Name: 神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ ビオチン化タンパク質の発現・精製法。プラスミドを大腸菌に導入し、アフィニティークロマトグラフィーで精製する。神経組織再生などの応用研究に有用です。

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著者らは、この仕事をサポートして資金調達のためにアクロン大学を承認したいと思います。

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

組換えタンパク質工学は多くの分野にまたがる非常に強力な技術である。これは、カスタム設計のタンパク質の高収量の産生を可能にする、費用対効果の高い、調整可能な比較的簡単な手順である。これは、設計および標的タンパク質を発現することは必ずしも容易ではないことに留意することが重要である。基底発現および組換えタンパク質の安定性を、ベクターの特定の選択に依存E.大腸菌細胞株、ペプチドタグの追加や栽培パラメータ。私たちの具体的な設計基準は、十分に確立さEを利用して大腸菌はタンパク質工学のための株。さらに、プラスミドベクターは、安定な組換えタンパク質発現のためのT7のlacプロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。 高度に精製されたプラスミドサブクローンを取得した後、最初の主要な手順が正常に宿主細胞に標的タンパク質を形質との溶解度を決定することであるタンパク質。テスト式は、標的タンパク質の合成を最適化するのに最適な時期です。これは、プラスミドを含む細菌細胞のより良好な...

タンパク質は、最終的に適切な組織形成、組織を導く、多くの生物学的機能に関与している生体分子の広い範囲をカバーする。これらの分子は、人体内の均衡を維持し、規制アップ及び/またはダウンレギュレーション遺伝子および他のタンパク質を制御するシグナル伝達経路の数千を開始する。単一のタンパク質の破壊は、壊滅的な障害または疾患の発症につながることができた信号のこのウェブ全体に影響します。ラボで個々のタンパク質を設計することは、これらの悪影響に対処するための一つの解決策を提供しており、低分子薬物に代わるものを提供しています。 1977年には、14個のアミノ酸ソマトスタチン配列をコードする遺伝子は、E.を使用して作成された第一の操作されたポリペプチドの一つであった大腸菌 1。まもなく1979年の後、インスリンは、形質転換、プラスミドpBR322にクローニングし、発現させ、精製した2。それ以来、組換えタンパク質は、解像度の複数のフィールドに自分の影響力を拡大しているearch などの生体材料、ドラッグデリバリー、組織工学、バイオ医薬品、農業、産業用酵素、バイオ燃料として（レビューは参考文献3-8を参照してください）。これは、技術には、目的のために、化学的部分またはタンパク質配列の特定のアプリケーションの添加を介して提供し、これらに限定されないが、タンパク質同定、安定化および精製を標的とすることが汎用性によるところが大きい。 組換えDNA技術によって、組換えタンパク質は、哺乳動物、植物、昆虫、酵母、真菌、または細菌を含む真核生物および原核生物宿主系の種々の発現させることができる。各ホストは異なる利点を提供し、通常は最高のシステムは、タンパク質機能、収率、安定性、全体的なコスト、および拡張性に基づいて決定される。細菌細胞は、多くの場合、真核生物宿主（ すなわちグリコシル化、ジスルフィドブリッジ、Eを提供する翻訳後修飾のメカニズムを欠いている<html> TC。）5。しかしながら、これらのホストは、典型的にはより高価で時間のかかる09であり、その結果、哺乳動物および昆虫システムは、通常、真核生物のタンパク質のより良好な相溶性および発現をもたらす。従って、E.細胞は、安価な増殖条件および遺伝子発現機構において急速に拡大しているため、大腸菌は、よく理解されている5,9は、我々の発現システムのための好まれる宿主である。さらに、このシステムは、翻訳後修飾10の欠如にもかかわらず、機能的なタンパク質の生産を目的とし、その結果のためのスケールアップが容易である。 E.この株は、高い形質転換効率に基づいた優れたプラスミド収量を提供していますので、 大腸菌 K12株は、クローニングのために、このプロトコルで選択される。さらに、E.この宿主株は、制御されたタンパク質の発現および安定性11を提供するT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が含まれているため、 大腸菌 BL21株は、発現のために利用される。 10トン &quot;&gt;ホスト選択後、さらなる注意が組換えタンパク質を合成することは、バクテリオファージT7転写および翻訳シグナルの指示の下でクローン化され、標的DNA配列で始まる。選択され、制御されたタンパク質の発現を促進するために理想的な発現ベクターを選択する際に注意しなければならず発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子12の染色体コピーを含有する宿主細胞において誘導される。プラスミドベクターpBR322に由来するこれらのベクターは、（レビューのためには、13を参照する参照）、しっかりと最初にStudierら14によって開発されたT7プロモーターによって制御され、付加的に提供されているlacオペレーター 、およびlacリプレッサー（LAC1）15,16の包含を介して制御組換えタンパク質工学では、この発現系は、異なる標的DNA配列を挿入することにより、所望のタンパク質の特定のアミノ酸配列を調整するまたは融合タンパク質を作成する機能を提供合わせたドメインから構成されるシングルタンパク質からのS。さらに、いくつかのベクターシリーズはN又はC末端上に配置するペプチドタグ修飾を含む。我々の設計のために、ヒスチジン（His）タグは、精製の ​​ためのDNA標的配列に加え、15個のアミノ酸配列は、ビオチン化biotinylatable 17,18のために含めた。このプロトコルでは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドは、我々のbiotinylatable融合タンパク質配列を運ぶために選択した。発現はT7のlacプロモーターを介してこのベクター中に制御され、容易にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導される。 テスト式（小スケールの培養物）を、精製手順のいずれかを処方するために可溶性または不溶性の形態で発現することができる標的タンパク質の存在および溶解度を決定するために使用される。細菌細胞内で発現される可溶性タンパク質は、その天然の構造体19を維持するために自発的なフォールディングを受けることになる。通常、ネイティブ構造は熱力学的に有利である。多くの場合、宿主の代謝活性は、不溶性タンパク質産生および不溶性タンパク質凝集体からなる封入体の形成をもたらすシステムにストレスを与え、標的タンパク質に資するものである。従って、標的タンパク質は20生物学的に不活性な、一般的にそれらをレンダリングする、変性させる。両方のテスト式は、アップスケーリングされ、および単離手順は、標的タンパク質の溶解度によって決定される。追加の再生またはリフォールディングステップは不溶性タンパク質のために必要である。得られた組換えタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる。 家の中での組換えタンパク質産生は、標的タンパク質のミリグラム本培養のリットルあたり単離することができるので、市販品よりもコストの利点を提供する。必要な機器のほとんどは、一般的な生物学的または化学実験室で提供されています。タンパク質工学の作成を可能に常に市販されていない追加された機能を持つカスタムの融合タンパク質の。 図1は、組換えタンパク質を工学に関わる主な手順を示している。この発現系では、我々は、インターフェロン-γ、血小板由来増殖因子、および骨形成タンパク質21〜23のような多くのbiotinylatableタンパク質を、作成しているが、我々は我々が軸索ガイダンス、NGF（29 kDaのために設計された二つのタンパク質に焦点を当てます）とのSema3A（91 kDa）の10（レビューのための基準24を参照）。ビオチン化はよく知られているビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用して25-27標識タンパク質の同定、単離および固定化のための一般的な技術である。