Name: 設定アップ体外モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: 学ぶラットの血脳関門のin vitroモデル構築法。内皮細胞と星状細胞の共培養により高いTEER値と低い透過性を実現し、薬物送達メカニズムの研究に活用できます。

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VECT-HORUSへの財政支援は、フォンユニークInterministériel（FUI / MEDULプロジェクト）から承認され、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR、TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOCとPREVENTAD共同プロジェクト）からとUMR7259の実験室ホルスVEC​​Tする。 UMR7259研究所もCNRSからエクスマルセイユ大学からの財政支援を認めるものです。

ラットアストロサイトの1。生産各調製のためのセックスのどちらかの10新生児のWistarラットを使用しています。 <ol><li>ハサミで頭部を切断したラットを犠牲にし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にすぐに転送します。小脳なしに頭蓋骨から脳を取り出して、冷たい解剖バッファーを含むペトリ皿にそれらをすぐに転送する：HBSSを1％ウシ血清アルブミン（エンドトキシン、BSAの低レベル）、100μg/ mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した。 </li><li> 2大脳半球を分離し、氷上で解剖バッファーで清潔なペトリ皿にそれらを転送するために、半分に脳を切った。視神経をカットし、実体顕微鏡下で髄膜を除去します。 </li><li>冷たい解剖バッファーの50ミリリットルで広く皮質の部分を洗ってください。 </li><li> 15ミリリットルファルコンチューブに3脳からの皮質の部分を配置し、ピペッティングにより解離し、クーデターダウンル回、10 mlの0.05％トリプシン6mlの中に青色チップを備えた使い捨てピペット - EDTA、37℃で5分間0.02％ </li><li> 24 10％FBSを添加したDMEM mlの以下の抗生物質、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの、グリア細胞培地（GCM）という名前のメディア、そして室温で5分間300×gで遠心分離器を追加します。 FBSバッチはアストロサイトcuturesの成長と生存のために選択され、検証された。 </li><li> 75cm 2の Tフラスコ（T75）に10ミリリットルのGCMとプレートの解離した細胞を含むペレットを再懸濁します。細胞の破片やDNAを除去するために、次の日に培地を変更します。週に2回培養液を交換してください。 </li><li>増殖の1週間後、そっとGCM中37℃で24時間の間に60 rpmでオービタルシェーカーでグリア細胞を振る。 T75は、37℃加湿雰囲気において、5％CO 2/95％空気のインキュベーター内に配置できない場合は、5mMのHEPESを含む培地を補う。 R 2回細胞を洗浄非付着性ミクログリア細胞を残したまま削除。 </li><li>播種から3週間後に、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を2回洗浄します。 、温かいトリプシン3mlの0.05％-EDTA 0.02％の追加、37℃でインキュベートし、細胞層が分散するまで待つ（通常は5分）。 8分間、120×gで15ミリリットルのFalcon遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、GCMを10mlを添加してトリプシン活性を阻害する。 </li><li> 90％FBS中で星状細胞ペレットを再懸濁し、10 - 10％のDMSO、液体窒素中で（2×10 6個のクライオバイアル当たり細胞）およびストアクリオバイアルにそれらを転送する。 </li></ol>ラット脳微小血管の2。分離我々の実験手順は、マルセイユの医学部の倫理委員会によって承認され、国家と欧州の規制（EU指令第609分の86）に適合している。すべての努力が動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすために行われた。 <ol><li>各製造方法および1 experimente用R、3 5週齢のWistar系ラットを使用しています。 </li><li>最初の週の月曜日には、両方の無菌培養水に1μgの/ 2程度（T75あたり10ミリリットル）で、IV型コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングすることにより、2 T75フラスコを準備します。微小血管播種まで37℃で接着させる。 </li><li>最初の週の水曜日の朝、頸椎脱臼に続いて、その後、姿勢と呼吸の中断の損失を眠気を誘発するために、CO 2の増加フラックス下にラットを安楽死させる。 70％エタノールで頭をスプレーします。ハサミで頭をカットし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にそれらを転送します。 </li><li>氷上で冷却し、冷たい解剖緩衝液で満たされたペトリ皿にそれらを転送して、小脳および視神経ことなく頭蓋骨から脳を削除する（HBSSは1％のBSA、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの添加） 。 </li><li>用から2大脳半球と別々の脳を分離するために半分に脳をカットebrain。解剖用緩衝液で氷上でクリーンなペトリ皿に前脳を転送します。 </li><li>慎重にN°5の湾曲鉗子で実体顕微鏡下で前脳から髄膜を除去するために冷たい解剖バッファを持つ、新しいシャーレに半球のカップルを取る。その後、ミエリンの羽毛布団を削除して、皮質のシェルを得るために、脳の内部を清掃してください。これらのステップは、組織保存と細胞生存のために2つ以上の時間を取るべきではありません。 </li><li> 20ミクロンに続く異なるクリアランスの2杵のそれぞれとストローク上下に10、71ミクロンで7ミリリットルダウンスホモジナイザー冷解剖バッファーの6ミリリットルに3脳から皮質を解離する。 </li><li>室温で5分間千×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機の1ミリリットル中1皮質と同等のものを得るために、サスペンションを分割。上清を捨てる。 </li><li>コラゲナーゼ/ディスパーゼ（60μg/ mlのRの混合物を含む酵素溶液1mlを1皮質からサスペンションダイジェスト11; 0.3 U / ml）を、DNアーゼI型（35μg/ mlの - 20 K単位/ ml）およびゲンタマイシン（50μg/ ml）を37℃で30分間、シェーカーで</li><li> 1は、25％のBSA / HBSS 1X 10mlで1皮質から消化し、室温で15分間3600×gでの密度に依存する遠心分離による独立したミリリットル混ぜる。慎重にきれいな50ミリリットルファルコンチューブにアッパーディスク（ミエリンと脳実質）、上清を転送し、遠心分離を繰り返します。 