Name: ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶポリリボソーム画による中枢神経系トランスラトーム解析法。マウス組織からリボソーム結合RNAを分離し、翻訳レベルと調節因子を評価する神経科学の重要技術です。

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この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省（BMBF）、（システム生物学上のヘルムホルツ·アライアンス）は、癌におけるシグナル伝達のシステム生物学とドイツ癌研究センター（DKFZ）によってサポートされていました。

全ての動物実験は、DKFZの制度ガイドラインに従って行った。 注意：サンプルのRNA分解酵素の混入を防ぐためRNaseのコンタミを回避するための基本的な予防措置を取り、DEPC処理水を用いてすべてのバッファを製造するために。 スクロース勾配の1。準備<ol><li> （ 表1参照）17.5、25.6、33.8、41.9および50％ショ糖溶液を調製する。ゆっくりポリアロマー超遠心管の底に50％スクロース溶液2mlを添加することにより、勾配の準備を開始。 -80℃で20分間チューブを配置することによって層をフリーズ</li><li> 17.5％のショ糖に終わる、その間の凍結ステップでショ糖の割合を減少さでその後の層を追加します。下の層の融解を防ぐためにショ糖溶液の添加の間、氷上で勾配を維持する。 </li><li>たての1日の使用前に、ショ糖勾配を準備し、4℃で保管しAlternativelYは、実験前の夜、4℃で-80℃と融解で、事前に店舗に勾配を準備します。 </li></ol> 2。組織調製（脊髄および/または脳） <ol><li> NaCl中のキシラジンおよびケタミンの過剰投与によりマウスを麻酔し、経関連転写上のリボソームを固定化する200μg/ mlののCHXを含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）20mlで灌流。つま先のピンチに非応答で適切な麻酔を確認してください。 </li><li>急速に組織を抽出します。頭蓋の背を開き、脳を抽出します。全体胸部および腰部脊柱の椎弓切除を行い、脊髄を抽出​​します。それぞれ、全脳（〜400ミリグラム）、または脊髄の4センチメートルピース（〜90 mg）を使用してください。 </li><li>シクロヘキシミドの取り込みの増加を可能にし、サイコロきれいなメスを用いて小片に：;：氷の冷たい均質化緩衝液A（ 表1参照）（4ミリリットル脳1ミリリットル脊髄）内に組織を移す。 Perfo氷の上のすべての更なるステップRM。 </li><li> 15分間インキュベートし、機械的にDounceホモジナイザーを用いて組織を均質化する。注意深く制御された均質化は、核がそのまま残ることを保証する必要がある。すべてのサンプルの比較可能性を確保するためにまったく同じように扱う。注：脳組織のために：しっかりフィット乳棒で5ストロークで組織を混乱させる。脊髄組織のために：しっかりフィット乳棒で5さらにストロークが続く遊嵌乳棒で5ストロークで混乱させる。 </li><li>トータルRNA単離のために-80℃で一定分量（脳と脊髄のための200μL400μL）、フラッシュ凍結して保存してください。 </li><li> 4℃で10分間、500×gでの遠心分離により核および未破砕の細胞及び組織断片を除去低速遠心分離は、リボソームの損失を防ぎます。 </li><li> NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの界面活性剤（1％の最終濃度まで各々）を加えることにより30分間核を含まない上清中で溶解する膜断片。 </li></ol><ol><li>このステップは、他の方法でポリリボソームプロファイルで信号をマスクするサンプルからの脂肪成分を除去する。まず、予備冷却超遠心バケット及び4℃でローターと2 M、1.1 Mを調製し、0.9 Mのショ糖溶液は、（ 表1参照）。 </li><li> 2 Mショ糖溶液の1.22倍容量の溶解液を混合し、ポリエチレン超遠心チューブに移す。 1.1 Mショ糖溶液で10mlを等量のすべてのチューブを埋める、その後0.9 Mショ糖溶液で慎重に重ねる。 </li><li>あらかじめ冷却超遠心バケットに超遠心管を配置します。 4℃、100,000×gで3時間遠心分離このプロセスの間に脂肪の成分が浮上し、上清中に残っているのに対し、ペレット内に堆積なるリボソーム。 </li></ol> 4。ショ糖勾配分画<ol><li>上清を除去し、均質化緩衝液Bでペレットを溶解する（ 表1を参照してください。 </st栄&gt;）。ナノドロップまたは同等の装置を用いて各サンプルの260nmでの吸光度を測定し、吸光度値に応じてロードする量を正規化する。 </li><li>あらかじめ冷却超遠心バケットに（準備が前のセクションで説明されている）、ショ糖勾配を配置します。