生物物理学的なプローブ28,29、バイオセンサ30と、量子ドット31は、10 27 -15 MのオーダーのK dで、ビオチン-ストレプトアビジン結合の高い親和性を利用するシステムのいくつかの例である。 E.大腸菌バイオスズリガーゼ、BirAをは、ビオチンタグの付いたシーケンス18,32内で見つかったリジン側鎖へのビオチンの共有結合を助ける。材料や生体分子へのテザリングビオチンは、複数の組織工学適用21,33-35用セルに成長因子の持続性送達を生産している。したがって、これらのカスタム設計biotinylatableタンパク質を設計することは複数の研究の利益を超越することができる強力なツールです。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジチオ-DL-スレイトール、DTT、99.5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-ヒドロキシエチルメルカプタン &β;-メルカプトエタノール</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>酢酸、氷河</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>寒天</td><td>バイオショップ</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>消泡剤 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 & マイクロ;g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) コンピテントセル</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml;発現宿主</td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>ゲルろ過標準</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 バイアル</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>グアニジン水閃化物 アミオホルマミジン塩酸塩</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA 樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>イミダゾール&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli サンプルバッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>ラウリル硫酸ナトリウム塩、ドデシルナトリウム表面</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Broth&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml;クローニングホスト</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 パック</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 & マイクロ;g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム ダイヤベーシック</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 1塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Broth Bioshop</td><td></td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸塩</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Tryptone, pancreatic</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>酵母抽出物,粒状</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp;&Auml;KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>キットとアクセサリーを含む</td></tr><tr><td>ベンチトップオービタルシェーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>酵素には反応バッファーとビオチン溶液が付属</td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr> <tr><td>透析チューブ</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25,000 and 50,000</td></tr><tr><td>Flow Diversion Valve FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Tube Racks, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>キットとアクセサリーが含まれています</td></tr><tr><td>加熱/冷蔵サーキュレーター&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>モデル 1156D</td></tr><tr><td>加熱オーブン FD シリーズ</td><td>バインダー</td><td></td><td>モデル FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>販売終了 - 交換品: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>969329</td><td>1 L ポリポルピレンボトルを含む</td></tr><tr><td>JS 5.3 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 シリーズ クリーンベンチ</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-gel vertical電気泳動システム</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Any kDa, 15-well</td></tr><tr><td>comb Ni-NTA Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp;ボリューム ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>丸底ポリプロピレン共重合体チューブ</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp;JA 25.50</td></tr><tr><td>ローターSpin-X UF濃縮器</td>用チューブ <td>コーニング</td><td>431488、431483</td><td>&nbsp;20および6 ml;MWCO:10,000 Da</td></tr><tr><td>サブクローニングサービス</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>Protein Services</td></tr><tr><td>超音波プロセッサ&nbsp;</td><td>コールパー</td><td>マー18910445A</td><td>モデルCV18</td></tr><tr><td>ボルテックス-魔神2</td><td>サイエンティフィックインダストリー</td><td>ズSI-0236</td><td>モデルG560</td></tr></tbody></table>

