Name: シーケンシャルインビボ骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶ 骨折修復における骨形成幹細胞/前駆細胞の動態を、生体内顕微鏡法を用いて連続的に追跡・定量化する手法。この方法は骨再生メカニズムの解明と骨折治療の改善に貢献する。

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私たちは、原稿を読み取るためで公園に感謝します。この作品は、内容はもっぱら著者の責任であり、ないDPとCPLとDTSの国立衛生研究所の助成金を受賞番号K01AR061434と白血病リンパ腫協会フェローシップ賞（5127から09）の下でNIAMSによってサポートされていました必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表しています。

1。マウスおよびプレコンディショニング注：すべてのマウスを無菌状態に維持し、すべてのプロトコルがマサチューセッツ総合病院の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。すべての手術は、オートクレーブし、滅菌装置を使用して、無菌条件下で行われるべきである。MX1〜Creを15、Rosa26遺伝子-のloxPワンストップのloxP-EYFP（ローザ-YFP）、およびRosa26遺伝子-のloxPワンストップのloxP-tdTomato（ローザ·トマト） であったジャクソン研究所から購入した。 オステオカルシン-GFPマウスはヘンリークローネンベルクによって提供された。 インビボで OSPC遊走および増殖の定量分析のために、Mx1の-Creリコンビナーゼ + ローザ-YFP +（単色レポーター）マウスを使用した。 オステオカルシン+成熟骨芽細胞への分化をより詳細に追跡のために、我々は使用三遺伝子MX1〜のCre +ローザ-トマト+ OCN-GFP +マウス。 <ol><li> 生体内でMx1の+細胞を標識するために、無菌のPBS溶液中でポリイノシン-ポリシチジル酸（PIPC、2.5 mg / mlの）を調製し、10日間、腹腔内に一回、一日おきMX1〜のCre +レポーターマウスの20グラム、200μLを注入。 </li><li> Mx1の常駐+造血細胞を排除するために、9.5 Gyでの単回用量をマウスに照射する。照射の24時間後、移植野生型骨髄細胞（1×10 6細胞/マウス）を静脈内16。注意：MX1〜誘導性細胞は造血細胞および造血由来の破骨細胞が含まれるため、Mx1の+造血細胞の排除はMx1の+骨形成細胞の画像品質および定量を向上させます。 </li><li>骨髄移植後に、ドナー骨髄細胞の正常な再増殖を達成するために、4〜6週間のために動物を監視する。 </li></ol> 2。モー準備を使う<ol><li> IACUC承認の手順を使用して、ケタミン/キシラジン（100 mg / kgを、キシラジン12 mg / kg体重）を50μlの腹腔内注射によりマウスを麻酔。注：効果の持続時間は、ケタミン/キシラジンの追加用量で延長することができる。 </li><li>マウスが完全にTOE及び/または尾のピンチに反応しないことによって麻酔をされているかどうか。マウスを麻酔した場合（オプション）、テーピングによる鼻の上イソフルランガスマスクを固定します。動物が完全に鎮静されていることを確認するためにイソフルランのレベルを調整します。 </li><li>電気トリマーや小さなハサミを使って頭髪をクリップ。髪の断片を除去し、70％アルコール綿で露出した皮膚を殺菌。角膜の脱水を防ぐために、涙のゲルを適用します。 </li></ol> 3。微小破壊けが<ol><li>動物が完全に鎮静されていることを確認した後、頭皮を開くために、単一の逆L字​​型の切り込みを入れる。簡単に言えば、第1の横切開（1cm未満）startiを作る別の耳に1耳からngの。 〜60°を回し、離れて鼻から〜2〜3ミリメートルまでの鼻に向かって切開し続けています。注：この切開は画像化される領域の上の瘢痕組織の形成を最小限に抑えます。 </li><li>ピンセットで両側に向かって引いて、皮膚のフラップを分離する。両方前頭骨や矢状および冠状縫合の交点が明確に公開されるべきである。 </li><li>すべての残留毛が除去されるまで滅菌PBSと滅菌ガーゼや綿棒で穏やかにワイピングでフラッシュすることにより開放面を清掃してください。 </li><li>頭蓋冠上の微小破壊を生成するには、片手でマウスの頭と別の手で30 Gの針を保持します。穏やかな圧力で30 Gの針の先端を挿入し、運動をねじることによって矢状および冠状縫合の交差点の近くに左前頭骨上のマイクロ穿刺（&lt;1ミリメートルの深さで巻か〜0.2ミリメートル径）を確認します。注意：これは、それによってbleediを最小限に抑え、脳内に侵入するの針を避けることが重要ですNGと組織の損傷。 </li><li>大きな針（20または25 G）に切り替えて、針（〜0.5ミリメートル径）をひねってパンク穴を広げる。 </li><li>対側前頭骨に対して二の穿刺を生成するために、ステップ3.3から3.5を繰り返します。 </li><li>出血が止まるまでのPBS連続ドロップすることで、負傷したスポットを一掃。 注：骨折部位での出血は、適切な撮像を妨害し、瘢痕形成を誘導する。 </li><li>乾燥を避けるために、頭蓋骨に滅菌生理食塩水または2％のメトセルの低下を適用する。注意：画像の鮮明さを軽減するであろう、頭蓋骨の表面を乾燥させないでください。これは、領域を覆うようにゲルまたは生理食塩水の十分な量を使用することが重要である。 </li></ol> 4。生体内イメージング<ol><li> （任意）イメージングの前に、一部のマウスは、血管を可視化するために、血管色素を注射する。非標的Qtracker 705 80メートルで希釈した（50 mMのホウ酸緩衝液中の2μM溶液）20μlの眼窩注入PBSをL。試薬の無駄を最小限に抑えるためにインスリン注射器を使用してください。信号が十分明るくない場合は、追加の金額が必要になることがあります。 </li><li>スキャナの電源をオンにします。注：ポリゴンベースのレーザスキャナは、ビデオレート（毎秒30フレーム）での同時マルチチャネル画像取得を可能にする。ビデオレートスキャンは、生きている動物のイメージングのために非常に重要である。 </li><li>多光子レーザー（：サファイアレーザフェムト秒チタン）をオンにします。 880 nmの波長を設定し、骨の第二高調波発生イメージング（440 nm）のための電力を調整。 GFP及びtdTomato励起用、491 nmおよび561 nmの固体レーザーをオンにします。 </li><li> （tdTomatoのために第二高調波発生のための435±20 nmのバンドパスフィルタ、GFPについて528±19 nmのバンドパスフィルタ、および590±20）各信号のPMT（光電子増倍管）検出器をオンにします（オプション） Qtracker 705の信号を検出するために638 nmのヘリウム - ネオンレーザーおよび695±27.5 nmのバンドパスフィルタを有するPMTを使用する。 </li><li> PLACXYZ軸電動顕微鏡ステージ上に動物をメール。 （これは、動物の損失のリスクを軽減）、体温を維持するために電気加熱パッドで最も快適な位置にマウスを保管してください。撮像中に動きを最小限に抑え、できるだけ水平に画像化された面積を維持するために、マウスを保持するためにテープを使用しています。 </li><li>乾燥を避けるために、頭蓋骨に暖かい2％メチルセルロースゲルまたは生理食塩水の滴を適用する。撮像面にカバーガラスを置く。頭蓋冠をスキャンするために低倍率レンズ（0.9 NAの30倍の水浸対物レンズ）を使用します。 </li><li> XYZ軸コントローラを使用して、骨からのSHG信号を検出することにより、頭蓋冠の表面を見つけ、そのような矢状縫合および冠状縫合との交点として重要なランドマークの場所を特定する。画像を取得して、XYZ座標を記録します。 </li><li> SHGと蛍光シグナルを観察することにより、損傷の場所を検索し続けています。 </li><li>損傷部位または領域Oするときfは関心が発見された、目的の細胞からのSHG及び蛍光シグナルを含有する最良焦点面の画像を取得する。 XYZ座標と画像の次のラウンドのための彼らの正確な位置を定義するための矢状や冠状縫合の交差点までの距離を保存します。 </li><li>骨折傷害の3D細胞および骨の構造を収集するには、Zスタックによる記録画像 - 骨内膜骨表面から〜100μmの深さを持つ（25μmの間隔）。傷害の片側の撮像が終了した後、次の損傷部位用撮像処理を繰り返す。 </li></ol> 5。ポスト操作手順<ol><li>画像形成後、頭蓋骨からメチルセルロースゲルを除去するために滅菌生理食塩液で撮影部位をすすぐ。滅菌綿棒を使用して、表面上のトリプル抗生物質軟膏を少量を適用します。皮膚フラップをカバーし、外科用縫合で頭皮を再度閉じます。これは低刺激性の縫合糸（吸収性ポリグラクチンSUで行うことができますTURE）と5-0サイズの縫合針。注意：良い縫合技術は、瘢痕形成を最小限に抑えることができます。 </li><li> 0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィンのIP注射したすべての動物を手術後48時間ごとに12時間の治療。彼らは十分な意識を取り戻すまで、暖かい回収室で動物を保​​管してください。 3〜5日後に、縫合糸を再び開き、骨折治癒中の細胞変化を追跡するために、生体内イメージングの手順を繰り返します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