4℃で脳の微小血管を含む得られたペレットを保つ</li><li>慎重にアッパーディスク、上清を捨てる。冷HBSS 1X 1mlで脳の微小血管を含む両方の得られたペレットを再懸濁し、きれいな50ミリリットルファルコンチューブに移す。 </li><li> 5分間1,000×gで、20冷HBSS 1X mlの遠心分離を加えることにより微小血管を洗ってください。上清を捨てる。 </li><li> SHで、37℃で1時間の間にステップ2.9で説明したように、さらに同じ酵素溶液1mlを1皮質から微小血管ダイジェストアーカー。 </li><li>その後、1チューブに3皮質のそれぞれから消化微小血管をミックスし、さらにチューブあたり1年半（1.5）皮質に相当から抽出された微小血管を得るために、2 50ミリリットルファルコンチューブに分離。室温で5分間1,000×gでの冷解剖バッファと遠心機の30ミリリットルを追加します。 </li><li> 20％のウシ乏血小板血漿由来血清、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、2 ng / mlの）、ヘパリン（100μg/ ml）を、ゲンタマイシン（50μg/ ml）を補充したDMEM/F12 10ml中の微小血管ペレットを再懸濁およびHEPES（2.5 mM）を、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンで補充した内皮細胞培地（ECM）と呼ば。 </li><li> 、インキュベーターから2コーティングされたT75フラスコを取り、コーティングの過剰を吸引し、1 T75フラスコ（T75フラスコあたり1.5皮質から抽出された微小血管）に各チューブから微小血管プレート。 </li></ol> RBEC Primoculturesの3。精製及び増殖<ol><li>精製：水曜日から金曜日まで、puromを追加ycin培地に4μg/ mlの時。木曜日にメディアを変更します。金曜日に、月曜日までの2μg/ mlで細胞を洗浄し、ピューロを追加します。 </li><li>増殖：第二週の月曜日に、細胞を洗浄し、培養物は第二週の水曜日に90％の集密度に達するまで培養培地にインスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを追加します。 </li></ol> 4分化： インビトロ BBBモデルの設定<ol><li>第二週の月曜日、両方の無菌培養水中の0.5μg/cm2上部コンパートメント内のミックス（500μLでIV型コラーゲンとフィブロネクチンのミックスでコーティングすることにより、フィルター（ポリエチレン、12井戸、孔サイズ1.0μm）を用意と下部コンパートメント内の無菌培養水の1.5ミリリットル）。 RBEC播種まで37℃で接着させる。 </li><li>二週目の月曜日には、5日間共培養の確立の前に、37℃、転送時クライオバイアルからアストロサイトを解凍10ミリリットルGCMと15ミリリットルファルコン中。室温で8分間120×gでサスペンションを遠心分離する。 </li><li> 12ウェルプレート中で1cm 2当たり30×10 3細胞の密度でプレートし、GCMにおける星状細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>第二週の水曜日は、ちょうどトリプシンでRBECの解離の前に、DMEM/F12培地で2回プレコーティングされたフィルターを洗浄。下部コンパートメント内の1.5ミリリットルと上の区画に0.5ミリリットル：ECMとチャンバーを事前に記入してください。 </li><li>二週目の水曜日には、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで二回RBECを洗う。正確に30秒の間にT75フラスコあたりの37℃でのEDTA 0.02％溶液 - 暖かいトリプシン4ミリリットルの0.05％を追加します。その後、トリプシン溶液3.5ミリリットルを削除して、顕微鏡下で観察します。細胞層は、マトリックスからデタッチし始めると、すべてのセルは、フローティングされるまで静かにT75フラスコの端をタップすることで彼らを助ける。 </li><li> T75フラスコあたりのECMの9ミリリットルを加え、15ミリリットルファルコンチューブに移す。非常に静かに細胞を解離黄色のチップを搭載した10ミリリットルピペットで4回上下にピペッティングして懸濁液（溶液中の気泡の発生を避けるため）。懸濁液中の細胞（約3×10 6 cells/T75）をカウントし、すぐに高濃度（160×10 3細胞/フィルターゆえ約18 filters/T75）（ 図8で予備コーティングし、プレフィルフィルターにプレート）。翌日（木曜日）、細胞破片を除去するための上部コンパートメントの二倍の媒体を変更してください。 </li><li>第二週の木曜日、共培養の確立前日、基礎コンパートメントから1月3日馴化培地を補充することができる分化培地（500nmにおけるヒドロコルチゾンとECM）の1.5ミリリットルでアストロサイトの培養液を交換してください前の共培養（内皮細胞とアストロサイトとの間の接触の3日間）の。 </li><li>二週目の金曜日は、分化の0日として定義されます。フィルタコンタから培養培地を交換分化培地でRBEC ining。アストロサイトを含むウェルにRBECフィルターを転送します。これらの条件下で、in vitroモデルは、分化し、3日以内に接合関連タンパク質を発現する。 </li><li>モデルは、第三週の月曜日と水曜日の間、3日以上の間、それらの最適な分化を維持する。 </li></ol>

ミシェル・フレストチャティスキーは、UMR7259研究所の所長であり、バイオテクノロジー会社VECT-HORUSの共同創設者兼科学顧問です。

私たちは、RBECの精製および培養後、さらに特徴的なBBB特性を用いたin vitro BBBモデルを生成するために、初代ラットアストロサイトとの共培養のセットアップ、脳の微小血管の分離と、めっきのための週刊再生可能なプロトコルの実装について説明します。 首尾体外 BBB培養で標準化を確立するプロセスの複数の連続的なステップで最適な条件を必要とする。モデルは、（A） のin vitro BBBモデルの「聖杯」のままで、最低傍細胞透過性を得るために最適化され、（b）の流出およびRMTメカニズムを検証した。 RBECの生産、精製及び増殖 RBEC栽培の最大の課題は、異なる文化間の再現性を達成することである。プロトコルの標準化は、DISのための高品質なツールが必要ですセクション、高品質の試薬および試薬の有効期限に関して。実験者は、皮質表面からの髄膜および大血管の迅速な除去のために実体顕微鏡下で顕微解剖の熟練される必要がある。脳を単離して、機械的に分離されると、大きな課題の一つは、新たに単離した脳の微小血管の最適な酵素消化である。使用される酵素の種類と品質が重要です。バッチ間の低い変動性を有する高濃度のコラゲナーゼ·タイプIとIIとディスパーゼの組み合わせを使用した。また、重要な酵素消化の持続時間および酵素濃度/消化の組織重量/体積の比である。脳の微小血管の生産の最高の収率は30分、1時間、それぞれ、両方の消化中に60μg/ mlので混合ディスパーゼ/コラゲナーゼの1ミリリットル中に1脳から皮質に相当して得られた。 また、重要な細胞を汚染の排除であるS（アストロサイト、主に周皮細胞）。