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

組換えタンパク質工学は、 大腸菌（E.coli）発現ほぼ40年のためのシステム、今日Eを利用している大腸菌はまだ最も広く使用されている宿主生物である。システムの柔軟性は、（ストレプトアビジン相互作用のための）ビオチンタグなどの部分と緑色蛍光タンパク質またはチェリーレッドのタンパク質のような大きな機能性タンパク質を付加することができます。また、翻訳後修飾を付与する金属イオンキレート剤、一意的に反応性官能基、分光学的プローブ、および分子などの非天然アミノ酸の組込みは、タンパク質の特性及び機能のより良好な操作を可能にした。その結果、この技術は研究の様々な分野のための重要なユーティリティを提供し、カスタマイズ可能な融合タンパク質を作成します。具体的には、biotinylatableタンパク質配列が原因アビジンおよびストレプトアビジンとビオチンとの間の高親和性相互作用の多くの標的タンパク質に組み込まれている。この追加により、タグ付けされたタンパク質の検出および精製を強化するだけでなく、このような細胞選別などの二次アプリケーションのための道を開くことに支援しています。このように、ビオチン標識分子がbioindustrialおよび生物医学分野で増加し、広範な影響力を示している。本研究の目的のために、我々は、神経成長因子（NGF）およびsemaphorin3A（Sema3Aの）機​​能的領域を含む組換えビオチン化融合タンパク質を設計している。我々は、これらのビオチン化融合タンパク質は、他の活性なタンパク質配列と共に、組織工学および再生の目的のための生体材料に繋留することができる方法を以前に報告した。このプロトコルは、T7 LAC誘導ベクターおよびEを利用し、ミリグラム規模でエンジニアリングbiotinylatableタンパク質の基礎を概説形質転換からのスケールアップおよび精製を開始大腸菌発現宿主、。

