Name: 植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ植物の無細胞系を用いたプロテアソームによるタンパク質分解アッセイ法。Nicotiana benthamiana葉からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEとウェスタンブロッティングで安定性を解析します。ユビキチン・プロテアソーム経路の研究に応用可能です。

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この出版につながる仕事はジョージア番号246550の下でマラガ大学と欧州連合（EU）7 番目のフレームワークプログラム（FP7/2007-2013）によって協調融資マリーキュリーCOFUNDプログラム「U-モビリティ」から資金提供を受けています。私たちの研究室での作業はVCにNIH、米国農務省/ NIFA、NSF、バードとBSFからの補助金によってサポートされています

1。タンパク質の発現<ol><li> 発現系の選択 システムを選択し、すなわち、ベクターおよび特定のモデル生物/細胞における目的タンパク質の発現のために最適なベクター送達方法。我々のアッセイは、最高の多数の細胞の一過性形質転換することにより達成される簡単に検出可能な量で試験したタンパク質の発現を必要とすることに注意してください。植物では、例えば、これは、最高の発現ベクターおよび送達系としてのアグロバクテリウムバイナリーとしてプラスミドを用いて達成される。 </li><li> バイナリー発現ベクターの構築 単独で又はエピトープタグに翻訳融合のいずれかで発現ベクターに関心対象のタンパク質のコード配列（単数または複数）をクローニングする。使用は、選択した発現系および遺伝子クローニングのための標準的な分子生物学的手順に適したベクター。アグロバクテリウム媒介遺伝子送達のために、スタンダを使用しても、バイナリーベクターを採用し、それらを導入このような植物組織のその後の接種EHA105、アグロバクテリウム株にRDプロトコル、。 </li><li> 植物種の選択 目的のタンパク質（単数または複数）発現される植物種を選択する。アグロバクテリウム媒介形質転換を受けやすい任意の植物種を用いることができるが、なお、選択された我々の植物種はアグロバクテリウム容易に影響を非常に受けやすく、成長させたベンサミアナタバコ 、であり、容易に接種する大きな葉を有する。 </li><li> 植物成長 長い一日の環境制御された条件（例えば、成長室）130（すなわち、16時間の下の鍋（19センチ×20センチ×20cm）に中のプロミックスBXと鍋に4から6週間の1の植物を育てる-150μEM-2、S-1 23℃での光と20°Cで8時間暗い）と40〜65パーセントの相対湿度。 時折、製造業者の指示に従って市販の製品と1.5.2肥やす。植物が成長されると、選択アグロバクテリウム接種のために（これらの長さの測定には葉柄が含まれていません）×70ミリメートル以上50ミリメートルの大きさに残します。 </li><li> アグロバクテリウムを接種 /適切な抗生物質（例えば、100mgを補充したYEP培地中で28°C（1％ペプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl）中で一晩、ステップ1.3から試験したタンパク質を発現するバイナリー構築物を保有するアグロバクテリウム株を成長させるLのストレプトマイシンおよびpPZP系- RSC2ベースのベクター24〜25）が10 mg / Lのリファンピシン。 1.6.2遠心浸潤緩衝液中でOD 600まで再懸濁した細胞、= 0.5 [10mMのMgCl 2、10mMのMesの液（pH 5.6）、100μMアセトシリンゴン]、そして室温で2時間インキュベートする。 1 mLの針なしの注射器を使用して、葉の背軸側に文化を浸透させる、植物に接続されている間葉は、その場で接種されることに注意してください。 1.6.3浸透後、16時間130〜150＆の光政権の下で72時間、植物を育てる＃181;のE、M-2、S-1収穫前に20℃で23℃/ 8時間の暗の光。 </li><li> プロテアソーム阻害剤の適用 テストされたタンパク質（S）は、プロテアソーム経路を介して分解されるという考えをサポートするために、軽減あるいは分解を遮断する必要のある、特定のプロテアソーム阻害剤MG132を使用し、28〜29をラクタシスチン。