Name: DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶDNA折り紙によるバイオ応答ロボットの作製とTEMによる可視化手法。ナノスケール構造の自己組織化と精製プロトコルを習得し、標的薬物送達やバイオセンシングへの応用基盤を築く。

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著者は有用な議論や作業のための非常に貴重な議論と助言し、バチェレラボのすべてのメンバーのためのS.ダグラスに感謝したいです。この作品は、生命科学の学部とバー - 宜蘭大学のナノテクノロジー＆アドバンストマテリアル研究所からの助成金によってサポートされています。

ステープルズプール混合物の調製<ol><li> 表1に記載された96ウェルプレート上に凍結乾燥したDNAナノロボットのステープルを注文（材料を参照）、10ナノモルに正規化します。 DNAのナノロボットの設計とアーキテクチャの詳細についてはベン・Ishay ら 14、ダグラスらを参照してください。15）。 </li><li> 100μMの濃度にDNアーゼ/​​ RNaseフリーの超高純度でうまく各ステープルを再構成します。ステープルが10ナノモルに正規化するために、超純水100μlで再構成します。 </li><li>プール一緒にマルチチャンネルピペッターおよび滅菌55ミリリットルソリューション流域を使用して、各ステープルの20μlの。 注：ナノロボットの形状（コア、エッジ、ハンドルおよびガイド配列を含む、 表1）254短 ​​鎖から構成されているので、ステープル・プール内のステープルの各々の濃度は394 nMです。ステープルプールからステープルを削除するか、別の巻でのいくつかを追加しますリューム、かなりの収率を減少させる、またはそれ以外の場合は折り畳まれていない集合体になることがあります。 </li></ol>製作反応混合物の調製<ol><li>標準的な反応混合物について（材料を参照してください 、100 nMの原液）足場DNAの4ピコモルに対応し、M13mp18のウイルスゲノム環状一本鎖DNAを40μlを使用しています。製造混合物中の足場の最終濃度は20 nMで、最終容量200μlのです。 <ol><li>具体的なニーズに応じて足場DNAの量を調整します。しかしながら、一定の20 nmで反応混合物中の骨格DNAの最終濃度を保ちます。 </li></ol></li><li>それぞれ、1〜10のステープル比に足場に到達するためにステープルを加えます。 20nMの足場DNA濃度について、ステープル254 &#39;の最終濃度の各々は、200nmです。 200μlの最終反応容量についてステープルプール混合物（セクション1.2）の102μlを添加します。 <ol><li>目に別々に特定のゲート列を追加します。Eは、この時点で、反応混合物を折り畳みます。これらのオリゴは別途注文し、HPLC精製を必要としています。 20 nMの足場濃度について各オリゴのすなわち 200 nMの、ゲートオリゴ1:10足場ゲートにシーケンス比で存在することを確認してください。 200μlのフォールディング反応容量については、100μMのストック濃度で4門オリゴのそれぞれについて、0.4μlを添加します。 </li></ol></li><li> 1×TAE（40mMのトリス - 酢酸、1mMのEDTA）の最終濃度に到達するために10倍TAEストック緩衝を追加します。 200μlのフォールディング反応容量の場合、10倍TAEの20μlを添加します。 </li><li> 10mMの最終濃度まで、1MのMgCl 2を加えます。 200μlのフォールディング反応容量は、1 MのMgCl 2の2μlを添加します。 </li><li> 200μlの最終容量に到達するためのDNase / RNaseを含まない超純水36μLを加えます。 </li><li> PCRバイアルにボルテックスし、アリコート100μlのサンプル。 注：使用される最大反応体積に関するサーマルサイクラーの仕様を参照してください。これらの制限を満たすために音量を小さくすると得られた収率は減少しません。指定された最大上記の反応ボリュームは利回りを危うくします。 </li></ol>製造反応の3高温アニールのランプ<ol><li>以下のようにプログラムサーマルサイクラー： <ol><li> 5分/℃の割合で60℃まで85℃に上昇します。 </li><li> 75分/℃の割合で4℃まで60℃に上昇します。 </li><li>無期限に4℃で保持します。 </li></ol></li><li>製造後に-20℃で保存するサンプルを終了しました。 </li></ol>過剰ステープルズの4取り外し<ol><li> 100キロダルトンのMWCOと0.5ミリリットル遠心分離フィルターにフォールディング反応混合物の100μLを加えます。後の分析のためにnanorobots予備精製の10μlのサンプルを保存します。 </li><li> 9,600×gで10分間遠心。 </li><li>フォールディングバッファー（1×TAE、10のMgCl 2）400μlのを追加します。 </li><li>繰り返し二回より4.2と4.3を繰り返します。 </li><li>9,600×gで5分間遠心。 </li><li> 9,600×gで1分間きれいなマイクロ遠心チューブやスピンに逆さまにフィルタを配置することによって濃縮物を回復します。最終容積は、フィルタに入れ、製造の反応混合物の初期量に依存して変化し得ます。典型的には、濃縮されたナノロボット試料25-60μlの最終容量を得ました。 </li><li> 260nmで分光光度計を経由して試料中のDNA濃度を測定します。ナノロボットサンプルのモル濃度を算出する際に5.3μgの/ピコモルの分子量を使用してください。 