<html> クローニングとテスト式 めっきが適切に行われると、単一の単離されたコロニーをクローン形質転換された細菌細胞（ 図2A）プラッキングの可能性を高めるために形成すべきである。あまりにも多くの細胞を播種する場合は、プレートを37℃以下で変態が長すぎるインキュベートし、コロニーを寒天プレートを被覆または細胞の大きな凝集体（ 図2Bおよび2C）を形成してもよく、疑問である。テスト式中、NGFとのSema3Aは、第37℃で4時間誘導し、SDS-PAGE分析は、両方のタンパク質が可溶性画分（ 図2D）に位置していたと判定した。タンパク質の発現は、公正、したがって、18℃で一晩誘導と他のテスト式を検討したように見えた。のSema3A（ 図2E）との顕著な違いはなかったのに対し、NGFは、可溶性画分でより良い発現をもたらした。 &quot;&gt; 単離、精製お...

biotinylatable融合タンパク質を開発することは、研究の様々な分野で多くの潜在的な用途がある。組換えタンパク質工学は、カスタム設計されたタンパク質を高収率で提供する、費用対効果のある単純な手順である。

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

本手順の目的は、プローブ、センサー、ドラッグデリバリー、組織工学などのさまざまなアプリケーションに組み込むことができる、組換えビオチン化タンパク質を適切に設計、発現させ、単離することです。これは、まずカスタム設計したプラスミドを小規模培養を用いて細菌宿主細胞株に形質転換し、次に標的タンパク質の発現を誘導させることで達成されます。その後、適切な精製手順を策定するために、標的タンパク質の存在と溶解性を判定します。その後、標的タンパク質をより多量に得られるよう手順をスケールアップし、アフィニティークロマトグラフィー法を用いて単離します。最終的に、タンパク質を精製し、下流のアプリケーションおよび分析のために濃縮します。最終的に、SDS-PAGEおよびFPLCの結果により、リコンビナントタンパク質が正常に単離・精製されたことを検証し、さらにタンパク質の機能性を試験します。組換えタンパク質工学の主な利点は、正確な科学的仕様を満たすカスタム設計のタンパク質を、大規模またはミリグラムスケールで製造できることです。例えば、タンパク質の一部に新しい機能を付加することで、新たな特性を持たせることができます。本日は、特定のタンパク質の末端にビオチンを標識する方法について解説します。これを利用してタンパク質を表面に特異的に固定または係留させることで、神経突起の伸展や神経分化などの細胞機能を誘導させることができます。この手法に不慣れな方でも、天然または非天然タンパク質分離のいずれの手順に従えば、それほど困難なく実施できるはずです。多くの工程は共通していますが、天然条件または非天然条件のいずれかに合わせて調製された特定のバッファーが必要です。開始時の細部まで十分注意を払ってください。形質転換および試験発現段階を行うことで、後の最終スケールアップ工程において高いタンパク質収量を確保できます。この手法を視覚的に実演することは、シンプルな実験器具と消耗品を用いて組み換えタンパク質をどのように作製できるかを示すため、重要です。簡便なバッチ反応を利用し、等量化および増殖培地を用いてリーダースケールで培養することで、メイン培養1回あたり10 mgのタンパク質を産生します。さらに、タンパク質を下流のアプリケーションに向けてさらに精製する方法を示すために、クロマトグラフィー技術を用いて実演することができます。本日は、Cinema Labの大学院生であるAliciaがその手順を実演します。目的の標的タンパク質をクローニングして発現を確認し、20 mLの培養液を一夜培養した後、テキストプロトコルに従って、一夜培養した液をアンピシリンを含む1.8 Lの滅菌増殖培地に注ぎ、パステールピペットを用いて滅菌抗フォーム剤を6〜8滴加します。培養液を37 °Cのウォーターバスに入れ、0.2 µmフィルターを介して圧縮空気をエアレーションストーンから培養液中にバブリングさせます。培養液のOD 600が0.7〜0.8に達したときに1 mMのIPTGを加え、テスト発現においてタンパク質が可溶性画分または不溶性画分のどちらに見出されたかに応じて、37 °Cで4時間、あるいは18 °Cで一夜、誘導を行います。