多剤耐性を実証結核菌増幅マイクロアレイ

次の実験の全体的な目標は、増幅マイクロアレイを使用して、多剤耐性結核菌の遺伝子型を決定することです。これは、単一のマイクロ流体反応チャンバー内のマイクロアレイ上でマルチプレックス非対称PCRを行うことによって達成されます。そこで、サンプルは同時に増幅され、ラベル付けされたサイズが選択され、一本鎖化され、マイクロアレイにハイブリダイズされます。

次に、マイクロアレイを洗浄した後、リーダーは、結核菌が存在するかどうか、およびリファンピンイソ、ニアジエタンブトール、またはストレプトマイシンに対する耐性を付与することが知られているDNA変異が含まれているかどうかを示します。この方法が既存のマイクロアレイラインプローブや核酸ハイブリダイゼーション法よりも優れている点は、増幅マイクロアレイがユーザーとテストの相互作用を大幅に簡素化することです。それでも、PCRの分析感度とマイクロアレイのマルチプレックス能力を提供しながら、この手順では、除染液で清潔なワークスペースを拭き取り、マルチプレックスPCRに十分な純度の核酸を用意してください。

すべてのストック溶液を解凍して混合した後、PCRマスターミックスを組み立てます。この混合物を調製するときは、ここに示す結核検査用に少なくとも1つの追加の混合物を作成します。また、マスターミックスにTポリメラーゼを追加します。

ストック試薬に付属するタックの量に加えて、マスターミックスの49マイクロリットルにサンプルDNAの1マイクロリットルのアリコートを混合する。各反応混合物の48マイクロリットルを適切なマイクロアレイの中心に慎重に追加します。マイクロアレイ自体には触れないでください。

次に、マイクロアレイを不適切に慎重に覆って密封します。カバースリップを適用すると、気泡が発生し、アーティファクト、蒸発、増幅不良、または不均一なハイブリダイゼーションにつながる可能性があります。これらの条件のいずれかが誤った結果につながる可能性があります。

次に、マイクロレートをサーマルサイクラーにロードします。基板をヒートブロックに逆らった状態で、加熱蓋オプションをオフにする必要があります。普遍的なPCRの予防措置に従うラボでは、スライドごとに複数の増幅マイクロアレイを含め、複数のテストを同時に処理する方が効率的です。

次に、適切なサーマルサイクリングプログラムを実行します。このプログラムには50回の増幅サイクルがあり、これは高いように見えるかもしれませんが、反応によって生成される主に一本鎖アンプリコン集団のために必要です。反応が完了したら、マイクロアレイを取り外し、サーマルサイクラーをシャットダウンします。

マイクロアレイチャンバーをフラットと鉗子で慎重に開きます。スリップ、カバー、ガスケットを取り外します。このステップでマイクロアレイが損傷する可能性があるため、不適切に注意してください。

ガスケットアセンブリを取り外すと、マイクロアレイが物理的に損傷する可能性があります。カバースリップを曲げたり曲げたりしないように注意し、鉗子でマイクロアレイの表面を傷つけないように細心の注意を払い、次にマイクロアレイ基板を組織学スライドホルダーに移します。基板を室温で10分間、穏やかに攪拌しながら洗浄バッファーに浸し、洗浄液浴に続いてさらに2〜3回の洗浄を行い、すべて脱イオン水で行います。

イメージングに進む前に、マイクロアレイを乾燥させます。このデモンストレーションでは、穏やかな圧縮空気の流れをこの目的に使用でき、パラメータはMDR TBテストとEcon DX 2100フィールドポータブルイメージャーに固有のものです。イメージャーの青いライトは、準備ができていることを示します。

コンピュータの電源を入れます。conniから提供されたシステムソフトウェアを開き、ソフトウェアがカメラとの接続を確立したことをアナウンスするのを待ちます。次に、乾燥させたマイクロアレイをイメージャーに挿入します。

マイクロアレイをレンズに向け、ユーザーから遠ざけます。これで、ソフトウェアはドロップダウンメニューからプレビュー画像を提供します。MDR TB 分析スクリプトを選択します。

露出時間を 100 ミリ秒から 500 ミリ秒の間で入力します。露出オーバーのピクセルが読み取られます。露出を調整して、それらを最小限に抑えます。

彩度が露出過多を最小化するように設定されている場合は、解析を開始します。このソフトウェアは、画像スコア、サンプル、バックグラウンド強度にMDRT TBグリッドを配置し、薬剤耐性とジェノタイピングの結果を報告します。分析が完了して保存されたら、チップをイメージャーから取り外し、新しい分析セッションを開始して次のアレイを分析します。

処理された各マイクロアレイについて分析を続けます。毎回データを保存します。定性的な画像解析は、自動画像解析ソフトウェアによって生成されたデータテーブルで特定するのが難しい実験的なノイズや変動の原因に関する洞察を得ることができます。

ここでは、アーティファクトのない高品質の配列が見られます。いくつかのアーティファクトは、ハローを作成する泡の導入につながる可能性があります。配列のアーティファクトがあっても、ソフトウェアはスキャン中の値を取得します。

診断レポート アルゴリズムは、値を取得したにもかかわらず、この配列を無効と認識しました。野生型H 37 RAゲノムDNAの希釈シリーズを、1, 250細胞に相当する6.25ピコグラムのマイクロアレイPCRテンプレート上で使用しました。すべてのプローブが検出されました。

SNR値が3を超えると正の結果が得られ、登録値ははるかに高かった。次に、世界保健機関(WHO)の参照分離株を遺伝子型決定した。アレイ上に存在する一塩基多型は、MDR TBゲノムの対応する変異として検出されました。

また、近傍変異を検出した例もいくつか明らかでした。議論はテキストプロトコルで提供されます。この手法を習得すると、DNAの濃度、特異的アッセイ、サーマルサイクラーの効率と均一性、および望ましい分析的または臨床的感度と特異性に応じて、約3時間半から6時間半で行うことができます。

また、増幅サイクル数と増幅後のハイブリダイゼーション時間は、所望の性能特性を得るために容易に短縮または延長することができる。