慎重に勾配の上の層のサンプル。技術的なコントロールとして1ブランクのショ糖勾配を追加します。 </li><li>均質化バッファーで各バケットの重量を調整します。 4℃で285,000×gで1.5時間遠心分離器のサンプル</li><li>遠心分離の終了前にイスコの精留塔30分の準備を開始。分留塔の別のモデルが使用される場合、製造業者のプロトコルに従う。 <ol><li> UVランプのための適切な感度を（脳や脊髄のための0.05 AUFS 0.2 AUFS）を設定し、ウォームアップのためにそれをオンにします。チューブ穿孔を組み立て、管穿孔を通して60％ショ糖溶液にローリングポンプを介して接続してください。 </li><li>ショ糖（フローラットをポンピングすることによって設定をテストE：1ミリリットル/分）、特にグラデーションに気泡を導入する配管内の漏れがないことを確認してください。 </li><li>手動でUV検出器に勾配バッファをポンピングし、ベースラインを補正することにより、ブランクバックグラウンド吸収。 </li></ol></li><li>慎重にローターから沈降したサンプルを、ショ糖勾配を含む超遠心バケットを削除して、氷の上に置きます。解像度の損失を防ぐために、勾配の任意の突沸を避ける。 </li><li>分別装置で実行グラデーション。バックグラウンド吸収を評価し、適切な技術的なセットアップを確保するために、最初の空のグラデーションを実行します。 <ol><li> UV検出器にグラデーションを取り付け、チューブ穿孔してチューブの底に穴を開け。上向きにUV検出器を通過して落下ディスペンサーに沈降したサンプルでグラデーションを変位さ60％ショ糖のポンプを起動します。 </li><li> 260nmでの吸光度をsedimentaを示すピークが、試料の吸収プロファイルを生成するために文書化されてリボソームサブユニット、モノソーム、およびリボソームのその後増えに関連するmRNAのTiONから。 </li></ol></li><li> （2 mlチューブ内の600μlの各、）ドロップディスペンサーを経由して20分画にサンプルを収集。 </li></ol>個々の画分から5。RNA分離<ol><li>個々の画分1％の最終濃度まで10％SDSを添加し、タンパク質をアンフォールドし、リボソームを解離するために、よく混ぜる。この時点で、サンプルは-80℃で凍結させることができる対処すべき質問に応じて、画分を吸光度プロファイルに従ってプールすることができる。 </li><li>また、DNAの混入の痕跡を除去した酸性フェノール/クロロホルム抽出とRNAを単離する。 <ol><li>各試料から（RTに予熱）酸性フェノール/クロロホルムの1ボリュームを追加し、65℃で10分間の熱、その後ヒュームフードの下で圧力を解放します。 </li><li> RTで17000×gで20分間遠心サンプル。慎重に新しい1.5ミリリットルに水相を転送チューブ。水相は、遠心分離後の一番下にあるかもしれない、より高密度ショ糖画分における位相反転に注意してください。 </li><li> RNAを沈殿させるために、1容積のイソプロパノール、1/9体積酢酸ナトリウム（pH5.2）、各サンプルに1μlのグリコブルーを追加する。 -80℃でサンプルを少なくとも1時間を保つ</li><li> 17000×gで4℃で30分間遠心グリコブルーは、ペレットの可視化を提供します。上清を除去し、氷冷した80％エタノールと空気乾燥ペレットで一回ペレットを洗浄。 RNA分解酵素を含まない水でペレットを溶解する。 </li></ol></li><li>ナノドロップによるRNAの量を定量化し、バイオアナライザチップによってRNAの完全性を分析します。提示されたプロトコルで得られるRNAは、マイクロアレイと深い配列決定を含む当該技術分野ハイスループットアッセイのすべての状態に適している。 </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li>
<li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li>
<li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li>
<li>Brittis, P. a, Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a, Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. -J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li>
<li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).</li>
