Name: 構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 学ぶ構造化照明顕微鏡を用いたラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘の超高解像度画像化法。GFP標識と3D再構成により、シナプス可塑性の形態変化を詳細に解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、CPFに科学研究費オランダ機構（NWO）からビディ承認番号H64.09.016によって賄われた。 CPFは、最終原稿の彼女の批判的コメントと修正のための博士SilvinaさんA. Fratantoniに感謝です。 GMRDL / EMMM NWOの一部であり、オランダの技術振興財団STW（プロジェクト12151および11350）によってサポートされており、その一部は経済省によって資金を供給されています。私たちは、援助と支援のため、ニコンインスツルメンツヨーロッパBVのキャサリンクリストファー·ピーターDrentに感謝します。 HX助成科学研究費オランダ機構（助成820.02.006）によってサポートされていましたロイヤル·ダッチ·芸術科学アカデミー（助成11CDP10）とWTによってサポートされていました。

<ol><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).</li>
<li>Dailey, M. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+dendritic+structure+in+developing+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices.</a> J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61, 85-100 (2009).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitr%C3%A4ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.</li>
<li>Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I5M%3A+3D+widefield+light+microscopy+with+better+than+100+nm+axial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution.</a> J Microsc. 195, 10-16 (1999).</li>
<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+3568+Optical+Biopsies+and+Microscopic+Techniques+III%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).</li>
<li>Karadagliƒá, D., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+formation+in+structured+illumination+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy.</a> Micron. 39, 808-818 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).</li>
<li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat Methods. 6, 339-342 (2009).</li>
<li>James, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+microcontact+printing+of+micrometer-scale+poly-L-lysine+structures+for+controlled+growth+of+cultured+neurons+on+planar+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).</li>
<li>Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+detailed%2C+cell-specific+neuroanatomy+of+dendritic+spines+using+microinjection+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).</li>
<li>Fitzsimons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+the+glucocorticoid+receptor+alters+functional+integration+of+newborn+neurons+in+the+adult+hippocampus+and+impairs+fear-motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior.</a> Mol Psychiatry. , (2012).</li>
<li>van Hooijdonk, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+transgene+delivery+to+the+hippocampus+reveals+sub-field+specific+differences+in+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression.</a> BMC Neurosci. , (2009).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Izeddin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dynamic+imaging+of+dendritic+spines+using+a+low-affinity+photoconvertible+actin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この記事では、SIMを使用して、in vitroで培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘の作業プロトコルが記述されている。初代海馬神経細胞培養法は、Kaechとバンカー18で説明した独自の方法を最適化したものです。主な違いは、をNeurobasal/B27培養アストログリア細胞フィーダー培養の必要性を排除する媒体、およびグリア細胞の増殖を抑制しつつ、ブリューワーら 19によって記載されるように、ニューロンの生存を促進し、3日目、有糸分裂阻害剤FUDRの添加の使用である。 プロトコルには多くの重要なステップがあります。細胞をめっきするために使用されるカバーガラスの厚さは、正確なSIM実験のために重要である。カバースリップの準備と塗布時の無菌性は重要です。ポリ-L-リシンで処理したカバースリップが2.3と2.4の間に乾燥させてはいけない。ステップ5.8で使用される難研磨ピペットの直径が非常に重要です。あまりにも細い先端は後の段階での低細胞の生存率になります。可能な限り迅速に海馬の単離は、高細胞...