骨格筋幹細胞の調節は、骨再生を達成するためのよりよい方法を定義するために非常に重要であり得る。細胞レベルで定量的かつ連続的なイメージングは​​、技術的に困難となっている。マウスの長期骨折モデルが広く使用され、生体力学的研究17に適してきたが、その深部組織の位置、不均一な破断サイズ、軟組織の損傷、および安定化固定具の適用は、順次生体内イメージングが限られている。ここで、共焦点/二光子生体顕微鏡およびマウス頭蓋冠骨折モデルの組み合わせにより、これらの制限を克服するための方法が提供される。骨形成幹細胞/前駆細胞系譜追跡したこのアプローチは、骨折修復における骨形成幹/前駆細胞のin vivoイメージング 、リアルタイムのためのその能力を実証している。 この方法における主要な技術的課題は、経時的に一貫して高品質の画像を得ることである。高品質のIM最大撮像深度と年齢は、蛍光レポーターおよび撮像領域の組織の状態の明るさに依存する。また、組織損傷および光退色を避けるために、レーザー露光を最小化する長期連続イメージングのために重要である。ビデオレートプラットフ...

骨粗しょう症性骨折のリスクが高いにつながる変性骨疾患及び年齢関連骨量減少は、公衆衛生1における大きな課題となっている。骨の維持、骨形成性骨芽細胞と骨吸収破骨細胞によって制御される。骨形成細胞の欠陥は、年齢関連骨量減少および変性骨疾患2,3の主な原因である。大規模な研究は、骨折治癒の改善に焦点を当てているが、変形性骨疾患を治すと骨粗鬆症による骨折の弱点を逆に信頼性の高い医薬品の発見は重要な課題である。したがって、骨の再生および修復における骨形成細胞およびそれらの制御機構の源を研究する骨格再生を促進し、骨量減少疾患を逆転させる新規な洞察を提供する。 骨髄中の多能性間葉細胞の存在は、異なる可能性クローン原集団の同定に基づいて提案されている骨形成にiate、脂肪形成および軟骨形成の系統は、ex vivoで4。最近では、複数の研究は、骨格/間葉系幹細胞（SSCは/ MSCは）骨芽細胞の自然源であり、骨代謝回転、改造、及び骨折修復5,6のために重要であることを報告している。加えて、我々の系譜追跡研究では、成熟骨芽細胞が突然短い半減期（〜60日）があり、継続的に正常な恒常性と骨折修復の条件6の両方で彼らの幹細胞/前駆細胞によって補充されることを明らかにした。しかし、in vivoでの幹細胞のアイデンティティとどのような細胞が傷害やサプライ骨形成細胞を破砕するために反応は不明である。したがって、生理的状況下における内因性のSSC / MSCの遊走、増殖および分化を分析することができる方法を開発することが重要である。 骨折修復複合体の配列によって調節され、多細胞および動的なプロセスであるサイトカインおよび増殖因子7。骨折の研究のための最も一般的なアプローチは、長骨骨折を有する動物モデルを使用し、骨切片および免疫蛍光技法8-10によって骨を分析することである。この修復プロセスは、マイクロCT 11、近赤外蛍光12、および化学発光イメージング13を含む複数の画像化技術によってモニターすることができる。しかし、各技術は、一定の制限があり、in vivoでの細胞レベルでのSSC / MSC機能を監視する有効な方法がなかった。最近では、共焦点/二光子生体顕微鏡が開発され、動物14を生体内にあっても単細胞の解像度でそれらの骨髄微小環境のコンテキスト内で移植された癌細胞及び造血幹細胞を検出するために使用されている。系統トレース一連のモデルでこの技術を組み合わせることで、骨形成幹/前駆細胞が遺伝的に一過交流でマークすることができることを定義することができたミクソウイルス耐性-1（Mx1の ）プロモーターとMX1〜誘起前駆細胞のtivationは、時間の経過とともに成熟骨芽細胞の大部分を維持することができますが、成体マウス6に軟骨細胞の生成に関与しません。加えて、我々はMX1〜ラベルOSPCsが骨折治癒6で新しい骨芽細胞の大半を供給していることを明らかにした。 ここで、骨系統追跡モデルと生体顕微鏡を用いて、プロトコルは、骨折修復におけるMx1の+骨形成性幹/前駆細胞のin vivo動態を定義するために設けられている。このプロトコルは、骨折部位への骨形成幹/前駆細胞の移設と早期修復過程における骨前駆拡大の定量的な測定を追跡するために、順次画像を提供しています。このアプローチは、骨修復を改善するための治療候補の評価を含む複数のコンテキストで有用であり得る。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2B)</td><td>ジャクソン研究所 (バーハーバー、メイン州)</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩注射</td>剤 <td>バイオニッチファーマ</td><td>67457-001-10</td><td>&nbsp;バイアルサイズ:10 ml(50 mg / ml)</td></tr><tr><td>キシラジン滅菌溶液</td><td>ロイド株式会社</td><td>NADA#139-236</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィンHl</td><td>ベッドフォードラボ</td><td>NDC 55390-100-10バイ</td><td>アル:0.3 mg / ml、用量:0.05-0.1 mg / kg</td></tr><tr><td>DPBS、1X</td><td>CORNING cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>アルコール準備パッド(70%イソプロピルアルコール)</td><td>ケンドールWEBCOL</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>ファインサージカルハサミ</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファインフォーセプス</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>VICRYL*Plus 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>VCP490G</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 705 非標的量子ドット</td><td>Invitrogen</td><td>Q21061</td><td></td></tr><tr><td>メトセル 2%</td><td>OmmiVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIpC (ポリイノシン-ポリシチジル酸)&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P0913-50MG</td><td>100 &mu;マウス10 g用(PBS中2.5 mg / ml)</td></tr><tr><td>Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Calypso 491 + 532 nm DPSSレーザー</td><td>Cobolt AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radius-635 HeNeレーザー</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