<li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes%3A+postnatal+development+and+experimental+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li>
<li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ポリリボソーム画は新しい技術ではありませんが、それは特に難しい1のまま。入力された材料に基づく、実質的な最適化が必要であることができる。これは、特に材料の量は、多くの場合、組織成分、翻訳mRNAの単離を妨げる制限および脂肪酸であるインビボ CNS試料の場合である。大部分の公開された分画プロトコルは、酵母または哺乳動物細胞株に対処する、および脳12,13,14のための確立されたプロトコルが存在する。これとは対照的に、脊髄の分別を記述する任意の出版物はほとんど存在しており、以前のプロトコルが15をプールするために多数の動物から脊髄を必要とする。これらの理由から、いくつかの本質的な修飾は、単一のマウス脊髄を含むCNS組織、分別のためのプロトコルを適合させるために行われた。シクロヘキシミドとリボソーム固定化は、ドゥリンリボソームの解離を避けるために、動物の灌流の間に実行されている組織抽出のG長いプロセス。続いて、ポリソームRNAはポリリボソームの収率を最大にするために特定の方法で抽出される。まず、ダウンシングによる組織の制御された均質化は、完全な核を保持し、DNAの混入を防ぐことができます。核はその後、遠心分離により確実に除去されている。洗剤NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの組み合わせは、小胞体およびその膜結合リボソームのリリースの溶解を保証します。また、脂質​​の豊富なミエリン内の紫外線吸収成分は、ポリリボソームプロファイルを不明瞭。ミエリン浮選は、必要があるようなポリリボソームのような密度の高い化合物は、ペレット化される場合、そのようなミエリンfloatとして軽量化化合物および16を除去した。ポリリボソームは、その後、17.5％〜50％のショ糖勾配上で沈降されています。代わりに、手動で各ショ糖層を積層し、凍結の、グラデーションも勾配ミキサーを用いて調製することができる。酸性フェノール/クロロホルムを用いて画分からのRNAの抽出を可能にするDNAは、最小限の損失でRNAを除去する。しかし、位相反転は（端数16以上）密なショ糖画分で行うことができる。 このプロトコルは、翻訳のレベルに取り組む他の従来の方法に比べて利点を提供します。例えば、リン酸化されたS6（著名な翻訳マーカー）の測定だけでなく、放射性同位元素で発生期の鎖のラベルの両方は、グローバルな翻訳レベルに関する情報を与えるが、特に翻訳されているものに少しを明らかにした。ポリリボソーム分画は、他の一方で、グローバルアセスメント翻訳だけでなくmRNAの翻訳および関連する調節タンパク質の同一性を可能にする。定量的リアルタイムPCRは、選択されたmRNAのうち迅速な読み取りのために単離されたRNA上で行うことができ、マイクロアレイおよび次世代のRNA配列決定は、ゲノムワイド研究のために行うことができる。ここに提示の最適化は、技術が減少するので、CNS組織の最小量で使用することを可能にする必要な動物の数をINGと組織処理時間を短縮することにより、全体的な実験の品質を向上させる。一方、この技術は、翻訳したものからのもの停止状態のリボソームを区別することができない。ストールしたリボソームを運ぶ転写物は、重質留分に沈降し、データを解釈する際に留意すべきである。 リボソームは、細胞型特異的な様式でそれぞれのエピトープタグまたはレポーターで標識し、免疫沈降17,18により単離したmRNAを対応付けた最近報告された技術、すなわちRiboTaqおよびTRAPがあります。この技術は、特定の細胞集団のために読み出さ高い分解能を提供するために分別ポリリボソームに結合することができる。リボソームフットプリントはリボソームによって保護されているmRNAの別の新規な小断片を生成するために、ヌクレアーゼ消化を伴う技法、または「フットプリント」である。ライブラリは、これらの足跡から生成され、配列決定される。このメソッドはPROVIDEの翻訳に対するコドン特異的全ゲノム解析やストールリボソームを識別することができる、非-AUGコドンとポリリボソーム分別19により達成することができない小さな上流のオープンリーディングフレームを開始。しかしながら、ポリリボソーム分画は、高純度の試料がしばしば必要とされるライブラリーを調製するために必要な分子種を富化、単リボソームを含有する消化された断片の単離のためのプロファイリングリボソームに結合することができる。一緒になって、ポリリボソーム分画は、永続的な重要性を持つ柔軟な方法であり、次世代シーケンシングのようなゲノムワイドアッセイを含む、様々なダウンストリームアプリケーションに接続することができる。