これらの細胞は、内皮細胞よりも速い速度で増殖し、良好な傍細胞拘束性と均一な細胞単層の確立を防止し、後者でタイトジャンクショ​​ンを確立していない。非内皮細胞が除去されている間、脳内皮細胞が微小血管に見出される他の細胞型と比較して、排出ポンプ、特にP-gpのはるかに高いレベルで発現することを考慮すると、それらは、P-gpのリガンド薬物のそれ以外の毒性濃度をより良く耐える。最初の二日間、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンでの処理は、良好な内皮細胞の純度を得るために2μg/ mlの少なくとも2日間続いた。この選択には、細静脈、前毛細血管動脈以上の微小血管からのものと比較毛細血管内皮細胞を支持し、より緊密な単層につながることができます。また、貧しい人血漿由来ウシ血清の使用は、内皮細胞47,48の純粋培養を得ることが不可欠です。プラズマデアived血清は、平滑筋細胞および周皮細胞のために、従って、線維芽細胞に対して分裂促進性である血小板由来増殖因子（PDGF）を欠く。 我々は、マウス由来のIV型コラーゲンの混合物を有するプラスチックとフィルタの治療及びヒトフィブロネクチンは、ラットの尾から伝統的に推奨されるコラーゲンタイプIと比較して、増殖収量の2倍の増加で、重要な利点をもたらすことを観察した。細胞増殖のための重要な手がかりは、インテグリンおよび増殖因子（bFGF）の活性化などの細胞外マトリックス49によって提供される。培地の緩衝液濃度及びpHは、傍細胞気密50に積極的に影響を与えることが記載されており、我々は、少なくとも5mMのHEPES緩衝液を添加して培養物との間の良好な再現性が観察された。 挿入フィルター上の共培養設立：RBECの分化 脳内皮細胞は、BたらEENを精製し、6日間増殖し、これらはフィルター上に播種することができる。高密度細胞播種は完璧な単層を得るために重要である。 12ウェルプレートフィルター当たり160x10 3細胞の播種密度で播種後のコンフルエントな単層を24時間を得るために必要かつ十分であった。しかしながら、その環境からの一次脳毛細血管内皮細胞の単離は、それが一次細胞、および特に脳毛細血管内皮細胞は、強く、環境によって調節および誘導因子はによって産生されることが知られているように、BBB のin vitroモデルの構築におけるパラドックスである異なる周囲の細胞型。脳毛細血管内皮細胞は、単独で急速に脱分化を培養し、いくつかの特定の脳内皮マーカーを失う。このように、一次内皮細胞は、低継代（P1）で使用されるべきであり、再接続された、少なくとも部分的に、星状細胞により馴化星状細胞47,51又は媒体との共培養によるそれらの環境と。これが成立脳内皮細胞とアストロサイトのようなアストロサイト分化のための真の双方向の誘導に関与している。アストロサイトとのRBECを培養するinterendothelial TJ 52,23の強い誘導につながった。再誘導の分子機構はほとんどわかっていない、と研究は、最適な内皮細胞分化53,54を促進することができアストロサイトから分泌される特定の変調因子を特定するためにいくつかの研究室で進行中である。白血病抑制因子（LIF）を含む、脳内皮細胞によって分泌される因子は、アストロサイト分化55,56を誘導することが示されている。共培養の確立の前に、星状細胞を分化グルココルチコイド受容体アゴニストヒドロコルチゾンを含む培地と共培養馴化培地に曝露した。ヒドロコルチゾンは、脳内皮細胞の気密性 ​​を向上させることが知られており、特にラットおよびマウス57 58,59内皮細胞からBBBモデルにおいて使用される。エアコンMEDIウム3日後、内皮細胞/アストロサイトの共培養系の下部区画から回収し、後の使用のために凍結される。共培養条件培地の使用は、2日以上のための最適な傍細胞透過性と文化の間も改善再現性の3日前の内皮細胞分化の時間を減少させた。 全体的に、我々が説明するプロトコルは、0.26±0.11×10 -3センチ最高の一次電池ベースのBBBモデル22と同様/分の300オーム以上の再現性TEER·cm 2であり、平均傍細胞透過係数PE（LY）が得られる12。我々は微小血管酵素消化の提案された変調に本原稿に記載するプロトコルは、ラットの脊髄60から、およびマウス脳から内皮細胞に拡張することができる。 分子·機能解析 加えてTJ誘導のために、星状細胞はまた、脳内皮細胞における61 P-gpのような排出トランスポーターの発現に寄与する。我々は、実際にBBBモデルにおける排出トランスポーターP-gpの発現を示し、我々は、生化学的アプローチを用いて、P-gp排出ポンプ局在化、および機能的アッセイを用いてP-gpの活性の極性を示す。 GLT-1の発現は、微小血管の基底膜画分に検出されたが、培養されたRBECでは検出されなかった。私たちは、GLT-1がダウンウエスタンブロット分析によって検出可能なin vivo条件下 、結果的にはないと比較して、当社のRBEC培養でレギュレートされたと仮定した。過剰なグルタミン酸が神経毒性であり、 生体内で、GLT-1は、先端区画（血液循環）に基礎コンパートメント（実質）からのグルタミン酸流出を担当しています。星状細胞培養物においては、GLT-1発現は非常に低いままであり、媒体62,63にグルタミン酸を添加することによって誘導される。 またをconfこのようなLRP1、LDLRとのTfRなどの頂端膜に流入輸送体の発現をIRM。のTfRとLDLRの機能は、以前に体外 BBBモデル64 のウシで示すように、単層の反管腔側に腔側からTF-Cy3およびDiLDLの結合実験および輸送に実証された。興味深いことに、星状細胞からの脂質の要件が65,66は、さらに、インビトロで含む、星状細胞および脳内皮細胞との間の生理学的なクロストークを確認する脳毛細血管内皮細胞上のLDLRの発現を増加させることが示されている。我々は、蛍光色素で搬送を例示するために選択したようなCy3及びDIIを使用する蛍光分光分析は、ほとんどの実験室で提供され、 体外BBBモデルで検証するために有用であることを証明できることを考えるととして。しかしながら、蛍光の定量化は、放射能よりもはるかに感度が低いと有意なデータを得るための実験の数の増加を必要とする。理想的には、TFおよびLDLは通常、このような結合/取り込み及び輸送実験のための（ヨウ素125）の放射性標識である。 また、CCL2リリースとBBBの開放によって明らかにされるように提案されたプロトコルを用いて得られた分化した内皮細胞単層は、TNF-αによって誘導される炎症に反応することを示している。 CCL2（MCP-1）およびその受容体CCR2が、多発性硬化症などのCNS ​​病理に関与している、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）67、CNS外傷68とは、神経炎症条件下69,70の下でCNSへの白血球遊走メディエーターとして知られている。 BBBの開口部がCCL2濃度が上（頂端）と下位（基礎）の区画の両方の間で平衡化することができるため、テストのプロトコルでは、我々のCCL2偏分泌に結論付けることはできません。その結果、我々は明らかに、24時間（ 図5A）で、頂端区画内にRBECによって生成CCL2の量を過小評価しています。 一般概要とin vitroモデル BBBの制限：人間の比較に対するインビトロおよびげっ歯類に対するI Nビボ in vitroでのBBB通路に有効であることが証明され、多くの有望な中枢神経系薬は、多くの場合、ヒト以外の種から単離された細胞に基づいて体外 BBBモデルで預け予測可能性の欠如のために臨床試験に失敗しました。