2014年5月23日
骨折治癒における骨前駆細胞機能の定量測定は、高分解能シリアルイメージング技術を必要とします。ここで、プロトコルは、画像を順次かつ骨折の修復過程における内因性の骨形成幹細胞/前駆細胞の移動、増殖および分化を定量化する生体顕微鏡と骨系統トラッキングを使用するために提供される。
この手順の全体的な目標は、骨折修復における内因性骨形成幹細胞および前駆細胞の遊走増殖および分化を順次追跡および定量化することです。これは、最初にミクソウイルス、インフルエンザウイルス耐性、1つまたはMX One陽性細胞をin vivoでpoly cynic poly cyto ilic acid injectionによって標識し、次に常在するMX One陽性造血細胞を照射によって排除することによって達成されます。第2ステップでは、野生型の骨髄細胞を照射したマウスに系統的に投与します。
次に、針穿孔によりマウスのCal領域に微小骨折が生成されます。最後に、微小骨折修復の逐次バイアル内イメージングが行われます。最終的に、これらの生体内画像は、骨形成幹と前駆細胞の流入と骨折部位への拡大のダイナミクスを評価するために使用できます。
したがって、この技術の主な利点は、骨折治癒の過程で骨形成幹細胞および前駆細胞のin vivo反復イメージングを可能にすることです。この技術の意味は、骨折治癒と骨粗鬆症の治療にまで及びました。この方法は、骨の再生と修復における内因性骨形成幹前駆細胞を監視するための新しいツールを提供します。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、最小限の組織損傷と重度の瘢痕形成を誘発することなく骨折傷害の反復in vivoイメージングを伴うマイクロフラクチャーの生成が方法にとって重要であり、技術的に困難であるため、生体内でMX 1陽性細胞を標識することは、MX One Creeレポーターマウス重量20グラムあたり200マイクロリットルのポリ酸性ポリサイトイリン酸を注入することから始めます1日おきに1回腹腔内10日間。次いで、常在するMXを排除するために、1つの陽性造血細胞が注入されたマウスに9.5グラの単回投与を照射する。24時間後、マウス1匹につき6番目の野生型骨髄細胞に1回10回移植する。
4〜6週間後、50マイクロリットルのケタミンキシラジンによる腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけますつま先つまみによる鎮静を確認した後、骨髄細胞移植マウスの頭皮ペアをクリップし、露出した皮膚を70%アルコール綿棒で滅菌します。角膜の脱水を防ぐために涙液ジェルを塗布し、次に頭皮を横切って1センチメートル未満の横切開を行い、片方の耳からもう片方の耳で終わります。次に、動物を約60度回転させ、鉗子を使用して鼻から約2〜3ミリメートルに達するまで切開を続けます。
組織のフラップを動物の側に向かって引っ張って皮膚を分離すると、前頭骨と矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点の両方がはっきりと露出するはずです。開いた表面を滅菌PBSで洗い流し、綿棒で残った毛をやさしく拭き取ります。次に、子牛に微小骨折を発生させるには、片手でマウスの頭を持ち、もう片方の手で30ゲージの針を持ちます。
30ゲージの針先を使用して、矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点近くの前頭骨の片側に微小穿刺を静かにドリルで開けます。脳を貫通しないように、より大きなゲージに切り替え、新しい針をひねって穿刺穴の直径を約0.5ミリメートルに広げます。対側の前頭骨に2回目の穿刺を行った後、出血が止まるまでPBSを各スポットに連続して滴下します。
次に、乾燥を避けるために、頭蓋骨に十分な量の滅菌生理食塩水を塗布して、Vidal画像を取得する領域を完全に覆います。まず、ポリゴンベースのレーザースキャナーをオンにして、毎秒30フレームのビデオレートでマルチチャンネル画像を同時に取得できるようにします。次に、多光子イメージング用のフェムト秒チタンサファイアレーザーをオンにします。
GFPおよびTDトマト励起用の440ナノメートルで頭蓋骨の第2高調波発生イメージングのために出力と波長を880ナノメートルに設定し、491ナノメートルと561ナノメートルの固体レーザーをオンにします。次に、各信号の光増倍管検出器、第2高調波発生用の435プラスマイナス20ナノメートルバンドパスフィルター、GFP用の528プラスマイナス19ナノメートルバンドパスフィルター、TDトマト用の590プラスマイナス20ナノメートルバンドパスをオンにします。次に、動物をXYZ軸電動顕微鏡ステージに置き、摂氏37度に設定された電気加熱パッドの上に置きます。
テープを使用してマウスを所定の位置に保持し、温かい2%メチルセルロースベースのジェルを頭蓋骨に一滴垂らします。乾燥を防ぐため、撮像部にカバーガラスを当ててください。次に、開口数が0.9の30倍水浸対物レンズとXY、Z軸コントローラーを使用して、骨からのSHG信号を検出します。