遺伝子発現は、翻訳は最も優勢な効果軸受1と、転写、翻訳およびmRNAおよびタンパク質の安定性の複合作用によって決定される。なお、これらのステップの各々は高度に調節されていることが今や明らかである。マイクロRNAは、RNA顆粒、代替のポリアデニル化および細胞質の形成は、遺伝子発現2,3の転写後調節のいくつかの例である。これらの機構の各々は、翻訳からの転写を脱共役し、関心のある生物系においてプロテオームに影響を与えます。従って、当然、単独でmRNAレベルは、タンパク質レベル4の不完全読み出される。定量的プロテオミクスは、しかし最近の進歩にもかかわらず、感度、タンパク質配列の解決にかなりの制限がまだある、遺伝子発現の最も直接的な評価を提供する。したがってtranslatomeに取り組む、翻訳mRNAのレパートリーは、勉強の間の優れた妥協点を提供していますトランスクリプトームやプロテオーム。これは、最終的な遺伝子発現を評価するトランスクリプトミクスよりも正確で、より高いカバレッジとプロテオミクスよりもシーケンスの解像度の両方を提供します。 哺乳動物系では、翻訳事象の大部分は、キャップ依存性開始介して開始する。一緒に40Sリボソーム小サブユニットと真核生物の開始因子群は、mRNAの5 &#39;キャップに集合。複合体は、mRNAをスキャンして、開始コドンAUGに到達すると、完全な80Sリボソーム形成するために、60Sリボソーム大サブユニットを募集しています。リボソームは伸長因子は、新生ペプチド鎖に装填されたtRNAのアミノ酸の組み込みを補助するとは、mRNAに沿って移動すると伸長段階に進む。複数のリボソームは同時に単一のmRNAに沿って進むことができ、関連するリボソームの数は、タンパク質合成5,6の速度と相関することが示されている。これはTRANのための信頼できる指標をロードするリボソームを作るslation積極的に沈降速度に基づいてmRNAを翻訳するの分離を可能にする。のmRNAの翻訳の定量化に加えて、配列情報は、翻訳調節に関与するモチーフを同定するために得ることができる。また、RNA結合タンパク質および他の翻訳因子は、関連する調節タンパク質の研究および発見を容易にする、異なる画分から単離することができる。 神経系において、翻訳制御は、mRNAの貯蔵、輸送および局所タンパク質合成のようなプロセスに関連している。成長円錐は、軸索7の他の部分とは異なるmRNAの特定のローカライズされたプールを保有することが示されている。また、軸索は局所的にタンパク質8,9を合成する能力を有する。その結果、翻訳の局所制御は、神経生物学の研究の重要な話題になっている。これに対処するポリリボソーム分画の電位に技術が使用された、いくつかの研究で例示されている脊髄開発における軸索ガイダンスを調査し、脳10,11におけるBDNFの活性依存性の翻訳を示した。

<table><tbody><tr><td>ハンクS balanced salts solution</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>D5758</td><td>注意</td></tr>シ<tr><td>クロヘキシミド</td><td>シグマ</td><td>C7698</td><td>危険</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ</td><td>43815</td><td>警告</td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>11697498001</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルメタンスルホニルフッ化物溶液</td><td>シグマ</td><td>93482</td><td>危険</td></tr><tr><td>RNasinプラスRNase阻害剤</td><td>プロメガ</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td></td><td>11332473001危険</td></tr>性 <tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>警告</td></tr><tr><td>酸-フェノール:クロロホルム、pH 4.5 (IAA 付き、125:24:1)</td><td>アンビオン</td><td>AM9722</td><td>危険</td></tr>性 <tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウンス ティッシュグラインダー、1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor、スイングバケット、チタン、6 x 14 ml、40,000 rpm、285,000 x&nbsp;g</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配分画装置</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ポリリボソーム画によって中枢神経系translatomeの生体尋問中