注意：二本鎖DNA、50μgの/ OD 260のためのモル吸光係数を、ほとんどのアプリケーションで十分です。 48μgの/ OD 260は、エッジのステープルの口座に一本鎖DNAが伸びポリチミンを取ります。 </li></ol>二つ折りNanorobotsの5アガロースゲル電気泳動分析<ol><li> 0.5×TBE（45mMのトリス-ホウ酸、1mMのEDTA）を10mMのMgCl 2を補充した2％アガロースゲルの調製</suB&gt;（エルネスト・カストロらから適応21。）： <ol><li> ddH 2 Oの118.75ミリリットルで10倍TBEストック緩衝の6.25ミリリットルを希釈することにより、0.5×TBE緩衝液を準備</li><li> 0.5×TBEバッファーの125ミリリットルで、アガロースの2.5グラムを溶解します。 </li><li>アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで煮。 </li><li> 10mMの最終濃度になるように、1MのMgCl 2の1.25ミリリットルを追加します。 </li><li> 10 mg / mlの臭化エチジウムの7μLを加えます。 </li><li>少しクールを解決するために待って、アガロースゲル固化する前にゲルトレイを埋めます。すぐに目的の櫛をインストールします。 </li><li> ddH 2 Oを 940ミリリットルに10倍のTBEストック緩衝し、1MのMgCl 2の10ミリリットルの50ミリリットルを追加することで、ランニング緩衝液1 Lの0.5倍のTBEを準備</li><li>ゲル電気泳動デバイスにバッファを実行している固体のアドオンで、氷浴中にデバイスを入れたら。 </li></ol></li><li>足場と一緒nanorobots予備精製の負荷1μgの全DNA（ステップ3.2）、および精製後（ステップ4.7）、ゲル上のDNAサンプルと1 kbのDNAマーカー。 例を図2に示す 。試料の実際の体積は、精製後に得られた濃度に依存します。 6、最終体積比：各サンプルは1でローディングバッファーにロードされます。 </li><li> 80 Vに電源​​を設定し、3時間ゲルを実行します。氷と水で満たされた浴中でゲルを実行します。 Nanorobotsは展開し、アガロースゲル電気泳動中に熱くなる場合スメアとして表示されます。電気泳動時の加熱からデバイスを保つために、追加の氷を追加します。 </li><li>紫外線テーブル上のビューゲル（ 図2）。 </li></ol>ウラニルギでナノロボットの6陰性染色<ol><li> 2％のウラニルギストック溶液の調製（カストロらから適応23）： <ol><li> 15ミリリットルチューブにウラニルギ粉末100mgを秤量します。 </li><li> 3分間沸騰のDNase / RNaseを含まない超純水は、脱酸素化物をします。 </li><li>脱酸素したお湯（〜60℃）の5ミリリットルを追加します。（前のステップから）ウラニルギ粉末を含む15mlチューブに。しっかり開閉蓋、10分（渦に締めチューブ）のために厳密にアルミ箔と渦に包みます。溶液は黄色の色で濁って表示されます。 </li><li> 0.2μmシリンジフィルターで濾過してソリューションを提供します。溶液は透明になるはずです。 </li><li>小分けマイクロ遠心チューブに溶液200μl。 </li><li>チューブの底のプールサンプルにテーブルトップ遠心機で5分間最大速度で遠心。 </li></ol></li><li>グリッドとネガティブ染色への試料のローディング： <ol><li> （セクション6.1で調製した）2％ウラニルギ溶液200μlアリコートを解凍。 3分間厳密に0.5 M NaOH溶液と渦の10μLを加えます。テーブルトップ遠心機を用いて5分間、最大速度で遠心。 </li><li>一方、グロー放電グリッド0.2ミリバールと30秒25 mAで部屋の空気を使用して。 </li><li>精製後2 nmのナノロボットサンプルの15μlのを追加（secti4.7の）鉗子で開催されたグリッド（）の上面上に、1分間に吸収させます。ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。 </li><li>すぐにろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用しています。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>繰り返しは6.2.4と6.2.5を繰り返します。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。染色溶液を30秒間吸収しましょう​​。 </li><li>ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>グリッドは、少なくとも30分間完全に乾燥TEMに注入する前に、ろ紙上に直面しよう。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています、15,22。 説明した製造プロトコルは、一般的に折り紙の形状の広い範囲を折るために私たちの研究室で使用されている低速のアニーリングランプを使用しています。生産時間は、Sobczakのら迅速な折りたたみプロトコルとして重要な要因の他のプロトコル、になった場合。24を使用することができます 。このプロトコルは、しかし、それは各折り紙の形状のためのキャリブレーションを必要とし、高収率で折り紙の折り畳みを達成することが報告されています。 スピン濾過を過剰ステープルからロボットを精製するために使用されます。 Sをロードする場合サンプルまたは緩衝液を用...