樹状突起棘は、ニューロン膜の小さな突起である。この特徴的な構造は、典型的には、単一のシナプスからの入力を受信するように特化され、2つのニューロン間の物理的接触面積を表している。最も機能的に成熟した樹状突起棘は、球状チップで構成されて頭と呼ばれ、樹状シャフトにヘッドを接続している細い首。しかし、棘は静的ではなく、積極的に移動しても、成人の脳2で連続的にその形態を変更してください。時間の2週間の期間内に、後半胚または出生後早期の時間に由来したラット初代海馬ニューロン培養は、背骨状の構造3への早期糸状仮足から進化し、多数の膜突起を持つ複雑な樹状アーバーを開発しています。この動的挙動および他の特性に基づいて、樹状突起棘は、メモリ記憶およびシナプス伝達のために、4,5の解剖学的基質を提供すると考えられている。 目の与えられた樹状突起棘の大きさと形状がシナプス機能で、それは正確に寸法を測定することが重要ですしていることをE重要な役割。棘は、長さが約200〜2000ナノメートルまで変化と容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。しかし、長さ以外の脊椎の寸法は、理論的には200ナノメートル6周りの回折によって固定され、通常は従来の光学システム「解像度を下回っている。これらの解決の力は、脊椎のネックとヘッドの幅など細かい詳細を画像化するには不十分である。多くの研究は、この問題を解決するために専用されており、多くの比較的新しい超解像顕微鏡技術は、実質的な進歩を提供した。特に、広視野、非共焦点顕微鏡7-10に横方向に構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して任意の発光光を廃棄することなく、古典的な限界を超えた分解能を達成することができる。非リネアと組み合わせてこの技術を用いてr個の顕微鏡技術は、無制限の因子11によって光学顕微鏡の方位分解能を向上させることが理論的に可能である。しかし、ほとんどの実験状況で、SIMは2 1倍に解像限界を超えることができます。このような誘導放出の枯渇（STED）顕微鏡12と光活性化局在化顕微鏡法（PALM）12のような他の超解像光学顕微鏡技術は、樹状突起棘の撮像に適用されている。例えば、PALM等の局在に基づく方法は、超解像を達成するために、原画像の非常に多数を必要とするので、速度が制限される。一方、STEDは、高い画像形成速度を達成することができ、比較的低い光子カウントとSIM 13には当てはまらないかもしれない視野の小さな分野、ではあるが。 この記事では目的は、 試験管内で培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘に努めプロトコルを提供するものである</EM&gt; SIMを使用。ラット初代海馬ニューロン培養の確立、開発、トランスフェクションおよび免疫組織化学からなる最初の1とイメージングをサンプリングするために専用の後期相：プロトコルは、2つの区別可能な段階で構成されています。

<table><tbody><tr><td>細かい鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大きな鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大きなはさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鈍いヘラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>照明</td><td></td><td></td><td></td>付き解剖顕微鏡</tr><tr><td>光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &度;Cウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流 細胞培養フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高温ドライオーブン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター (5% CO2, 37 &deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>ニコン構造化照明顕微鏡セットアップ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーフェクトフォーカスシステム</td><td></td><td></td><td></td>ニ</tr><tr><td>コンCFIアポTIRF 100倍油対物レンズ(N.A.1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4コヒーレントサファイアレーザー(458、488、514、561 nmの励起波長)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIMイルミネーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、ニコンステージコントローラーMCL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノドライブピエゾコントローラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、ニコンインテンシライトC-HGFIE水銀ランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM顕微鏡エンクロージャー温度制御</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor EM-CCDカメラiXon DU897</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC、Microsoft Windows 7 Home Edition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon's NiS Elements 6.14 SIMソフトウェアパッケージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコンタイプA 浸漬油</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

樹状突起棘は、ニューロンの樹状突起から出た突起であり、脳内の興奮性の入力の主要なシナプス後目標を表すものです。技術の進歩は、ニューロンの接続性とシナプス可塑性において重要な要素として、これらの構造を同定した。光学顕微鏡を用いてスパイン形態の定量分析は、光の固有屈折限界に関連する技術的制限による本質的な問題のまま。樹状突起棘は、容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。長さ以外の脊椎寸法は、通常、200nmの光学顕微鏡法の理論的な解像限界により固定され、従来の光学分解能よりも小さいので、棘の形状及び大きさの微妙な変化を測定することは困難である。 いくつかの最近開発された超解像技術は、樹状突起棘を含む200nmよりも小さい画像の細胞構造に使用されてきた。 Tヘセ技術は、古典的なファーフィールドの動作に基づいており、したがって、既存の試料調製方法の使用を可能にし、試料の表面を越えて画像にしている。ここで説明するには、初代海馬ニューロン培養中の樹状突起棘の画像に超解像構造化照明顕微鏡（SIM）を適用するための作業プロトコルです。 SIMの可能なアプリケーションでは、共焦点顕微鏡のものと重複する。しかし、2つの技術が異なる適用可能性を提示する。共焦点顕微鏡は、物理的なピンホールの使用にフォーカス光のうちの除去を犠牲にして高解像度化を実現しながら、SIMは、より高い実効横方向の解像度を提供しています。このプロトコルでは、一次ニューロンは、DNAプラスミドは、蛍光タンパク質をコードし、SIMを使用して撮像をトランスフェクトした標準プロトコルを使用して、ガラスカバースリップ上で培養される。樹状突起棘の際に、in vitroで 16〜17日後に画像化されているため、ここに記載さ全体プロトコルは、約2週間かかります樹状開発が最適である。プロトコルの完了後に、樹状突起棘は、特殊なソフトウェアを使用してSIM画像スタックの一連の3Dで再構成することができる。

