構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

この手順の全体的な目標は、樹状突起スパインを超解像度で画像化することです。これは、最初にラットの初代海馬を調製することによって達成され、第2のステップは、GFPトランスフェクションおよび染色によって樹状突起スパインを視覚化することです。次に、GFP標識樹状突起スパインの取得をSIM顕微鏡を用いて超解像で行います。

最後のステップは、生の画像データを3Dに再構築し、その後の画像分析に備えることです。最終的に、超解像で画像化された初代海馬ニューロンを発現するGFPを使用して、樹状突起スパインの形態の微妙な変化を示します。この手法が従来の共焦点顕微鏡のような既存の方法よりも優れている点は、樹状突起スパインの形態をより詳細に研究できることです。

この方法は、樹状突起棘の形状における分子および薬理学的依存性の変化など、神経科学における進行中の重要な問題を調べるのに役立ちます。構造化除去顕微鏡法は、サンプルへのラインパターンの投影に基づいており、これにより、コンピュータープログラムで抽出できる追加情報が得られ、非常に鮮明な画像が得られ、MIミトコンドリアや細胞内の他の小さな構造を見ることができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、SIMイメージの有効な再構築を達成するために重要であり、生データの良質なデータを提供する手順を実行するために重要です。

重要な準備ステップには、カバースリップをコーティングし、滅菌された層流フードで作業することが含まれます。小さな滅菌鉗子を使用して、個々のカバースリップを12ウェルプレートのシングルウェルに配置します。次に、500マイクロリットルのポリリジン溶液を各ウェルに追加して、カバースリップを沈めます。

ウェルを洗浄した後、1ミリリットルのめっき培地を加え、カバースリップを組織培養インキュベーターに最大24時間放置してから、細胞をプレーティングします。この手順は、私たちのグループの博士課程の学生であるHUがSHによってデモンストレーションされます。ラットの胚を分離した後、細かい鉗子を使用して脳から小脳を取り出して廃棄します。

解剖顕微鏡で正中線に沿って矢状に切り込みを入れて2つの半球を分離し、1対の小さな鉗子を使用して中脳を優しく保持し、中脳を取り除きます。別の鉗子のペアで、皮質と海馬を含む半球の残りの部分をそのままにしておきます。次に、髄膜を慎重に取り除き、海馬が上を向くように組織の向きを変えます。

海馬は、その特徴的なCS字型の構造によって識別できます。細い鉗子を使用して海馬を解剖し、新鮮で冷たいX-H-B-S-Sが入った新しい30mm皿に入れます。すべての胚からカバカンピを取り除いた後、カバカンピの総数を数え、それらを細かく切ります。

X-H-B-S-Sを3ミリリットル入った15ミリリットルの遠心分離管にピースを集めます。遠心分離して上清を取り除いた後、海馬ごとに6マイクロリットルのトリプシンを追加します。テキストプロトコルに記載されているように海馬の断片をインキュベートして洗浄した後、すべての組織片が単一細胞に均一に分散するまで、火で磨いた牧師ピペットで断片をゆっくりと30回テートします。

泡立ちのないように注意してください。次に、摂氏37度に事前に警告した5ミリリットルのメッキメディウムを追加します。トライアンブルーバイタル染色種子を使用して細胞をカウントした後、12のウェルあたり50,000個の細胞を1ミリリットルのめっき培地にプレートし、総量は2ミリリットルになります。

プレートを揺さぶって細胞を均等に分散させた後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。2〜3日後、0.5ミリリットルのめっき培地を10マイクロモルFUDRを含む培地と交換します。トランスフェクションするために、ニューロンは脂肪切除術を追加します。

A DNAミックスに滴下して混合し、室温で30分間インキュベートします。層流フードにおいて、30分間のDNA脂肪切除混合物の終了の10分前に、インキュベーション、オリジナルまたは第1の培養プレートから第2の培養プレートに馴染ませた培地をピペットで移す12。ウェルプレートを作成し、このプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で最初の培養プレートに保存します。

細胞の乾燥を防ぐために、馴染ませた培地を1ミリリットルの予温インキュベーション培地に速やかに交換しました。両方のプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに戻します。30分間のDNA脂肪切除術インキュベーションの終了時に、DNA脂肪切除ミックスを細胞に加える準備が整います。

200マイクロリットルのDNA脂肪切除ミックスを各ウェルに滴下し、摂氏37度、二酸化炭素5%で45分間インキュベートします。45分間のインキュベーション後、小さな鉗子を使用して、ニューロンを保持しているカバースリップを持ち上げます。新鮮で温かい神経基礎培地が入った3cmの皿に浸してすすぎ、ウェルに入れます。