それはタンパク質ネットワーク、シグナル伝達、トランスポーターと受容体の機構的な側面を研究することになると我々の知る限り、 生体外 BBBモデルは、おそらくより予測となる。 in vitroで研究するためにあらゆるメカニズム、経路またはターゲットは、同じ動物種との相補的な環境合図（他の細胞型、化学物質、蛋白質）によるその調節のために特徴づけられ、 その場での研究にするために結合する必要がある、および可能な場合は、下記の誘発の制限、注意して、ヒトから分離された微小血管内皮細胞を用いた。 in vitroでのBBBモデルは、ボディの規制から分離自律システムとして見られることがありますが、まだ主要なin vivoでの特性や環境の合図による規制の可能性に恵まれている。内皮細胞単層は、神経グリア血管部（NGVU）の重要な構成要素の数を欠き、血液及び身体調節から単離されているので、インビトロ BBBモデルには「理想的な」は、まだ71,72,73提案されていない。周皮細胞のニューロン17,18又は74,16又はプラスチックコーティングまたは内皮に基づいて、最も一般的で、「最も簡単な製「 インビトロ BBBモデルにおける細胞増殖に用いられる培地および血清に用いられる細胞外マトリックスの種々の成分の欠如アストロサイトに分化した細胞は、タンパク質の発現を調節することができるiのN in vivo の状況75との比較。これらのモデルは、 生体内で表示された多くのトランスポーターを発現し、すべてではなくてもよい。いくつかの場合において、トランスポートパラメータは、第離された微小血管（ インビボ状況に最も近い）で確認した後、細胞培養系76,61において研究。 分子生物学的研究が可能となった同じ種から単離された微小血管と低通過内皮細胞培養における遺伝子およびタンパク質の発現特性評価、異なる種の間で、最も頻繁にそのようなげっ歯類（マウスおよびラット）またはin牛や豚からの小動物から人間77,78,75,15との比較。 in vivoおよびin vitroの脳の微小血管内皮細胞におけるトランスクリプトームの間の比較は、示差的に発現され、最も頻繁にインビトロで有意にダウンレギュレートされた多数の遺伝子転写物を示した。などのTfRやPRなどの流入輸送体をコードする転写小胞輸送に関与oteinsは主に細胞内のエンドサイトーシスおよび小胞輸送の一般的な減少を示唆して、培養された脳内皮細胞において下方制御されています。純度（ピューロマイシン処理）及びヒドロコルチゾンを用いた治療の面で培養操作は、より「 インビボ様」遺伝子発現プロファイル77を復元するのに役立ち得る。トランスクリプトームの研究はまた、さらに体外 BBBモデル75 内の齧歯類に基づいて、ヒトにおける薬剤の取り込みに予測を複雑にし、種間の重要な相違点を明らかにした。ヒト内皮細胞とアストロサイトの共培養を含むインビトロ BBBモデルは、15に記載されている。関連するが、それらは、死後のヒト組織への調節のアクセスを必要と異質性は、年齢、疾患、およびおそらく医学的に依存してヒト脳内皮細胞の品質/特性の中にあるように、これらのモデルは、定期的に実施するのがより困難であるtreatmenドナーのT。努力はよりよい生理的、解剖学的およびin vivoでの BBBの機能特性を再現新しいin vitroモデルを開発するために行われなければならない。 3セル型を含む共培養物は、非常に限定的であり、日常的に実施が困難で表示される。現在までに、最も複雑な生体外 BBBモデルは、アストロサイトと血管様組織を含み、血流75,79,80,81,82を模倣媒体の流れを含んでダイナミックなin vitroモデル（DIV-BBB）です83,84,85。脳の内皮細胞は流れにさらされると、生成された剪断応力は、例えば、細胞分裂、分化、移動およびアポトーシス80内皮細胞生理学に関与する別の遺伝子の発現を調節する細胞表面でmechanotransducersを活性化する。 インビボ、せん断応力血流によって生成されるの確立を許可する細胞接触、で有糸分裂停止を担当してい血管80内の内皮細胞単層。正常なヒト脳微小血管内皮細胞のゲノムおよびプロテオーム解析は、BBB内皮生理学84のせん断応力の影響を示した。せん断応力は、CYP450によって媒介75,86、酸化は75酵素および細胞生存、内皮細胞接着度が高く、排出ポンプの誘導およびトランス75、グルコース代謝の調節のより良好な分極に関与する発現を増加させることによって、傍細胞透過性の調節オクルディンとZO-1 87,75,80、結果的に高いTEERのような細胞間の接合部の要素をコードする遺伝子の約1,500 - 2,000Ω·cm 2で、 生体内で知られているに最も近い79,80パラメータ バイオテクノロジー及び製薬産業、医薬品のルーチンのスクリーニング、あるいはハイスループットスクリーニング（HTS）および動物実験を削減する努力において、主導セットアップするのに日常的により難しいままで脳内皮細胞の初代培養物の交換に使用される異なる細胞株の開発。ほとんどの場合、脳内皮細胞の初代培養物は、プラスミドDNAのトランスフェクションにより、またはレトロウイルスベクターを用いて感染88,89,75のいずれかによって、不死化遺伝子（SV40又はポリオーマウイルスラージT抗原またはアデノウイルスE1A）で形質導入した。 88,75などRBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBSまたはrBCEC4ラット細胞株などの脳由来の内皮細胞株が開発されてきたいくつかの、b.End3マウス細胞株90,75、PBMEC/C1 - 2ブタ細胞株87,75、およびhCMEC/D3ヒト細胞株89,75。他のモデルは、マディン·ダービーイヌ腎臓（MDCK）またはたCaco2細胞株12,75などの非脳由来の細胞に基づいている。異なるヒト脳血管内皮細胞株の中で、hCMEC/D3は広く引用されていますDと2005 91,92年の設立以来、BBBのモデルとして改良された。初代培養細胞株に存在利点と制限などである。彼らは、初代培養よりも扱いやすい延長寿命を持って、十分に特徴付けされており、大規模な実験間の再現性を可能にします。しかしながら、細胞株は、組織特異的機能を失う環境規制を失い、 インビボ75、89中の細胞とは全く異なる分子表現型を獲得することができる。具体的には、単層の細胞株から現在減少し圧迫感、低TEERおよびshowポータープロファイル変動75,89を生成しました。このように、一次細胞での動物実験や研究は、多くの場合、その複雑さにもかかわらず、好ましい。