ここで説明するには、SIMを使用して、in vitroでラット初代海馬ニューロンからの樹状突起棘を画像化するための標準化された作業用のプロトコルです。プロトコルのワークフローとその重要なステップは、 図1に示されている。全体的に、プロトコルは、培養、開発およびラット初代海馬ニューロン及び免疫組織化学のトランスフェクションを含む、試料調製の第一段階で分離した実験研究の約2週間かかり、および第2の相標本撮像のSIMを使用する。ニューロンは、多数の樹状突起棘の3,5ベアリング複雑な樹状アーバーを開発したとき、ラット初代海馬ニューロンは、2週間培養開始後約固定されている。セクション1-8に詳細に記載されているプロトコルを用いて、超解像で系統的に樹状突起棘に可能である。 16前に記載されている共焦点蛍光顕微鏡を用いた従来の樹状突起棘撮像方法と比較して、17、SIMを使用して、本明細書に記載されているプロトコルは、初期の糸状仮足から背骨のような構造に至るまで神経細胞膜突起の識別と分類を可能に有意に優れ、画像の解像度と3D再構成が用意...

この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

本手順の全体的な目的は、樹状突起スパインを超解像でイメージングすることです。まず、ラット一次海馬培養細胞を調製し、次にGFP導入および染色によって樹状突起スパインを可視化します。続いて、SIM顕微鏡を用いて、GFP標識された樹状突起スパインを超解像で取得します。最終ステップは、後続の画像解析に向けて、生画像データを3Dに再構成することです。最終的に、超解像で撮像したGFP発現一次海馬ニューロンを用いて、樹状突起スパイン形態の微細な変化を示します。従来の共焦点顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、樹状突起スパインの形態をより詳細に研究できることです。この手法は、樹状突起スパインの形態における分子および薬理学的依存的な変化など、神経科学における重要な未解決問題の検討に役立ちます。構造照明顕微鏡法（SIM）は、試料上にラインパターンを投影することに基づいており、これによりコンピュータプログラムで抽出可能な追加情報が得られ、極めて鮮明な画像が得られるため、ミトコンドリアや細胞内のその他の微小構造を観察することが可能になります。SIM画像の適切な再構成を実現するためには、生データの品質を高めるための手順を詳しく解説する本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。重要な準備ステップとして、滅菌ラミナーフローフード内でカバースリップのコーティングを行います。小型の滅菌鑷子を用いて、個々のカバースリップを12ウェルプレートの各ウェルに配置します。次に、各ウェルにポリリシン溶液を500 µL添加し、カバースリップを完全に浸します。ウェルを洗浄した後、1 mLの播種用培地を加え、細胞を播種するまで最大24時間、組織培養インキュベーター内にカバースリップを保持します。本手順は、当グループの博士課程学生であるHU is SHによって実演されます。ラット胚を分離した後、微細ピンセットを用いて脳から小脳を取り除き、廃棄してください。解剖顕微鏡下で正中線に沿って矢状切開を行い、2つの脳半球を分離します。小型ピンセットを用いて中脳をそっと保持し、中脳を除去します。別のピンセットを用いて、皮質と海馬を含む脳半球の残りの部分をそのまま残します。次に、髄膜を慎重に除去し、海馬が上を向くように組織の向きを調整します。海馬は、その特徴的なC字型の構造によって特定できます。微細ピンセットを用いて海馬を切り出し、新鮮で冷却したone X-H-B-S-Sを入れた新しい30 millimeterディッシュに配置します。すべての胚から海馬を取り出した後、海馬の総数を数え、それらを細かく刻みます。3 mLの1X HBSSを含む15 mL遠心チューブに断片を回収します。遠心分離して上清を除去した後、海馬1個あたり6 µLのトリプシンを加えます。テキストプロトコルに従って海馬断片をインキュベートし洗浄した後、組織片がすべて均一に単一細胞に分散するまで、火炎研磨したパスツールピペットで断片をゆっくりと30回ピペッティングします。気泡が入らないように注意します。次に、37 °Cに予温した播種用培地を5 mL加えます。トリパンブルー生存染色法を用いて細胞数をカウントした後、12ウェルプレートの1ウェルあたり50,000個の細胞を1 mLの播種用培地で分注し、総量を2 mLとします。プレートを揺らして細胞を均一に分散させた後、37 °C、5% carbon dioxideで細胞をインキュベートします。2〜3日後、播種用培地0.5 mLを、10 µM FUDRを含む培養培地と交換します。ニューロンにトランスフェクションを行うには、リポフェクション reagentを添加します。A DNAミックスを滴下して混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。ラミナーフローフード内で、DNAリペクトミー混合物の30分間のインキュベートが終了する10分前に、元の（または1番目の）培養プレートから条件付き培地を2番目の12ウェルプレートにピペットで移し、このプレートを37 °C、5% carbon dioxideで保存します。最初の培養プレートも同様に保存します。細胞の乾燥を防ぐため、馴化培地を速やかに1 mLの予温したインキュベーション培地と交換します。両方のプレートを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターに戻します。