収穫前に4時間（ステップ2.1を参照）、それぞれの溶媒を用いて、10μMMG132（EMDミリポア）または10μMラクタシスチン（Sigma-Aldrich社）またはモック治療の葉にアグロバクテリウムを接種した葉の面積を浸透、すなわち、0.1％のDMSOまたは蒸留水。 </li></ol> 2。無細胞抽出物の調製<ol><li> 葉の収穫 葉の接種された領域、通常はCAを収穫。 200〜400新鮮重の物、そして液体窒素中で微粉末にそれらを挽く。代わりに、任意のビーズビーター（例えば、バイオスペック）または歯科混汞（例えば、TPC [詳細設定]を使用して、組織をビーズビート<html>直接分解緩衝液中の技術）（工程2.2を参照のこと）。 </li><li> タンパク質抽出 分解緩衝液500μLに接地組織を配置することによって、総タンパク質抽出物を調製[50mMのトリス-HCL（pH7.5）中、100mMのNaCl、10mMのMgCl 2、5mMのDTT、5mMのアデノシン5&#39;-三リン酸、および1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich社）〕。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、主に、セリン、システイン、アスパラギン、およびメタロに影響を及ぼし、26Sプロテアーゼと干渉しないことに留意されたい。 5分間12,000×gで2連続的な遠心分離によりエキスを明らかにする。 </li><li> タンパク質分解反応 チューブを微量遠心し、時間の期間を増加させるために、室温でそれらをインキュベートし、通常は20μL、抽出物の等容量を転送する。典型的には、サンプル時間ゼロ及び5、10、15、20、および30分の時点。 SDSゲル試料緩衝液中で煮沸することにより反応を停止し、ウェスタンブロッティングによってそれらを分析。 </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3。イムノブロッティングによりタンパク質分解の検出<ol><li> ゲル電気泳動 3.1.1 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質試料を解決し、標準的なプロトコル30に従ってニトロセルロース膜に分離したタンパク質をエレクトロ。 3.1.2 Bradford法（Bio-Rad）を用いてタンパク質濃度を決定し、レーンあたり総タンパク質50〜80μgのを読み込む。すべてのサンプルが均等にロードされていることを確認してください。ローディングコントロールの場合、このような50kDa付近の相対的な電気泳動移動度を有する主要なバンドとして移動推定のルビスコ大鎖のような遍在タンパク質種の強度を比較して、彼らは、クマシーブルー染色ゲル上またはポンソーS-または検出することができる蛍光SYPROルビー染色したニトロセルロース膜。 </li><li> ブロッキング 室温で1時間、TBST（10mMトリス-HCl、140mMのNaCl、0.05％のTween 20、pH7.4）中の5％スキムミルクで膜をブロックする。 </lI&gt; <li> 一次抗体 メーカーが推奨する濃度でTBST中の1％スキムミルクで一次抗エピトープ抗体を希釈し、穏やかに撹拌しながら4℃で、室温で1時間または一晩ブロックされた膜とインキュベートする。 </li><li> すすぎ 膜を一回15分間20mlのTBSTでリンスし、二回穏やかに攪拌しながら室温で5分間リンスされる。 </li><li> 二次抗体 製造業者により推奨されるようにTBST中の1％スキムミルクで西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲート二次抗体（例えば、抗ウサギIgG）を希釈し、穏やかに攪拌しながら室温で1時間、膜とともにインキュベートする。 </li><li> 検出 ステップ3.4で説明したように、再び膜を洗浄します。 TBSTで最後のすすぎの後、最も一般的にはECLキットを用い、HRP化学発光基質を用いて目的のタンパク質を可視化する。 </li></ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