中枢神経系（CNS）障害を治療するために開発された多くの薬物は、治療上適切な濃度で脳実質に到達することができない。 BBBは、病原体から、プラズマ組成の変動による脳の神経組織を保護し、脳1内外にイオンが、ペプチド、タンパク質、さらには細胞の非特異的フラックスを制限することにより、脳実質の恒常性を維持する。 BBB特性は、特殊なクラスの脳微小血管内皮細胞や、神経細胞、グリア細胞（より正確にはアストロサイトのエンドフィート）、などの神経グリア血管ユニット（NGVU）の隣接する要素間の密接な近接性やクロストークによって誘導され、維持されるおよび周皮細胞は、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカン2,3を中心に構成されて基底膜に鞘で覆わ。毛細血管レベルでの内皮の32％、重要なを果たしている - 周皮細胞は、約22をカバー内皮細胞増殖、血管新生および炎症プロセスの調節において役割。内皮細胞は、毛細血管の内表面を覆う連続シートを形成する。それらは、頂端領域で帯状構造を形成し、それが細胞極性に寄与するのTJ、相互に接続されている。星状細胞は、BBB特性を調節し、例えば、TGF-β、GDNF、bFGFおよびIL-6などの重要な調節因子の供給源である。不完全な機能を備えたGFAP欠損したアストロサイトは、BBBの特性4を規制することができません。ニューロンは直接BBBの形成に構造的に関係するだけでなく、タンパク質発現およびBBB機能5の重要な側面を規制されていません。 さらにBBBの構造、生理学、病理学を研究するために、BBBのin vitroモデルは、研究ツールとして開発されました。脳内皮細胞ベースのインビトロ BBBモデルにおいて実現するために、種々の種から抽出されている8,9ブタウシ6,7、、ラット10,11,12、また、マウス13とヒトの14,15から低継代初代培養上。これらのモデルは、in vivoでの BBBを模倣することが知られている場合に特にラットまたはマウスおよび/ ​​または周皮16,12からグリア細胞及び/又は神経前駆細胞由来のアストロサイト17および/ ​​またはニューロン18と共培養した。それらは、インビトロ / インビボ実験と比較および/ ​​またはトランスジェニックモデル19から製造脳内皮細胞の研究において可能にするので、「ラボにおける「モデルはしばしば齧歯類から製造される。 新たにインビトロ BBBモデルにおいて開発もインビボ試験15,20,21,3,6,22,11,23の前に潜在的なCNS薬剤候補の脳への取り込みを予測するのに役立つように設計されている。 インビトロ BBBモデルは、通常、比較するために使用されているCNSへのI）は、公知の浸透またはlと：を有する薬剤の輸送BBBなし中枢効果全体のOW透過性、及びii）同じ種の動物モデルで測定された、同じ薬の見かけPeの。容易にBBBを通過する薬物は、主に親油性であり、脂質媒介自由拡散（カフェイン、カルバマゼピンなど）によって脳内皮細胞膜を横切る。ジゴキシン、ベラパミルまたはシクロスポリンAのような負に運ば薬は積極的なP-gpのような脳内皮排出トランスポーターによって押し出される。しかしながら、新たに開発された治療用分子の多くは、そのような組換えタンパク質、siRNAまたはモノクローナル抗体などの生物薬剤である。特定のトランスポーターのI）が存在しない、と傍細胞経路を受けるの高分子量分子を防ぐ内皮細胞のII）しっかりと充填層：それらのほとんどが起因してBBBを通過しないでください。これらの制限により、「トロイの木馬」戦略は、ベクトル、BBBでの既知の受容体に対する（抗体、ペプチド）、関係Iを使用して実装されていますN受容体は、トランスポートまたはトランスサイトーシス（RMT）、トランスフェリンなど（TF）受容体（のTfR）、インスリン受容体（IR）、またはLDL受容体のメンバー（LDLR）関連受容体ファミリー（LDLR、LRP1）を媒介した。このような受容体は、 生体内で 24,25 で孤立した脳毛細血管に及び、BBBで発見されている。これらの受容体の転写プロファイルは、特に、LDLRファミリーのものは、分析し、共培養直接脳26からのそれらの抽出後の星状細胞または脳毛細血管内の脳内皮細胞および脳内皮細胞間で比較した。 Pardridge 24は、インスリン受容体およびインスリン増殖因子受容体27,28に対する抗体、続いて、トランスフェリン受容体（TfRの）に対してOX-26抗体を用いてフィールドを開いた。これらの抗体ベースのベクターを用いて、ArmaGenテクノロジーズは、BBB 29を越え、タンパク質を含む、薬物を送達するために、BBBの分子トロイの木馬プラットフォーム技術を開発しました。ザ·文献はLRP1脳血管内皮細胞での発現と強力なエンドサイトーシス/スカベンジャー受容体としての役割を示すデータが豊富である。ウェスタンブロット分析は、LRP1が脳毛細血管に富む画分に、ラットの脳毛細血管内皮細胞30において発現されることを示唆した。このようなBBB 31を越え、効率的な薬物の流入を促進アプロチニン由来のペプチドベクターを用いたAngiochem目標LRP1などの企業。しかし、LRP1もAβおよび血液32に脳実質からの流出/クリアランスの能動輸送に関与している。このようなデータは、そのリガンドによってはBBBを通過双方向輸送にLRP1を伴う。 biOasisはVECT-HORUSがLDLR 34を対象とするペプチドベクトルを開発していますが、このようなBBB 33全体のリソソーム酵素や抗体などの生物製剤の輸送のためにタンパク質メラノを使っトランセンド技術を開発しています。データは、LRPおよびLDLRの差分を輸送するために使用できることがあるが示唆されているこのようなBBB 37全体のリソソーム酵素35,36またはナノ粒子複合体としてのerent分子。 我々の関心のある分野は、ベクター分子およびCNS疾患の治療のためのベクトル化された薬剤候補を用いて、CNSへの薬物送達である。具体的には、BBBを横切る薬物送達は、神経炎症、その範囲が変化してもよいプロセスのコンテキスト内で考慮されなければならないが、これは、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病などの神経炎症を含む、おそらくすべてのCNS病変および疾患に共通であるBBBの炎症と、潜在的にBBBの生理学および透過性の変化は、傍細胞及び経細胞輸送は、病的状態の38,39,40,41,42,43で増幅することができることを考慮に関連付けられている。例えば、TNF-α、TWEAK、および他のサイトカインは、炎症を調節し、 インビトロ BBBモデルを用いた実験は、それらが目の傍細胞特性を変化させることができることを示しているE内皮細胞単層38,39,40と、そのTNF-αはまた、LDL 41の経細胞輸送の増加、ホロトランスフェリン42ラクトフェリン43につながる。 我々の目的は、開発し、特性化することでした最適化され、再現性の高いラット同系BBBモデルは、一次脳内皮細胞とアストロサイトの共培養を使用した。私たちは、それぞれ脳内皮細胞の生産とアストロサイト制作のための5週齢および新生児ウィスターラットを使用していました。 1つの課題は、「毎週再現可能な「BBBモデルの生成を可能にするプロトコルを確立することであった。この目的を達するために、生産プロトコルのすべてのステップは、最初の週の水曜日に脳の微小血管の生産から開始し、週の固定日に実施された。解剖は、過去3年の間にほぼ毎週行った。さらに、培養の再現性を向上させるために、品質保証システムを確立した。すべてreagenTSと化学物質データベース（入国日、株式、有効期限など）で参照されました。 モデルは、内皮細胞の組織化および純度などの多くの基準は、次の特徴づけられた、TEER、LY透過性、炎症誘発性剤、TJタンパク質の定性的および定量的な発現、例えば、P-gpのような排出トランスポーターの機能性、および受容体に応答しなどのTfRまたはLDLR内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与。