30分間のDNA lipectomyインキュベーションが終了すると、DNA lipectomyミックスを細胞に添加できる状態になります。各ウェルにDNAリペクトミーミックスを200 µLずつ静かに滴下し、37 °C、5% CO2で45分間インキュベートします。45分間のインキュベーション後、小型ピンセットを使用して、ニューロンが保持されているカバーガラスを持ち上げます。新鮮で温めたニューロベーサル培地を入れた3 cmディッシュにカバーガラスを浸して洗浄し、ウェルに配置します。条件付き培地を含む2つ目の12ウェルプレートに移します。その後、トランスフェクションしたニューロンを37 °C、5% carbon dioxideで48時間インキュベートします。免疫染色の準備として、カバーガラスが入っているウェルから培地を穏やかに吸引します。次に、樹状突起を損傷させないよう注意しながら、温めた4% PFAを500 µL加えます。細胞をインキュベートし、洗浄した後、1% T-B-S-B-S-A溶液を用いて室温で30分間ブロッキングを行います。再度洗浄した後、希釈した一次抗体を加え、混合して室温で1時間インキュベートします。その後、4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。翌朝、一次抗体を除去し、再度洗浄します。ここからは、カバーガラスを遮光して保存してください。次に、インキュベーション溶液で希釈した蛍光標識二次抗体を添加します。混合し、室温で2時間インキュベートします。次に、二次抗体を除去し、精密ピンセットを用いて細胞を洗浄します。ウェルからカバーガラスを取り出し、余分なTBSをティッシュで拭き取ります。最後に、封入剤を用いてカバーガラスを封入し、マニキュアで密封します。SIMイメージングを開始するには、488 nanometerレーザー、水銀ランプ、ステージコントローラー、ピエゾコントローラー、および透過光用のハロゲンランプの電源を入れます。nsimモードでSIMソフトウェアを起動します。対物レンズに浸油を1滴滴下した後、油滴の中に気泡がないことを確認してください。海馬ニューロンを載せたカバーガラスを顕微鏡ステージに設置します。オイルが試料に接触するまで対物レンズを上昇させます。撮影手順の間、周囲の光から試料を保護するためにステージにカバーを被せ、室内の照明を可能な限り暗くすることを忘れないでください。SIMソフトウェアで光学構成「IFI」を選択し、空のフィルターブロックを選択して、ホワイトライト設定でサンプルのフォーカスを視覚的に確認します。その後、ホワイトライトを消灯し、水銀ランプを点灯させます。シャッターを開き、グリーンフィルターを選択して、十分な輝度を持つ樹状突起を探します。十分な輝度を持つ目的の樹状突起が見つかり、その関心領域が視野の中央に位置したら、シャッターを閉じます。ソフトウェアの光学構成を3D SIM 4 88に設定し、カメラ設定を以下のように設定します。読み出しモードをemに設定してください。ゲインを1 MHz、16 bitに設定します。露光時間を100 millisecondsに設定します。レーザー出力を5%に設定します。EMゲインを200に設定します。フォーカス速度を「extra fine」に設定し、目的の対象に焦点を合わせます。次に、カメラの設定を迅速に以下のように調整します。強度値を 30, 040 から 5, 000 の間に収めるには、レーザー出力を 0% から 20% に設定してください。露光時間は 50 milliseconds から 2 seconds に設定します。読み出しモードをemに設定します。ゲインは1MHz、16bitに設定してください。EMゲインを0から300の範囲で設定します。コンバージョンゲインを1xから5.1xに設定します。ライブ表示のフォーマットをNo Binningに設定します。キャプチャのフォーマットをNo Binningに設定します。次に、NDシーケンスパネルで3つのDZスタックの設定を次のように構成し、範囲を2 µmに設定します。ステップサイズを120 nmに設定し、ホームポジションをクリックします。その後、λセクションで光学構成の3D SIM 4 88を選択します。取得モードとして3D SIMを選択した後、NDシーケンス取得を実行し、生のデータを保存します。ここでは、共焦点顕微鏡およびSIM顕微鏡で撮影された樹状突起と樹状突起スパインを示します。取得したデータは、共焦点画像およびSIM画像から再構成されました。ネック長、ネック径、ヘッド径などの主要なパラメータを調整した後、ソフトウェアを用いて樹状突起のトレースとスパインの自動分類を行いました。囲み部分は、共焦点顕微鏡およびSIM顕微鏡で撮影し、それぞれのZスタックから再構築した個々の樹状突起スパインを示しており、得られた3D再構築の解像度と精度の違いを描出しています。SIMの高い解像度に基づき、頭部と頸部の直径の両方を定量的に解析した結果、同一の樹状突起スパインに対してSIM顕微鏡は共焦点顕微鏡よりも有意に小さい寸法を測定することが明らかになり、SIMが樹状突起スパインの形態におけるより微細な変化を検出できることが示されました。この手順を行う際は、その後の画像再構築の妥当性を高めるため、高品質なRAW画像を取得することが重要です。構造照明顕微鏡法は生細胞イメージングにも有効であり、HeLa細胞、ニューロン、あるいは大腸菌（E. coli）などの細胞ダイナミクスの調査を可能にします。このビデオを視聴することで、一次海馬ニューロンから標準的なサンプルを調製し、超解像で可視化およびイメージングする方法について十分に理解することができるはずです。