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

複数のプロセスは、mRNAおよびタンパク質の転写、翻訳および安定性を含む遺伝子発現に関与している。これらのステップの各々は、緊密に、タンパク質存在量の最終的な動力学に影響を与え、調節される。種々の調節機構は、単独で、遺伝子発現の信頼できないインジケータをmRNAレベルを描画、変換ステップに存在する。また、mRNAの翻訳のローカル規制は特に神経生物学での注目の的に「translatomics」をシフトする、神経機能に関与している。提示方法は、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクスをブリッジするために使用することができる。 ここでは、複数のリボソームとショ糖勾配での差動沈降に積極的に翻訳されたmRNAの関連付けに基づいてtranslatomeに質問​​ポリリボソーム分画の技術に不可欠な変更について説明します。伝統的に、特にセントラのin vivoサンプルでの作業lの中枢神経系（CNS）、材料の制限された量および脂肪組織成分の存在のために困難なことが証明されている。これに対処するために、記載されたプロトコルは、特に単一のマウス脊髄および脳の使用によって実証されるように、CNS材料の最小量で使用するために最適化される。簡単に説明すると、CNS組織を抽出し、翻訳をリボソームとmRNAのシクロヘキシミド上に固定化される。ミエリン浮選は、その後、脂質リッチ成分を除去する。分別はmRNAは、そのリボソームの負荷に応じて分離してショ糖勾配上で実行される。単離された画分を新たなゲノムワイドなアッセイ技術を含む下流のアッセイの範囲に適している。

図2は、分別後の代表ポリリボソームプロファイルを示す。細胞株について前述したように脳と脊髄のプロフィールは、特徴的な吸収曲線を示す。小さなリボソームサブユニット（40S）より軽い留分で沈殿物とに結合されたmRNAは、リボソーム大サブユニット（60S）とモノソーム（80S）が結合されたmRNAが続くのプロファイル上のピークとして最初に表示されます。複数のリボソームに結合したmRNAは、後ピークがバインドされたリボソームの増加数を示すとともに、重い画分で沈降する。グローバル翻訳プロファイルから評価することができる。一例として、脳組織は、よりアクティブな変換を示し、脊髄組織よりも比を高くするモノソームポリリボソームを有する。 個々の画分から抽出されたRNAは、18Sおよび28S rRNAの分布を示す、バイオアナライザにより評価した。 18S rRNAのライターsucrに沈降小さなリボソームサブユニットによると、以前のプロフィールに表示されます<html> OSE画。全RNAの典型的な収量は、脳と脊髄のための2-4μgの10〜20μgのです。個々の画分からのRNA収量は、割合に応じて、それぞれ4μgの、脳と脊髄のための0.8μgのまである。ブランクスクロース勾配は既にDTTの存在に起因する260nmでのいくつかのバックグラウンド吸収を示す。このバックグラウンドは、サンプル値を正規化するために、データ分析時に減算することができる。 EDTA処理は沈降プロファイルが翻訳によるもの実証、ポリリボソームピークを崩壊した。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。ワークフローおよびin vivoでのポリリボソーム画の潜在的なアプリケーション。&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> 空のグラデーションと脳の図2。バイオアナライザによる抽出されたRNAの評価と脳と脊髄の（A）の代表的なポリリボソームプロファイル、。定量RT-PCRによる分画上のGAPDH mRNAの（B）の分布。（C）ポリリボソームプロファイルとないEDTA処理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2X勾配バッファ</td><td> 30mMのトリス-HCl pH7.4中、30のMgCl 2、600mMのNaCl、20mMの0μg/ mlのシクロヘキシミド（CHX）、2mMのジチオスレイトール（DTT） </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液17.5％ </td><td> 8.67グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液25.6％ </td><td> 12.8グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液33.8％ </td><td> 16.9グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液41.9％ </td><td> 