜結合構造を、単一粒子とヘリカル3D再構成アルゴリズムを組み合わせて計算します。次に、電子線トモグラフィーデータが収集され、3D再構成が生成されます。最終的に、計算された第VIII因子脂質ナノチューブ構造は、3Dボリュームをセグメント化し、それらをトモグラフィー再構成と比較することにより検証されます。実証された方法は、第VIII因子の膜結合組織とは何か、そしてそれが凝固におけるその機能とどのように関連しているかなど、構造生物学および血液凝固の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。GM 2100 ラボ 6 には、電子顕微鏡に接続されたコンピュータで構成される TE con オペレーティング システムが装備されています。バキュームシステム、照明システム、HTレンズ電流、コラムの両側に配置された左右の2つのパネルを読み取るウィンドウ付きの画面、ビームシフト、XYノブ、多機能または聴覚障害者のスティックノブが両方のパネルにあります。左側のパネルには、イルミネーションまたはブライトネスのノブがあります。右側のパネルには、倍率とフォーカスのつまみ、撮像倍率1、倍率2、低倍率の3つのボタンと、回折モード用のボタンがあります。このプロトコルでは、汎用設定を使用して、mag 1 で alpha 2 でデータを取得します。クライオ電子顕微鏡データ取得に必要な最小照射条件またはMDSは、右パネルの最上段にあるF1からFの6つのボタンで設定します。F1 で画面を上げ下げ、F 2 でサーチ モード、F 3 でフォーカスを合わせます。フォトモードにはF 4、MDSのオンとオフを切り替えるにはF 5、ビームを偏向させることで試料を放射線損傷から保護するために使用されるビームブランクにはF 6を選択します。クライオEMサンプルを調製した後、テキストプロトコルに従って、クライオホルダーをクライオステーションに置き、液体窒素でホルダーとクライオステーションの被験者を満たします。マイナス192°Cに達したら、ホルダー先端のシャッターを開け、あらかじめ凍結していたクライオEMグリッドを所定の場所に置き、リングクランプで固定します。次に、クライオホルダーを電子顕微鏡に挿入し、液体窒素を使用してクライオホルダーとアンチエーターチャンバーのドーアーを補充します。ホルダーが30〜60分間安定したら、フィラメントをオンにします。フィラメントが飽和したら、F 6を押してホルダーのシャッターを開きます。グリッドを表示するには、低マグα1を押して、グリッド上の薄い氷のある領域を見つけます。その後、mag one alpha two に切り替えて最小線量または MDS モードを設定し、試料を傷つけないように低電子線量でクライオ EM データを取得します。検索モードを設定し、倍率を40、000 xに設定するにはF 2を選択します。明るさのつまみを使用して、オングストロームの二乗秒あたり約0.04電子の最小電子量にビームを拡大します。次に、diffを押して、マグカムの長さノブで回折モードに切り替えます。カメラの長さを 120 センチメートルに設定します。次に、事前に選択した領域内の炭素膜の穴に脂質ナノチューブがあるグリッド上の領域を見つけます。次に、F 4を押して写真モードを40, 000 x倍率に設定し、明るさノブを使用して、オングストローム平方×秒あたり16〜25電子の用量で照明を設定します。次に、標準フォーカスボタンを押してフォーカス条件を設定し、Zアップダウンボタンで試料のZ高さを調整します デフォーカスを負の1.5マイクロメートルから負の2.5マイクロメートルの間で設定します。デジタルカメラモニターのライブビューウィンドウで、写真モードで撮影する領域に対応する検索モードで正方形を描画することにより、検索モードと写真モードを整列させ、F 3を押してフォーカスモードを100, 000 x倍率に設定します。次に、CCDチップを覆うように照明を集中させ、撮像する領域に照射しないように軸から外れます。写真モードでは、必要に応じて、画像の乱視に合わせて、ピンぼけを負の1.5マイクロメートルから負の2.5マイクロメートルの間で調整します。検索モードでは、デジタルカメラモニターセンターのライブビュー画面でライブ画像を取得して撮影するF eight LとTを、ライブビューウィンドウに描かれた四角のF eight LとTを選択します。写真モードに切り替えて、デジタル顕微鏡カメラモニターの取り込みボタンをクリックします。CCDカメラでデジタル画像を記録するには、CTRL Fを押して高速フーリエ変換を取得し、取得した画像の品質と焦点ぼけを確認します。無料の科学画像処理ソフトウェアであるEman twoとI-H-R-S-Rを使用して、テキストプロトコルに従って2D画像解析とヘリカル再構成を実行した後。F eight LおよびTボリュームを視覚化してセグメント化するには、UCSFセラセレクトツール、ボリュームデータセグメントマップで最終的な3D再構成を開き、セグメントマップタブでボリュームを選択し、セグメントをクリックしてボリュームデータをセグメント化します。次に、Control Shift キーを押しながら group をクリックして、1 つの単位セルに対応するセグメントをグループ化します。構造的特徴を強調するには、アクションの色を選択して、単位セルとらせんによってセグメントを色付けします。電子線トモグラフィーデータを収集するために、ネガティブに染色された電子顕微鏡グリッドを単一のチルトホルダーに移してから、ホルダーを電子顕微鏡チルトに移します。脂質ナノチューブ上の一連の同盟組織化ブタ第VIII因子をシリアルEMソフトウェアで収集しました。テキストプロトコルによると、トムはIMで再構築され、3D modで視覚化されて、imad bin Val tobinのサイズを4つ縮小し、IM mod rotate volコマンドを使用して、脂質ナノチューブをY軸に沿って回転させる適切な角度を選択し、IM modクリップサイズ変更コマンドクロップでフルトムモを回転させます。 Y軸に沿って選択した脂質ナノチューブは、3D modを使用してトリミングされたサブトモを開きます。最後に、Tommo Grahamをクリックして、サブトモボリュームのZ軸のスライスとY軸に沿った第VII因子分子の配置を視覚化します。ここに示すように、組換えヒトおよびブタのF eightは、活性化血小板表面に似た負に帯電した単一二重層lt上で成功裏に組織化された。この図は、膜結合したヒトとブタのF eightと、best-controlのLNTおよびF eight LNT 2Dクラス平均の脂質二重層のらせん状順序が明確に定義されており、2つのタンパク質間のらせん組織の変化を明らかにしていることを示しています。これらのパネルは、最終的なヒトとブタのF 8 LおよびTデータセットから1000の代表的な粒子を使用して実行されたヒトとブタのF 8 LおよびTの初期3D再構成を表しており、ヒトとブタのF 8 LNTのフォアシェル相関プロットは、この図の0.5に等しいフーリエシェル相関で20.5オングストロームの解像度を示しています。最終巻は、らせん軸の周りに組織化された8つのヒトF 8と10のブタF 8膜結合分子を示しています。各ヒトのF 8分子は41.2オングストローム平行移動され、前の分子から42.0度回転し、各ブタF 8分子は35.9オングストローム平行移動され、前の分子から35.2度回転します。これは、最終的な3D再構成のらせんパラメータに対応します。このビデオを見れば、脂質ナノチューブ上に配集された膜状タンパク質のクライオ電子顕微鏡データを取得し、生理学的条件に近い3次元構造を計算する方法についてよく理解できるはずです。このビデオは、凝固タンパク質の高解像度膜結合構造への第一歩であり、脂質環境で機能する他のタンパク質に適用することができます。