骨が継続的にオーバーになり、非常に再生損傷後です。骨形成幹/前駆細胞が存在して長いと仮定されているが、そのような細胞のインビボでの実証にごく最近達成された。ここで、内因性の骨形成幹/前駆細胞（OSPCs）および骨修復におけるそれらの子孫の役割を調査するためのインビボイメージング技法が提供される。モデルや頭蓋冠骨における誘導微小破壊の生体内イメージングをトレース骨系細胞を使用して、OSPCs直接の早期修復過程における重要なイベントが発生する損傷後最初の数日間に観察することができる。損傷部位を順次OSPCsが、怪我に移転数が増加し、骨形成骨芽細胞に分化することを明らかに画像化することができる。これらのメソッドは、骨の再生および修復のための幹細胞内因性および外因性の分子制御因子の役割を調査する手段を提供します。

<html>安定化長骨骨折モデルは、骨折の研究で親しまれてきた。しかしながら、長骨骨折または大きなモデルは、複数の組織損傷を引き起こし、従って、骨細胞機能の定量的測定には限界がある。我々は、針の穿孔（ 図1A-1C）で頭蓋冠前頭骨に最小侵襲性損傷（硬膜に最小限または全く浸潤1mm未満の直径）を開発した。この骨は、骨髄と平坦で薄い骨構造を有しているので、我々は（他の組織の干渉を受けることなく、損傷した骨、骨細胞、および脈管構造の明確なイメージングを可能にする、微小骨折のin vivoライブイメージングのための頭蓋冠前頭骨の上面図を選んだ図1C）。我々は、この微小破壊は、ミネラル沈着および新たな骨形成（データは示さず）、続いて軟質カルス形成を含む大きな骨折損傷の多くの特徴を再現することを観察した。 この方法は、骨折治癒中に、特定の骨形成細胞集団を追跡することができる場合&quot;&gt; Mx1の+骨形成幹前駆細胞の逐次in vivoイメージングを。我々は...