第2の図12において、コンディショニングされた培地を含むウェルプレート。次に、トランスフェクションしたニューロンを摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートします。免疫染色の準備をするには、カバースリップを含むウェルから培地を静かに吸引します。

次に、樹状突起の損傷を防ぐために、500マイクロリットルの温かい4%PFAを慎重に追加します。細胞ブロックを1%T-B-S-B-S-A溶液で室温で30分間インキュベートおよび洗浄した後、インキュベーションで希釈した一次抗体を添加し、室温で1時間混合してインキュベートします。その後、摂氏4度で一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートします。

翌朝、一次抗体を取り出して再度洗い、カバースリップを光から守ってください。次に、インキュベーションで希釈した二次蛍光標識抗体を添加します。混合し、室温で2時間インキュベートします。

次に、二次抗体を取り出し、細いピンセットを使用して細胞を洗浄します。ウェルからカバースリップを取り外し、余分なTBSをティッシュで乾かします。最後に、封入用剤を使用してカバースリップを取り付け、マニキュアで密封します。

SIMイメージングを開始するには、488ナノメートルレーザー、水銀ランプ、ステージコントローラー、PIZOコントローラー、透過光用ハロゲンランプをオンにします。SIM ソフトウェアを および または nsim モードで起動します。対物レンズに液浸油を一滴垂らした後、油滴に気泡がないことを確認します。

海馬ニューロンと一緒にカバースリップを顕微鏡ステージに置きます。オイルがサンプルに触れるまで、対物レンズを上に動かします。取得手順中は、サンプルを周囲光から保護し、部屋の光をできるだけ暗くするために、ステージにカバーをかぶせることを忘れないでください。

SIMソフトウェアで、光学構成IFIを選択し、白色光設定のサンプルフォーカスで目視検査を行うために空のフィルターブロックを選択します。その後、白色光をオフにし、水銀ランプをオンにします。シャッターを開き、緑色のフィルターを選択して、十分に明るい樹状突起を探します。

十分に明るい関心のある樹状突起に遭遇し、関心のあるセグメントを視野の中央に配置したら、シャッターを閉じます。ソフトウェアを光学構成の3D SIM 4 88に設定し、カメラの設定を次のようにします。読み出しモードをemに設定します。

1メガヘルツの16ビットを獲得します。露光時間を 100 ミリ秒に設定します。レーザー出力を5%に設定し、EMゲインを200に設定します。

フォーカス速度をエクストラファインに設定した状態で、目的のオブジェクトに焦点を合わせます。次のようにカメラの設定をすばやく調整します。30, 040 5, 000 の間の強度値を取得するには、レーザー出力を 0% から 20% に設定し、露出時間を 50 ミリ秒から 2 秒に設定します。

読み出しモードをemに設定します。1メガヘルツの16ビットを獲得します。EMゲインをゼロから300に設定します。

変換ゲインを 1 x から 5.1 x に設定し、ライブのフォーマットを no Benning に設定します。キャプチャの形式を [ベニングなし] に設定します。

次に、NDシーケンスパネルで3つのDZスタックの設定を次のように構成し、範囲を2ミクロンに設定します。ステップ サイズを 120 ナノメートルに設定し、ホーム ポジションをクリックします。次に、ラムダセクションで光学構成、3D SIM 4 88を選択します。

取得モードとして3D SIMを選択した後、NDシーケンス取得を実行し、共焦点顕微鏡とsim顕微鏡でイメージングされた生データ樹状突起と樹状突起スパインをここに示します。取得は、共焦点画像とSIM画像から再構築されました。樹状突起をトレースし、頸部の長さ、首の直径、頭の直径などの主要なパラメータを調整した後、ソフトウェアで脊椎を自動的に分類しました。

ボックスで囲まれた領域は、共焦点顕微鏡とsim顕微鏡で画像化され、対応するZスタックから再構築された1つの個々の樹状突起スパインを示しており、結果として得られる3D再構成の解像度と精度の違いを示しています。SIMによると、頭と頸部の両方の直径の高解像度の定量分析により、sim顕微鏡は同じ樹状突起スパインの共焦点顕微鏡よりも大幅に小さい寸法を測定することが明らかになり、SIMが樹状突起スパインの形態の小さな変化を検出できることを示しています。この手順に参加している間は、同じ画像のより有効なその後の再構築のために、高品質の生の画像を取得することを忘れないでください。

構造化照明顕微鏡は、生細胞イメージングにも効果的であり、hela細胞、ニューロン、大腸菌などの細胞の動態を調べることができます。このビデオを見た後、超解像で一次海馬ニューロンから標準的な説明を準備し、視覚化し、画像化する方法をよく理解しているはずです。