このアッセイは、植物組織における試験したタンパク質の発現に依存しているため、潜在的なプロテアソーム分解プロセスは、明らかに、生体組織内で既に発生した。我々は、最初の基準点となる時間ゼロサンプルのみで、抽出物中で、しかし、タンパク質の不安定化をアッセイする。したがって、我々は、無細胞アッセイとして定義します。 このアッセイの成功のための1つの重要な側面は、試験されたタンパク質（複数）が生成される元となる発現ベクターの正しい選択である。テストされたタンパク質に対する特異的抗体が利用可能でない限り、それはエピトープタグウエスタンブロット法による検出のためにする必要があります。タグ付けされたタンパク質は、 アグロバクテリウムバイナリーベクターから発現されるべきである。多くのこのようなベクターは、26利用可能であるのに対し、我々はpPZP系- RCS2バイナリープラスミドに発現カセットの1ステップの挿入を可能にする私達のモジュラーPSATプラスミド系24、由来のベクターを使用することをお勧めし24〜25。 P...

ubiquitin/26Sプロテアソーム経路は、転写調節、細胞周期の進行およびシグナル伝達、ダウンレギュレーションまたはエンドサイトーシス受容体、とりわけ1-4を処理するなど、多様な生物学的反応を制御するための広範な機構として浮上している。この経路において、標的タンパク質は、第ユビキチン活性化酵素E1にチオールエステル結合を介して結合し、次いで、ユビキチン共役酵素E2のシステインアミノ酸残基に転残基をユビキチンによりタグ付けされ、最後に、E2は、ユビキチンリガーゼE3と相互作用する、タンパク質基質のユビキチン化をもたらす。最終的には、ポリユビキチン化タンパク質は、26Sプロテアソームによって認識され、分解される。このメカニズムでは、E3酵素は、基質を指定し、ubiquitin/26Sプロテアソームシステム（UPS）の重要な調節コンポーネントとして機能します。 E3リガーゼは、RINGドメインリガーゼとして、またはマルチサブSCF（Sの一環として、独立して機能することができ例えば、F-boxドメインリガーゼとしてkp1/Cullin/F-boxタンパク質）複合体。 SCF媒介性プロテアソーム分解経路は、転写、細胞周期、シグナル伝達5-10および他の多くの主要な細胞機能の調節に関与している。 細胞過程の調節に、これらの重要な役割に加えて、UPSは多くの植物 - 病原体相互作用の中心的舞台になります。例えば、証拠が増えアグロバクテリウムツメファシエンスを含むいくつかの植物病原体は、感染プロセス11を容易にするためのホストのUPSに依存していることを示唆している。アグロバクテリウムは、その自然のホストを表す植物に腫瘍性増殖を誘発し、それはまた、ヒトの細胞12,13に菌類1,2から、他の真核生物の広い範囲を変換することができます。その感染時に、アグロバクテリウムは、宿主細胞12月13日にDNAエレメント（T-DNA）およびいくつかの病原性（Virの）タンパク質をエクスポートします。これらのタンパク質の一つがVirF、最初に検出されたF-boxタンパク質である原核生物のゲノム14によって符号化される。 SCFユビキチンリガーゼ複合体、VirF、及びその機能宿主ホモログVBF 15の一部として、おそらくVirE2、それに付随する細菌および宿主のタンパク質から侵入する細菌のT-DNAの脱殻を容易にUPS媒介性タンパク質分解を介して 、アグロバクテリウム感染を容易にするとVIP1、それぞれ16,17。興味深いことに、VirFを含む多くのF-ボックスタンパク質は、原因自己ユビキチン化活性の18,19によってまたはF-ボックスタンパク質は、基質20〜23として役立つ可能性があるため、他のE3リガーゼによって媒介される、独自のタンパク質分解に本質的に不安定である。 F-ボックスタンパク質、他のユビキチンリガーゼ、および/またはそれらの基質の生化学的活性を研究する場合には、プロテアソーム分解のためのシンプルで信頼性の高いアッセイを使用することは非常に有用であろう。ここで我々は、細胞中のタンパク質の安定性を分析するためのそのようなプロトコルの1つを記載フリーシステム。このアッセイでは、UPS基材の安定性は、無細胞系において、例えば、F-boxタンパク質としてのプロテアソーム分解経路の必須成分の一つの存在下又は非存在下で分析される。一般に、我々は、植物組織中で試験タンパク質を発現するこれらの組織からの無細胞抽出物を調製し、ウェスタンブロッティングによって、目的のタンパク質（単数または複数）の量を監視する。タンパク質分解のUPS依存性機構は、特定のプロテアソーム阻害剤および/またはSCF成分、キュリンのドミナントネガティブ型の同時発現を使用して含めることによって実証される。我々は、F-boxタンパク質VBF 15によって、シロイヌナズナVIP1 17タンパク質のプロテアソーム分解を用いてこのアッセイを例示する一方で、それは他のプロテアソーム基質の安定性を調べるために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>プロテインアッセイキット</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase inhibitor cocktail&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>セミドライウェスタンブロッティング SD 電気転写システム</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>アフィニティー精製ウサギ 抗HA</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG ペルオキシダーゼコンジュゲート</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NTニトロセルロース転写膜</td><td>ポール・コーポレーション</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>イモビロン・ウェスタン化学発光HRP基質</td><td>EMDミリポア</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMDミリポア</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ラクタシスチン</td><td>・シグマ・アルドリッチ</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック・ピアス・ファスト・ウェスタン・ブロット・キット、ECL基質</td><td>ピアス</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