imaging-dendritic-spines-rat-primary-hippocampal-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

数々の最近の研究では、脳の病理学に関連したシナプス蛋白の変異を同定した。初代培養皮質ニューロンは樹状突起スパイン形態と運動性にこれらの疾患関連タンパク質の影響を調べることで最大限の柔軟性を提供します。...

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

出典: Gouder, et. al.ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量化J. Vis. 経験。(2015)。このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用した形質導入された免疫標識錐体ニューロンにおける樹状突起棘のイメージングと分析を示します。バックグラウンドノイズが低減され、樹状突起の直径と長さを推定することで樹状突起がトレースされます。自動スパインセグメンテーションには、樹状突起とスパインの寸法のパラメータの設定とスパインの分類が含まれます。3D...

共焦点顕微鏡イメージングを用いた樹状突起棘の定量化

生きている動物のTime-lapse imaging...

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

私たちは、マウスモデルの海馬における樹状突起形成の可視化と定量化のための2つの方法、すなわちリアルタイムイメージングと拡張被写界深度イメージングについて説明します。前者の手法では、高度な地形トレースや分岐範囲の定量化が可能になるのに対し、後者では樹状突起樹のスピーディーな可視化が可能です。...

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。...

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

シリアルブロックフェイススキャン電子顕微鏡(SBEM)は、マウス海馬の樹状脊椎を画像化し、分析するために適用されます。...

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。...

海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

学ぶ構造化照明顕微鏡を用いたラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘の超高解像度画像化法。GFP標識と3D再構成により、シナプス可塑性の形態変化を詳細に解析できます。

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

さらに動画を探す