20.95グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液、50％ </td><td> 25gのスクロース25mlの2×勾配緩衝液、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td>均質化緩衝液A </td><td> 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4）で、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 200μg/ mlのCHX、1Xロシュ完全プロテアーゼ阻害剤、1mMのDTT、1mMのphenylmethanesulfonylfluoride（PMSF）、100 U / mlののRNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2Mショ糖溶液</td><td> 68.4％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1Mショ糖溶液</td><td> 38.5％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9Mショ糖溶液</td><td> 30.8％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> HomogenizationバッファB </td><td> 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを、1％NP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム</td><td> 200μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF、100 U / mlでのRNAsin </td></tr></tbody></table>表1。 緩衝液および溶液のリスト。

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

本実験の全体的な目的は、中枢神経系（CNS）の一次組織において翻訳されているmRNAを特定することです。プロトコルは、シクロヘキシミド存在下でマウスから ilgili 組織を抽出することから始まります。続いて、機械的なホモジナイズを行い、界面活性剤を用いて溶菌させます。次に髄鞘浮上法を行い、ポリリボソームプロファイルを遮蔽する組織の脂肪脂質成分を除去します。リボソームと結合mRNAを含むペレットをショ糖密度勾配で遠心沈降させ、リボソームに結合したmRNAを分離します。その後、勾配を分画してポリリボソームプロファイルを得ます。各ピークは、特定の数のリボソームまたはリボソームサブユニットに結合したmRNAを表しています。次にポリリボソームを含む分画を精製し、下流のアプリケーションに使用するRNAを回収します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、少量のCNS組織で作業が可能であること、および下流のアプリケーションにおける汎用性が高いことです。この手法は、異なる条件下での翻訳レベルの変化や、翻訳、調節因子、および配列モチーフの役割など、神経系における翻訳の研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、in vivoのCNS材料が通常限られていることや、組織内に存在する静的成分がポリリボソームプロファイルを覆い隠してしまう可能性があるため、困難に直面します。HBSSおよびシクロヘキシミドで経心腔灌流を行ったマウスを用いて、速やかに組織採取を開始します。頭蓋骨を背面から開き、脳を取り出します。脳を氷冷したバッファーAに移し、脳組織を直接細断します。次に、胸椎および腰椎の椎弓切除術を行います。脊髄を4 cm切り出し、氷上の氷冷バッファーAに移します。シクロヘキシミドの取り込みを高めるため、個々の組織を細切し、氷上で15分間インキュベートします。次に、核が損なわれないように、ダウンホモジナイザーを用いて組織を破砕します。脳組織の場合は、隙間の少ない（tight）ペッスルで5回ストロークし、メッシュ状になった組織をチューブに移します。脊髄組織の場合は、隙間の広い（loose）ペッスルで5回ストロークした後、さらに隙間の少ない（tight）ペッスルで5回ストロークします。次に、全RNA抽出用の分注試料として、脊髄液200 µLと脳ホモジネート400 µLを回収します。これらを凍結し、-80 °Cで保存してください。核、未破砕の細胞、および組織片を除去するため、組織を500 ×gで10分間遠心分離します。リボソームが結合した小胞体を containing する上澄み液を回収し、核を含むペレットを廃棄します。次に、NP 40およびデオキシコール酸ナトリウム界面活性剤をそれぞれ最終濃度 1% になるように添加し、小胞体膜断片を溶解してリボソームを遊離させます。