タンパク質分解のためにユビキチン - プロテアソーム経路は、事実上すべての真核生物における細胞機能の広範囲の調節のための最も重要なメカニズムの一つとして浮上している。具体的には、植物において、ubiquitin/26Sプロテアソームシステム（UPS）は、タンパク質分解を調節し、免疫応答、発生およびプログラム細胞死のプロセスを含む広範囲の開発に大きく貢献する。また、増加する証拠は、 アグロバクテリウムなどの多数の植物病原体は、植物-病原体相互作用におけるUPSの重要性を強調し、効率的な感染のホストにUPSを利用することを示唆している。 UPSの基質特異性は、E1とE2と協調して作用するE3ユビキチンリガーゼによって達成されるそれらにユビキチン分子の鎖を結合することによって分解宛ての特定のタンパク質分子を認識し、マークするリガーゼ。 E3リガーゼの一つのクラスは、SCF（Skp1と/ Cです具体的にはUPS基質を認識し、F-boxタンパク質成分を介してユビキチン化のためにそれらを標的ウルリン/ F-ボックスタンパク質）錯体。関心対象の生物学的プロセスにおけるUPSの潜在的役割を調査するために、UPS媒介性タンパク質分解のためのシンプルで信頼性の高いアッセイを考案することが重要である。ここでは、植物、無細胞系を用いてそのようなアッセイを記載している。このアッセイは、F-boxタンパク質 - 基質相互作用に特に焦点を有する多様な細胞プロセスにおける調節タンパク質分解の役割の研究に適合させることができる。

Zaltsman ら 17から適応図1は 、無細胞系におけるプロテアソーム分解の検出のための代表的な実験を示す。具体的には、NにSCF VBF経路 を介して VBFのF-ボックスタンパク質による植物防御関連タンパク質VIP1の不安定化を実証ベンサミ 。シロイヌナズナVBFおよびHA-タグ化VIP1（HA-VIP1）タンパク質を一過性同時発現させ、発現した葉の抽出物中のHA-VIP1コンテンツタンパク質は、ウェスタンブロッティングにより分析した。この分析は、VBFと共発現時にVIP1金額は、かなりの程度まで減少したことを証明したが、VBF共発現（ 図1A）が存在しない場合には比較的安定していた。 VBFのないVIP1コンテンツのわずかな減少は、内因性タバコVBF活動の低レベルに起因する可能性があることに注意してください。 VBFによるVIP1の不安定化のプロテアソームによる分解メカニズムは、その私から推測したMG132（ 図1A）</str...

標的タンパク質分解は、細胞機能の主要な調節機構を表す。その後、26Sプロテアソームのために、分子「タグ」を提供する標的タンパク質にユビキチン鎖が付加し保存され、ユビキチン-プロテアソーム経路を介して行われます。ここでは、タンパク質のプロテアソーム分解のための、シンプルで信頼性の高い無細胞アッセイを記述します。