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。...

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

私たちは、自己組織化ナノ構造をコアに含む脂質粒子の速度論的安定化のためのカーボンナノチューブのスマートな応用について報告します。脂質粒子の調製には、かなり低濃度のカーボンナノチューブが必要であり、薬物送達などの生物医学的用途での使用が可能です。...

カーボンナノチューブにより安定化内部自己組織化脂質粒子の簡便な調製

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。...

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー...

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

固相担、タンパク質-無料、ダブル リン脂質二重膜 (DLBM) 複雑で動的な脂質ナノチューブ ネットワークに変換することができます、小胞体の 2 D のボトムアップ...

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。...

グライダーキネシン運動性アッセイを用いた多成分脂質ナノチューブネットワークの構築

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

この研究では、血栓の溶解、細胞染色、および定期的な血液検査による脳血栓の細胞成分分析のための迅速かつ効果的な方法について説明します。...

脳血栓の細胞成分を包括的に解析する

in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis...

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。...

血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム

学ぶ脂質ナノチューブ上の血液凝固第VIII因子の螺旋構造解析法。低温電子顕微鏡とヘリカル3D再構成アルゴリズムを組み合わせて膜結合タンパク質の構造を解明し、構造生物学と血液凝固研究の新たな知見を提供します。

脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

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