サンプルを氷上で 30 分間インキュベートします。神経系組織を扱う際の一つの課題は、ミエリンやその他の脂質豊富な成分がポリソームプロファイルに影響を及ぼすことです。この問題に取り組むためには、開始前にこれらの成分を除去するための浮遊法によるモデリングプロセスを導入する必要があります。あらかじめ、超遠心機用バケットとローターを4 °Cで冷却しておきます。次に、回収したライセートに1.22倍量の2 Mスクロースを混ぜ合わせます。各混合液をポリエチレン製超遠心管に移し、1.1 molar sucroseで10 millilitersまで満たします。次に、0.9 molar sucroseを慎重に重ねます。管を冷却済みのバケットに移し、buffer Bでバランスを調整します。バランスを調整したバケットを冷却済みのローターに装着し、100,000 Gsで遠心分離を行います。4 °Cで3時間処理することで、リボソームとRNAが懸濁脂質の下にペレットとして回収されます。ミエリン浮遊スピンの後、上澄み液を除去し、リボソームを含むペレットをバッファーBで溶解します。次に、NanoDrop装置を用いて、リボソーム溶液の260ナノメートルの吸光度を測定します。これらの値から全RNA濃度を推定します。その後、サンプルを調製済みのショ糖密度勾配に転移させます。勾配を乱さないように注意し、コントロールとして空の勾配を含めてください。以前と同様に、サンプルを用いて冷却バケットのバランスを調整します。その後、遠心分離機を 285,000 Gs、4 °C で1時間半、運転させてください。遠心分離機が回転している間に、フラクショネーターを準備します。まず、UVランプの感度を設定します。次に、チューブピアサーをフラクショネーターに取り付け、チューブを介して60% sucroseのボトルに接続します。間にローリングポンプを挟み、ショ糖を1 mL/minの速度でフラクショネーターに送り始めます。気泡の原因となるエアリークがないかを確認し、シール部分を締め直してください。次に、グラジエントバッファーをUV検出器に手動でポンプ注入し、ベースラインを設定します。超遠心機からサンプルを慎重に、衝撃を与えないように取り出した後、分画装置にセットし、ピアッサーでチューブの底部に穴を開けます。60% sucroseのポンプ送液を開始し、勾配をUV検出器経由でドロップディスペンサーへと押し出します。260 nanometersにおける吸光度プロファイルを記録してください。ドロップディスペンサーから2 mLチューブに20分画を回収します。1分画あたり600 µLを回収し、各分画のサンプルグラジエントを10% SDSで最終濃度1% SDSになるように処理し、よく混合します。次に、酸性フェノール・クロロフォーム抽出法を用いてRNAを単離します。室温の酸性フェニルクロロホルムを1容量加え、チューブを65 °Cで10分間加熱します。加熱後、圧力を逃がすため、ドラフト内で慎重にバイアルを開けてください。その後、分画物を室温で17,000 ×gで20分間遠心分離し、ショ糖層の上または下に位置する水相を回収します。次に、等量のイソプロパノール、9分の1量の酢酸ナトリウム、および1 µLのglyco blueを加えます。-80 °Cで少なくとも1時間RNAを沈殿させ、遠心分離によってペレット化します。その後、冷却した80% ethanolでペレットを1回洗浄し、再びRNAをペレット化した後、ペレットを風乾させ、水に再懸濁してダウンストリーム解析に進みます。あるいは、サンプルを使用時まで-80 °Cで保存することも可能です。ブランクのショ糖密度勾配では、DTTの存在により260 nmでいくらかのバックグラウンド吸収が認められます。サンプル値を標準化するために、データ解析時にこのバックグラウンドを差し引くことができます。脳および脊髄のRNAプロファイルは特徴的な吸収曲線を示し、小型リボソームサブユニットに結合したmRNAは、プロファイルの早い段階に現れる低密度の画分に沈降します。これらに続いて大サブユニットのリボソームが現れ、単一のmRNAに結合したリボソームが溶出します。複数のリボソームが結合したmRNAは、より後方の分画で沈降します。サンプルをEDTAで処理するとポリリボソームのピークが消失したことから、この沈降プロファイルが翻訳によるものであることが実証されました。翻訳に関する細胞型特異的な研究を行うために、Ribot attackやtrapなどの追加手法を本手法に組み合わせることが可能です。この開発を経て、本手法は神経生物学分野の研究者が、ニューロンの発達および疾患における翻訳制御の役割を探索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、少量のCNS組織からポリソーム分画を行い、任意のダウンストリームアプリケーションに向けてRNAを精製する方法について、十分に理解できるはずです。

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