骨折治癒における骨前駆細胞機能の定量測定は、高分解能シリアルイメージング技術を必要とします。ここで、プロトコルは、画像を順次かつ骨折の修復過程における内因性の骨形成幹細胞/前駆細胞の移動、増殖および分化を定量化する生体顕微鏡と骨系統トラッキングを使用するために提供される。

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

本手順の全体的な目的は、骨折修復における内因性骨形成幹細胞および前駆細胞の遊走、増殖、および分化を逐次的に追跡し、定量化することである。これはまず、ポリシニルポリイノシン酸（poly I:C）の注入により、in vivoでMx1陽性細胞を標識し、次いで放射線照射によって常在性のMx1陽性造血細胞を除去することで達成される。第2ステップでは、野生型骨髄細胞を放射線照射したマウスに系統的に投与する。次に、ニードルドリリングによりマウスのCal領域に微小骨折を誘発させます。最後に、微小骨折の修復過程を連続的な生体内イメージングで観察します。最終的に、これらの生体内イメージング画像を用いて、骨折部位への骨形成幹細胞および前駆細胞の流入と増殖のダイナミクスを評価することができます。したがって、本手法の主な利点は、骨折治癒の過程において、骨芽細胞系幹細胞および前駆細胞のin vivoでの反復イメージングが可能になることです。本手法の意義は、骨折治癒および骨粗鬆症の治療へと展開されます。これにより、骨の再生および修復における内在性骨芽細胞系幹前駆細胞をモニタリングするための新たなツールが提供されます。組織損傷を最小限に抑えてマイクロフラクチャーを形成し、かつ重度の瘢痕形成を誘発せずに骨折損傷のin vivoイメージングを繰り返し行うことは、本手法において重要であり、技術的な困難を伴うため、視覚的な実演が不可欠です。in vivoでMX1陽性細胞を標識するには、まずMX1 Creリポーターマウスの体重20 gあたり200 µLのポリ酸性ポリシトイリ酸を、10日間、1日おきに1回腹腔内投与します。次に、常在するMX1陽性造血細胞を除去するため、投与したマウスに9.5 Gyを単回照射します。24時間後、野生型骨髄細胞1×10⁶個をマウス1匹につき静脈内移植します。4～6週間後、ケタミン・キシラジン50 µLを腹腔内投与してマウスを麻酔します。足趾をつねって鎮静を確認した後、骨髄細胞を移植したマウスの頭皮をバリカンで剃り、露出した皮膚を70%アルコール綿で消毒します。角膜の乾燥を防ぐためにティアジェルを塗布し、片方の耳からもう一方の耳にかけて、頭皮に1 cm未満の横切開を加えます。次に、動物を約60度回転させ、ピンセットを用いて鼻から約2～3 mmのところまで切開を続けます。皮膚を動物の両側へ引き寄せ、前頭骨および矢状縫合と冠状縫合の交点が見えるように露出させます。露出した表面を滅菌PBSで洗浄し、綿棒で残った被毛を優しく拭き取ります。次に、頭蓋骨にマイクロフラクチャーを作成するため、片手でマウスの頭部を固定し、もう一方の手で30ゲージの針を持ちます。30ゲージの針先を用いて、矢状縫合と冠状縫合の交差付近の前頭骨の一側に、小さな穿刺孔を慎重に作成します。脳を貫通させないよう、より

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膜内骨化、仮骨延長術、またはCriticalサイズの欠損の治癒を評価するための剛安定骨折を作成する

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

このプロトコルは、ガンマシンチグラフィーを使用して細胞の生存と組織分布を決定するために、馬の間葉系幹細胞の放射性標識と馬の腱損傷への移植を説明しています。...

馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

軟骨内骨の治癒過程における破壊カルス組織の発達の評価は、癒しのプロセスを監視するため不可欠です。磁気共鳴画像 (MRI) の使用を報告する-マウスにおける骨再生中、MRI...

生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

マウスで閉じた大腿骨骨折の生成: 骨の治癒を研究するためのモデル

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

このプロトコルは、生きた動物の生体内顕微鏡を用いてリアルタイムでCCL5媒介性骨格細胞移動の検出を記述する。...

マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

このプロトコルは、骨折治癒研究のために、髄内ワイヤーで安定化されるマウスの大腿骨に骨幹骨折を確立するための外科的処置を説明しています。...

マウスにおける骨幹大腿骨骨折モデルの確立

マウス骨髄損傷モデルは、出生後の骨形成を膜内骨化で研究するための有用なツールです。この簡略化された外科的プロトコルは、損傷後の新しい骨形成と細胞反応の下流評価のための骨髄アブレーション手順を説明しています。...

マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

学ぶ 骨折修復における骨形成幹細胞/前駆細胞の動態を、生体内顕微鏡法を用いて連続的に追跡・定量化する手法。この方法は骨再生メカニズムの解明と骨折治療の改善に貢献する。

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