子牛の表面を見つけるには、矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点など、重要なランドマークの場所を特定し、画像を取得します。ランドマークのXY座標、Z座標をマークし、SHG信号と蛍光信号をガイドとして使用して損傷の位置を探し続けます。各関心領域が見つかったら、目的の細胞からのSHGと蛍光シグナルを含む最適な焦点面の画像を取得します。
XY座標、Z座標、矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点までの距離を保存して、次のイメージングラウンドの正確な位置を定義します。次に、骨折損傷の3D細胞および骨構造を収集します。内膜骨表面から約100ミクロンの深さで、約2〜5ミクロンのZスタック間隔で画像を記録します。
最後に、両方の損傷部位をイメージングした後、滅菌生理食塩水を複数回滴使用して、頭蓋骨から2%メチルセルロースゲルを除去します。次に、表面を抗生物質でコーティングし、頭蓋骨を皮膚フラップで覆い、低刺激性の縫合糸で頭皮を再度閉じ、十分な意識を取り戻すまで動物を暖かい回復チャンバーに保ちます。3〜5日後、骨折の治癒中の細胞の変化を追跡するために、Intravitalイメージングステップを繰り返します。
この代表的な実験では、遺伝子性MXの前面骨に2つの微小骨折を作製し、1つのトマトオステオカルシンをGFPマウスに照射し、骨髄置換後の微小骨折の逐次3D生体内イメージングを行ったところ、2日目に骨折部位内でトマト陽性の骨形成幹細胞および前駆細胞が移動することを示し、 また、5日目の拡張も同様です。この時点ではGFP陽性の骨芽細胞は検出されませんでしたが、12日目には、骨面付近の骨前駆細胞の一部が、矢印で示されているようにトマト陽性GFP陽性骨芽細胞の分化を開始し、21日目に新たな骨芽細胞が蓄積し、新たな骨芽細胞が形成されたことは、骨形成前駆細胞の遊走と増殖が、骨折治癒のための新たな骨芽細胞を供給する主要なメカニズムであったことを示しています。この方法が骨折治癒中に骨前駆細胞数の一貫した定量的な出力を提供するかどうかをテストするために、MX one YFP 陽性の骨形成幹細胞と前駆細胞を損傷後 14 日間追跡しました。
少数の前駆細胞が、損傷部位で3日間までに一貫して検出された。細胞数は7日目に連続して増加し、10日目にピークに達し、14日間持続しました。骨前駆細胞の生成の動力学は、YFPシグナル強度を経時的に測定することによって定量化され、生体内顕微鏡法によって観察されたものと相関しました。
前駆細胞は3日目に最初に観察され、10日目までにピークに達し、14日目まで同様に高い強度で留まりました。この手順を試みる際には、熟練した縫合技術と最小限の出血により、瘢痕の形成を減らし、バックグラウンドの自家蛍光を下げることができることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、骨折修復の過程における内因性骨形成幹前駆細胞の遊走増殖と分化を画像化し、追跡する方法を十分に理解できるはずです。
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この研究は、骨折治癒中の骨前駆細胞の機能を定量的に測定するための方法を、生体内顕微鏡法を用いて提示します。概説されたプロトコルにより、骨損傷に反応して移動、増殖、分化する内因性の造骨幹細胞/前駆細胞の追跡とイメージングが可能になります。
This method enables direct visualization and quantification of endogenous osteogenic stem/progenitor cell dynamics during fracture repair, providing mechanistic insights into bone regeneration. By tracking cell migration, proliferation, and differentiation in vivo, it supports target validation and de-risking in osteoporosis and fracture healing therapeutic development. The approach offers a reproducible platform for evaluating stem cell-intrinsic and extrinsic regulators, enhancing predictive confidence in preclinical decision-making.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing dynamic, quantitative cellular readouts that inform therapeutic strategy.