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

本実験の目的は、無細胞系におけるタンパク質の安定性を分析することです。これは、バイナリーコンストラクトを含む標的タンパク質を保持させた異なるアグロバクテリウム株をOceana Bianaに接種することによって達成されます。次に、植物の葉から全タンパク質を抽出します。葉をマイクロ遠心チューブに移し、室温で時間を変えてインキュベートします。続いて、タンパク質サンプルをSDS-アクリロアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に電気転写します。特異的抗体を用いて目的タンパク質を検出するために、ウェスタンブロッティング解析に基づき、特定のプロテアソーム阻害剤の存在下または不在下におけるタンパク質の安定性を示す結果を得ます。ここでは、無細胞系において、プロテアソーム分解経路の必須成分の一つが存在する場合としない場合でのINEプロトソームシスト基質の安定性を研究するための簡便な手法について説明します。したがって、これらの手法は、より安全なプロテアソーム分解に関する知見を提供することができます。また、本手法は、多様な細胞プロセスにおける制御されたタンパク質分解の役割に関する研究など、他の系にも適用可能です。本デモンストレーションでは、NCOA hamanaを使用します。この植物は栽培が容易で、アグロバクテリウムに対する感受性が高く、接種しやすい大きな葉を持っているためです。環境制御下（長日条件、相対湿度40～65%）にて、promix Bを充填したポットで植物を4～6週間育成します。市販の肥料を製造元の指示に従って適宜施用してください。植物が成長後、50 mm × 70 mm以上のサイズの葉を選別します。アグロバクテリウム接種のため、目的タンパク質を発現するバイナリーコンストラクトを保持したアグロバクテリウム株を、適切な抗生物質を添加したYEP培地を用い、28°Cで一晩培養します。細胞を遠心分離した後、浸透緩衝液を用いて600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.5になるように再懸濁し、室温で2時間インキュベートします。1 mLの針なしシリンジを用いて、培養液を葉のAAL側に浸潤させます。浸潤後、同一の光条件下で植物を72時間育成します。採取の4時間前に、アグロバクテリウムを接種した葉の領域に、10 µMの阻害剤またはモックを浸潤させます。葉をそれぞれの溶媒で処理し、接種部位を採取します（通常、生重量で200〜400 mg）。採取した部位を液体窒素中で微粉末になるまですり潰します。次に、すり潰した組織を500 µLの分解バッファーに入れ、全タンパク質抽出液を調製します。タンパク質分解反応を行うため、12,000 ×g で5分間の遠心分離を2回連続して行い、抽出液を清澄化します。等量の抽出液（通常は20 µL）をマイクロ遠心チューブに分注し、室温で時間を変えてインキュベートします。通常、サンプル採取の0分、および5、10、15、20、30分後のタイムポイントを用います。SDSゲル用サンプルバッファーを加えて沸騰させ、反応を停止させた後、ウェスタンブロッティングで分析します。まずブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を測定し、1レーンあたり50〜80 µgの全タンパク質をロードして、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質サンプルを分離します。ローディングコントロールのために、すべてのサンプルが均等にロードされていることを確認してください。相対的な電気泳動移動度が約50 kDaの主要なバンドとして移動する、推定Rubis大鎖などの遍在的なタンパク質種の強度を比較します。標準プロトコルに従って、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、TBSTで調製した5%脱脂粉乳を用いて、室温で1時間膜をブロッキングします。次に、一次抗エピトープ抗体をTBSTで調製した1%脱脂粉緩衝液で、製造者が推奨する濃度に希釈します。この抗体を用いて、ブロッキング済みの膜を室温で1時間、または4°Cで緩やかに撹拌しながら一晩インキュベートします。次に、メンブレンを20 mLのTBSTで15分間1回、その後室温で穏やかに攪拌しながら5分間2回洗浄します。次に、メーカーの推奨に従い、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体をTBST含有1%脱脂乳で希釈します。TBSTで再度洗浄した後、二次抗体をメンブレンとともに室温で1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートし、HRPを用いて目的タンパク質を可視化します。代表的な実験結果により、植物の防御関連タンパク質の不安定化が示されています。SCF経路を介したVBFボックスタンパク質によるVeep oneの分解がN. hamanaにおいて実証されました。ウェスタンブロット解析により、Veep oneの量はVBFと共発現させた場合に有意に減少しましたが、VBFを共発現させない場合は比較的安定したままであることが示されました。VBFによるVeep oneの不安定化というプロテアソーム分解機構は、プロテアソーム阻害剤MG 1 32による抑制から推測されました。これらの結果を定量化したところ、VBFによってV oneがほぼ完全に抑制され、それがMG 1 32によって実質的に阻害されることが示されました。MG 1 32の存在下でV oneのレベルがわずかに高くなったのは、おそらく内因性VBFホモログの活性が抑制されたためと考えられます。このビデオを視聴したことで、プロテアソーム経路によるタンパク質分解の研究方法について十分に理解できたはずです。同様の実験デザインを他のあらゆる生物に適用することができ、多様な細胞プロセスにおける制御されたタンパク質分解の役割など、さらなる疑問を解消するために実施することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

生きた細胞内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン - 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン -...

デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

このビデオでは、プロテアソーム阻害剤を使用した細胞ベースのタンパク質凝集アッセイを実演します。これにより、蛍光標識に融合した誤って折りたたまれた突然変異タンパク質がユビキチン依存性のプロテアソーム分解を受け、細胞質内に蓄積するのを防ぎます。次に、タンパク質凝集体を蛍光顕微鏡で可視化し、定量します。...

Protein Aggregate Formation Assay:プロテアソーム阻害剤による誘導時に培養細胞内のタンパク質凝集を検出および定量する方法

このビデオでは、シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質の分解アッセイについて説明しています。この方法は、誤って折り畳まれたタンパク質のダイナミクスを研究し、タンパク質の代謝回転の詳細なメカニズムを明らかにするのに役立ちます。...

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

ここでは、ユビキチン-プロテアソームシステムによるタンパク質分解の相対的な速度を定量化するための堅牢な生物学的アッセイについて説明します。アッセイの読み出しは、液体培養における酵母の増殖速度であり、これは必須代謝マーカーに融合した分解シグナルを含むレポータータンパク質の細胞レベルに依存します。...

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

このレポートは、ウェスタンブロットまたは蛍光ベースのアッセイによって、誤って折り畳まれたタンパク質の分解速度を測定するためのプロトコルを説明しています。この方法は、他のミスフォールドタンパク質の分析やハイスループットスクリーニングに適用できます。...

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。...

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

このプロトコルは、パルスSILACによる老化細胞および非分裂細胞の代謝標識、非標的質量分析分析、およびタンパク質半減期の合理化された計算のためのワークフローを記述します。...

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

学ぶ植物の無細胞系を用いたプロテアソームによるタンパク質分解アッセイ法。Nicotiana benthamiana葉からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEとウェスタンブロッティングで安定性を解析します。ユビキチン・プロテアソーム経路の研究に応用可能です。

植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ

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