<table><tbody><tr><td>BSAフラクションV低エンドトキシン</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4&deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg;C</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg;C</td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg;C / 1年</td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液(1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg;C/1 年</td></tr><tr><td>Collagen IV 型マウス (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg;C / 1ヶ月</td></tr><tr><td>フィブロネクチンヒューメイン血漿(5 mg)</td><td>ベクトンディキンソン</td><td></td><td>356008-20 >C / 1ヶ月</td></tr><tr><td>Vannasスプリングはさみ、ストレート(9 cm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>はさみ、ストレート(9 cm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#5/45(11 cm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子、先端幅0.8ミリメートル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子、曲線先端幅0.8ミリメートル</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼミックス (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg;C / 3ヶ月</td></tr><tr><td>DNase I(100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg;C / 1年</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン(10mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg;C/1 年</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 °;C&nbsp;</td></tr><tr><td>血小板貧血漿からのウシ血清(500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg;C/1年</td></tr><tr><td>bFGF(10 &micro;g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>C / 6ヶ月</td></tr>豚<tr><td>粘膜からのヘパリンNa塩グレードI</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3149-100KU</td><td>4°;C / 1年</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg;C / 6ヶ月</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 >C /</td></tr><tr><td>12ウェルプレート用ポリエチレン吊り下げセルインサート</td>ミリ<td>ポア</td><td>PIRP15R48</td><td>気孔率:1&micro;m 表面: 1.1 cm2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg;C/1年</td></tr><tr><td>マウス抗CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &micro;g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>マウス抗クローディン-5</td><td>Invitrogen、Zymed</td><td>35-2500、(500 &micro;g/ml)</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 & micro;g/ml)</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr> <tr><td>ウサギ抗オクルージン&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &micro;g/ml)</td><td>1/200 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 標識二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, dilithium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg;C</td></tr><tr><td>TNF-α ヒト</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>C</td></tr><tr><td>ラットMCP-1 ELISAキット</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg;C/-20 >C</td></tr><tr><td>マウス抗 P-糖タンパク質</td><td>Covance、Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000、クローン C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - 固定 PFA 4% 1/200 (ウェスタンブロット)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (ウェスタンブロット)</td></tr><tr><td>ローダミン 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>ベラパミル塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 >C</td></tr><tr><td>シクロスポリン A</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>30024</td><td>4 &deg;EGF</td></tr><tr><td>リピート内のアミノ酸4291-4344のb鎖に対するCモノクローナル抗a2マクログロブリン受容体(CD91、LRP1)</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro;g/ml)</td><td>1/5 - 固定 PFA 4%</td></tr><tr><td>マウス抗LDLR</td><td>R&Dシステム</td><td>AF2255(200 & マイクロ;g/ml)</td><td>1/50 - 固定 PFA 4%</td></tr> <tr><td>ラットトランスフェリン-Cy3</td><td>ゲンタウロス</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &�;ハ</td></tr></tbody></table>