核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ2の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション3およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。 足場のDNA折り紙9技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 ​​な2D / 3Dナノアーキテクチャ10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 ​​な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno 13などのCADツールの開発を可能にしました。 これまで我々はcaDNAnoツール14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡（TEM）を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor 16,17またはDNAの鎖置換技術18のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。 初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団15内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。 ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラスら 15によって示さanorobot製造プロセス。

<table><tbody><tr><td>DNase/RNase 遊離蒸留水</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA 足場</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml 遠心フィルター 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>プロメガ</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBEバッファ</td><td>プロメガ</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド10&nbsp;mg/ml 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA マーカー</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>ローディング染料</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>ウラニルギ酸</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>カーボンコーティング TEM グリッド&nbsp;</td><td>科学サービス</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー c1000 タッチ</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グロー 放電 K100X</td><td>エミテック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVテーブル ゲルドック EZイメージャー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ 2000c</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>テクナイ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動（AGE）を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡（TEM）により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。

代表的な結果を図2Aに示されています。すべてのレーンは、分光光度計（OD 260）を介して測定し、合計1μgのDNAが含まれています。環状一本鎖DNAの足場（レーン2）と比較して、nanorobotsは、それらのより高い分子量、骨格DNA（レーン3赤矢印）にステープルハイブリダイゼーションの結果をゲルに妨げられます。レーン3中の低分子量バンドは、足場のDNA（緑の矢印）に結合しなかった過剰ステープルを表します。遠心濾過による精製後、過剰のステープルのほとんどが（レーン4-6）削除され、nanorobotsはハンドル相補鎖14,15,22に共役カーゴ分子でロードされる準備ができています。レーン4-6は、ナノロボットの二量体を表す高分子量バンド（青矢印）、一緒に結合されているnanorobotsの人口が含まれています。潜在的のRedu（5または10のいずれかnmの）製造手順における足場の濃度を低減することができますこれらの高分子量構造物の相対量を、CE。レーン記載の精製プロトコルにわずかな変動で4-6ショーnanorobots精製...

DNAオリガミは、DNA分子の自己組織化をプログラムすることにより、精密なナノスケールの物体を製造するための強力な方法です。ここでは、DNAオリガミからの生体応答型ロボットのフォールディング、その精製、および透過型電子顕微鏡イメージング(TEM)のためのネガティブ染色のプロトコルについて説明します。

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、2次元（2D）前駆体から、パターン化と再構成可能な粒子の合成の実験の詳細を説明します。この方法論は、ミクロからセンチメートルスケールに至る長さスケールで多面体と把持装置を含む、様々な形状の粒子を作成するために使用できます。...

折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

DNA折り紙は、DNA分子の自己集合をプログラムすることにより、正確なナノスケール物体を製造するための強力な方法である。ここでは、DNA折り紙、その後、所望の効果に中継生物手がかりを感知し、シフト形状によって対応できるロボットのロボットを設計するために利用することができる方法について説明します。...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

DNAタイリングは、プログラム可能なナノ構造を作成するための効果的なアプローチです。本稿では、一本鎖DNAタイルの自己組織化により複雑な二次元形状を構築するプロトコールについて述べる。...

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

ベンチトップRCA洗浄や酸化ケイ素の誘導体化など、DNAオリガミ研究で使用される基質の再現性のある洗浄プロセスが説明されています。表面調製、DNA折り紙の堆積、乾燥パラメータ、および簡単な実験セットアップのプロトコルが示されています。...

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

ここで、液体ハンドリング ロボットのクローン DNA のモジュラー アセンブリの方法を使用してモジュールの DNA「デバイス」アセンブリを実行する自動化されたワークフローが表示されます。プロトコルは、組合せの DNA デバイス ライブラリ世代は、我々 の 2 つの液体処理プラットフォームを使用して例を示す液体ハンドラー候補リストを生成するための直感的なソフトウェア...

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン...

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

ここでは、DNA 折り紙系ナノ構造天然カチオン性多糖類のキトサンと合成線形ポリエチレンイミン (LPEI) コーティングを使用して Mg 枯渇やヌクレアーゼ リッチ ・...

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

金ナノロッドの DNA 折り紙ベース アセンブリに強いキロプティカル特性をもつキラル プラズモニック metamolecules の詳しいプロトコルについて述べる。プロトコルは、キラル構成に限定されない、様々 なプラズモニック...

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

ここでは、DNA折り紙形状を誘導テンプレートとして用いて基質上に離散的で正確な無機ナノ構造を作成するプロトコルについて述べた。この方法は、透明基板(サファイア)上にプラズモニックゴールド弓形アンテナを作成することによって実証されています。...

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

このプロトコルの目的は、DNA折り紙ナノ構造上の分子モーターのアンサンブルを形成し、全内部反射蛍光顕微鏡を使用してアンサンブル運動性を観察することです。...

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

学ぶDNA折り紙によるバイオ応答ロボットの作製とTEMによる可視化手法。ナノスケール構造の自己組織化と精製プロトコルを習得し、標的薬物送達やバイオセンシングへの応用基盤を築く。

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

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