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（bbb）：bbb不透過性および受容体媒介輸送に注力

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

血液脳関門（BBB）は、特に、血液と神経組織との間の分子および細胞フラックスを調節する。私たちの目的は、内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与する受容体を研究するため、一次ラット脳内皮細胞（RBEC）とアストロサイトの共培養を用いて、BBBのin vitroモデルで再現性の高いラット同系を開発し、特徴づけることでした。アストロサイトは、トリプシン消化後、機械的切開によって単離し、それ以降の共培養のために凍結した。 RBECは、5週齢のラット皮質から単離した。脳を髄膜と白質の洗浄、及び機械的に酵素消化後に解離させた。その後、組織ホモジネートは、神経組織から血管フラグメントを分離するためにウシ血清アルブミン中で遠心分離した。血管フラグメントは、それらの細胞外マトリックスからの内皮細胞を解放する第2の酵素消化を受けた。このような周皮細胞のような残りの混入細胞はFだったurtherピューロ含有培地中での微小血管フラグメントをめっきすることによって解消。次いで、それらをウェルの底上に成長させたアストロサイトとの共培養のためのフィルター上に継代した。 RBECは、セル境界での典型的な現地化などオクルディン、クローディン5およびZO-1のようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）タンパク質を高レベルで発現した。脳内皮単層の経内皮電気抵抗（TEER）のTJの気密性 ​​が平均·cm 2で300オームに達したことを示す。ルシファーイエロー（LY）のための内皮透過係数（PE）は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均と高度に再現性があった。単層で編成脳内皮細胞は、流出輸送体P-糖タンパク質（P-gpの）を発現ローダミン123、P-gpのためのリガンドの偏光輸送を示し、内皮細胞単層を横切ってトランスフェリン-Cy3およびDiILDLの特定のトランスポートを示した。結論として、我々 は、in vitroを設定するためのプロトコルを提供により品質保証の方法に非常に再現性があり、それがBBBトランスポーターと受容体の研究に適してBBBモデル。

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

本手順の全体的な目的は、再現性の高いラット血液脳関門のin vitroモデルを構築することです。まず、実体顕微鏡下で視神経、小脳、および髄膜を除去し、次いで2つの大脳半球を分離して解剖し、清浄な皮質組織を採取します。第2のステップでは、酵素処理と密度勾配遠心法を用いて、皮質から微小血管を単離します。次に、微小血管を播種し、ピューマイシンでインキュベートして、寄生虫などの混入細胞から血管内皮細胞を精製します。精製されたラット脳血管内皮細胞の培養液は、細胞が90%コンフルエントになるまで増殖させます。最終ステップとして、インサートフィルターの上部チャンバーに細胞を播種し、あらかじめ調製・播種しておいたラットアストロサイトと共培養することで、ラット脳血管内皮細胞の分化を誘導します。最終的に、分化した脳内皮細胞単層は、特定のタイトジャンクションタンパク質の発現および、上層コンパートメントから内皮細胞単層を通過する参照化合物の透過性指数によって特性評価されます。本手法で提示したようなin vitro BBBモデルは、主要分子の細胞内分布を調査し、BBB機能の基本的な細胞・分子メカニズムを解明するのに有用です。特に、このようなモデルを用いることで、BBB受容体およびそれらのエンドサイトーシス、輸送、トランスサイトーシスへの関与について解析することが可能になります。in vitro BBBモデルは、主に我々が開発したペプチドベクターによる特定の受容体へのターゲティングを調査するために使用されます。BBBを介した中枢神経系（CNS）への薬剤送達を促進するために、受容体介在性トランスサイトーシスと呼ばれるプロセス（トロイの木馬アプローチとしても知られています）を利用しています。個々人にとって視覚的な説明は極めて重要です。この手法に不慣れな場合は、細胞作製プロセス中の組織生存率を維持するために、顕微鏡を用いて迅速かつ正確に操作できる解剖技術が求められます。もう一つの重要な点は、実験中のバリアの開放を避けるため、fragileおよびtele salmon領域を早めに終了させることです。最後に、本案ではプロトコルの詳細を示し、私と共同研究者が実施する手順を実演する可視化プロトコルと、レッドプロトコルの違いを明確にします。まず、2本のT 75フラスコを、滅菌培養水に溶解した1 µg/cm²のIV型コラーゲンとフィブロネクチンでコーティングし、微小血管を播種するまで37 °Cのインキュベーター内で接着させます。2日後、5週齢のVistaラット3匹の頭蓋骨から脳を取り出し、氷上で冷却した解剖緩衝液を満たしたペトリ皿に転移させます。小脳と視神経を除いて脳を切り出します。その後、実体顕微鏡下で各脳を半分に切り、2つの大脳半球を分離します。さらにもう一度切断して中脳を取り除き、4つすべての脳を解剖緩衝液が入った氷上の清潔なペトリ皿に移します。次に、前脳の1つを冷たい解剖緩衝液を満たした新しいペトリ皿に移します。クランプで固定し、前脳の縁から髄膜を慎重に剥がします。その後、前脳を裏返し、髄膜を破かないように注意深く剥離します。前脳から髄膜が完全に取り除かれていることを確認し、視神経の残りの部分を切断します。この工程の目的は、白質の層を取り除き、皮質の外殻を得ることにあります。まず、前脳の端をクランプし、皮質の表面を破らないように注意しながら、ピンセットで表面に沿って慎重に引きずります。次に、脳を転がして確認し、髄膜の残渣や大きな表面血管がないことを確認して、髄膜が完全に除去されていることを確かめてください。続いて、頭蓋骨からの3つの脳の摘出を開始し、組織の保存と細胞の生存率を維持するため、解剖にかかる全時間は2時間を超えないようにしてください。3つの脳の皮質を、7 mLのダウンホモジナイザーに入れた6 mLの冷 dissection buffer に移します。次いで、まず隙間の大きい1本目のペッスルを用いて10回上下にストロークして皮質を解離させ、続いて隙間の小さい2本目のペッスルを用いて10回上下にストロークします。その後、懸濁液6 mLを新しい50 mL Falconチューブに移し、ダウンホモジナイザーを24 mLの冷 dissection buffer で洗浄します。この懸濁液を3本の Falconチューブに等分し、1本あたり皮質1つ分に相当する量にします。その後、室温で1000 Gs、5分間遠心分離します。ペレットを観察するとピンク色のグラデーションが見られ、これは皮質の一部である微小血管を表しています。上清を捨て、1つの皮質のペレットを、コラゲナーゼ、DNase I、およびゲンタマイシンを含む1 mLの酵素溶液でホモジナイズします。チューブをシェーカーに入れ、37 °Cで30分間振盪します。次に、1 mLの消化液を10 mLの25% BSA含有HBSS 1xと混合し、チューブを穏やかにボルテックスした後、室温で3,600 G、15分間の密度勾配遠心分離により分離します。密度勾配遠心分離後、ペレットには微小血管が含まれ、上層のディスクには髄鞘化した脳実質と残りの微小血管が含まれます。上層のディスクと上清を、清潔な50 mLファルコンチューブに慎重に移します。微小血管のペレットを吸引しないように注意し、チューブを穏やかにボルテックスした後、2回目の密度勾配遠心分離を繰り返します。得られた微小血管を含むペレットは4 °Cで保持してください。2回目の密度勾配遠心分離の後、上層のディスクとSNAT混合液を慎重に除去し、2回の遠心分離で得られた微小血管を含むペレットを、1 mLの冷えた1x HBSSで再懸濁します。次に、微小血管を20 mLの冷えた1×HBSSで洗浄し、1000 ×gで5分間遠心分離します。その後、微小血管を損失させないように注意しながら、上清を捨てます。1つの皮質から得られた微小血管ペレットを、1 mLの同一の酵素溶液でペレットホモジナイズし、チューブを緩やかにボルテックスします。シェーカーを用いて、37 °Cでさらに1時間、微小血管を消化します。その後、3つの皮質から消化した微小血管を1本のチューブにまとめます。再び、この混合液を2本の50 mLファルコンチューブに分注し、1本あたり皮質1.5回分に相当する抽出済み微小血管を得るようにします。その後、1000 Gsで5分間遠心分離します。微小血管を播種する直前に、インキュベーターからコーティング済みのT 75フラスコ2本を取り出し、室温で過剰なコーティング液を吸引除去します。上清を捨て、微小血管のペレットを1 mLのECMで再懸濁し、4 µg/mLを添加したECMを用いて各チューブを10 mLにします。精製プロセスを開始するためにピューマイシンを添加し、マイクロ血管をフラスコに播種します。次に、フラスコを37°C、5% CO₂のインキュベーターに入れ、精製プロセスに続き、マイクロ血管をコラーゲン・フィブロネクチンマトリックスに接着させます。マイクロ血管の播種から24時間後、細胞残渣を新鮮なECMで洗浄し、培養液を4 µg/mLのピューマイシンを添加したECMに交換し、37°C、5% CO₂のインキュベーター内で5日目まで培養します。マイクロ血管の播種から24時間後、血管内皮細胞がコラーゲン・フィブロネクチンマトリックス上で遊走および伸展し始めます。5日目に精製プロセスを完了させるため、細胞残渣を新鮮なECMで洗浄し、培養液を2 µg/mLを添加したECMに交換します。増殖のため、さらに3日間ピューロマイシンを添加します。8日目に細胞を洗浄し、インスリン、トランスフェリン、およびセレン酸ナトリウムを添加します。10日目に細胞が90%コンフルエンスに達するまで、培養液にこれらのサプリメントを添加し続けます。8日目に、12ウェルプレート3枚のフィルターを、滅菌培養水で調製した0.5 µg/cm²ずつのコラーゲンIV型およびフィブロネクチンの混合液でコーティングします。まず、下層コンパートメントに1.5 mLの滅菌培養水を加えます。次に、上部コンパートメントにミックスを0.5 milliliters加えます。共培養を開始する5日前の当日、血管内皮細胞を播種するまで、37 degrees Celsiusでマトリックスを接着させます。クライオバイアルからアストロサイトを37 degrees Celsiusで融解し、細胞を10 millilitersのGCMを含む15 milliliterのファルコンチューブに移して遠心分離します。室温で120 Gsで8分間遠心分離します。次に、アストロサイトペレットをGCMで再懸濁し、1cm²あたり30,000個の密度で播種します。12ウェルプレートを使用し、10日目のトリプシンによるRBEC解離の直前に、12ウェルプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れます。あらかじめコーティングしたフィルターをDMM F 12培地で洗浄し、チャンバーにECMをあらかじめ満たしてから、同日のRBEC播種までインキュベーターに戻します。RBECをカルシウムおよびマグネシウム不含のDPBSで2回洗浄します。37 °Cに温めたtrypsin EDTA溶液をT 75フラスコ1本につき4 mL加え、正確に30秒間作用させた後、trypsin EDTA溶液を3.5 mL回収します。内皮細胞が常にtrypsin EDTAの層で覆われているように注意します。次に、顕微鏡下で観察しながら細胞の剥離を確認します。細胞層がマトリックスから剥がれ始めたら、すべての細胞が浮遊するまでT 75フラスコの端を軽く叩きます。各T 75フラスコに3 mLのECMを加え、50 mLファルコンチューブに移します。この操作をあと2回繰り返し、培地で洗い流してすべての細胞を回収します。黄色チップを装着した10 mLピペットを用いて、細胞懸濁液を4回ピぺッティングし、非常に緩やかに解離させます。懸濁液中の細胞数をカウントし、翌日にあらかじめコードを記入し溶液を満たしておいたフィルター上に、高密度で播種します。培地交換時に細胞単層が破壊されるのを防ぐため、上層コンパートメントの培地を2回交換して細胞残渣を除去します。プレートをわずかに傾け、吸引ピペットを近づけすぎないようにして、常に細胞単層の上に少量の培地を残してください。これは、培地交換中の細胞単層の乾燥を防ぐためです。洗浄は一度に6つのインサートのみで行ってください。播種から24時間後には、細胞単層がコンフルエントになっている必要があります。その後、共培養を開始する前日の同日に、分化1日目と定義される12日目に、アストロサイト培養液を1.5 millilitersの補充済み分化培地に交換します。RBECを含むフィルターの培養液を分化培地に交換します。その後、これらの条件下で、RBECフィルターをアストロサイトを含むウェルに転移させます。in vitroモデルでは、3日以内に分化し接合部関連タンパク質を発現し、その後さらに3日間で最適な分化状態となります。ここでは、細胞単層をメントンで免疫染色し、形態的に重複のない、脳血管内皮細胞の合流した単層であることを確認しました。また、内皮細胞形態に典型的な紡錘形細胞であること、および密接接合タンパク質であるZO-1とoccludinの発現を確認しました。12ウェルBBBモデルにおける単層の密閉性は、Lucifer yellowの輸送を測定することで評価しました。結果は透過係数（PE）として10⁻³ cm/minで表記され、LYのPEが0.6 × 10⁻³ cm/minを超える場合に、バリアは透過性がある、または開いているとみなされます。ここ数十年の間に、多くの論文やレビューで、さまざまな種の静的および動的なin vitro BBBモデルに関する情報が提供されてきました。しかし、このようなモデルは依然として扱いが難しく、バリア品質の再現性の確保が大きな課題となっています。このビデオを視聴することで、研究者はPBBのin vitroモデルの作製および特性評価の方法について十分に理解できるはずです。

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