細胞を回収し、培養液を1リットルの遠心ボトルに移し、14,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。上清を捨て、細いスパチュラを用いて細菌ペレットを2本の50 mLチューブに回収します。さらに数分間遠心して細胞をペレット化し、その後、ペレットを-80 °Cで保存します。非天然タンパク質の単離を行うため、不溶性タンパク質を含む各凍結 E. coli ペレットに 20 milliliters の溶解・洗浄バッファーを加え、ボルテックスおよび振盪して再懸濁させ、大きな塊を除去します。変異原導入装置で一晩インキュベートした後、溶液は粘性の高いスラリー状になります。このスラリーを、室温で20,500 ×gで30分間遠心分離します。天然タンパク質を単離するために、上清を新しいチューブに移し、ペレットは廃棄します。ペレットを溶解バッファーで懸濁し、最終容量を30 millilitersにして、懸濁したペレットを氷上に置きます。ソニケーターを振幅30%、30秒オン・30秒オフのパルス設定にし、5分間処理します。ソニケーション中はチューブを上下に動かし、細胞ペレットを完全に分散させます。スラリーを20,500 ×g、4 °Cで30分間遠心分離します。その後、上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。非天然の単離タンパク質でアフィニティークロマトグラフィーを行うには、各遠心チューブに1 mLのニッケルNTA樹脂溶液を加え、室温のミキサーまたはシェーカーで1時間以上インキュベートします。スラリーをアフィニティーカラムに注ぎ、溶液がストップコックバルブを通して廃棄ビーカーに完全に滴下するまで待ちます。遠心チューブに10 millilitersの洗浄バッファーを加え、残ったレジンを除去し、溶液が滴下し終わった後にその溶液をカラムに加えます。ガラス棒を用いてレジンを撹拌し、次の洗浄液を加える前に滴下しきるまで待ちます。次に、10 mLの洗浄バッファーを用いて遠心チューブを再度すすぎ、それをカラムに移します。その後、1回あたり10 mLのライシス洗浄バッファーを用いて、カラムの洗浄をさらに8回行います。洗浄が完了したら、ストップコックを閉め、廃液ビーカーを50 mL遠心チューブに交換します。カラムに15 millilitersの溶出バッファーを加え、樹脂を攪拌し、溶液を5分間静置します。次に、ストップコックを開いてEITを回収し、さらに15 millilitersの溶出バッファーを用いて同様の操作を繰り返し、天然タンパク質を精製します。タンパク質溶液にニッケルNTA樹脂を加えた後、4 °Cの回転混和機で少なくとも1時間インキュベートします。洗浄バッファーでカラムを10回洗浄した後、5 mLの溶出バッファーを加え、レジンを5分間インキュベートします。その後、新しいチューブを用いてEITの大部分を回収します。EITがカラムから滴下している間に、透明な96ウェルプレートの各ウェルに90 µLのブラッドフォード試薬を加えます。バッファーによる5 mLごとの溶出ごとに、10 µLの溶液をカラムから90 µLのブラッドフォード試薬が入ったウェルに滴下させます。タンパク質が検出されなくなるまでEEUを継続し、透析または再精製を行います。各EITタンパク質を透析チューブに移し、適切なバッファーを用いて透析を行います。1つ目は4 °Cで4時間透析した後、バッファーを交換します。2つ目は4 °Cで一晩透析します。スピンコンセントレーターを使用して、透析後のタンパク質を5 mL未満に濃縮し、必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィーを用いてさらに精製します。テキストプロトコルに従い、試験的発現において、まずNGFとSEMA3Aを37 °Cで4時間誘導し、SDS-PAGE分析により両タンパク質がこの可溶性画分に存在することをe確認した。タンパク質の発現量は十分ではないと思われたため、18 °Cで一晩誘導する別の試験的発現を検討した。その結果、可溶性画分におけるNGFの発現は改善したが、SEMA3Aについては顕著な差は見られなかった。NGFをネイティブ条件下および非ネイティブ条件下で単離し、FPLCカラムを用いて精製しました。試験的な発現においてNGFは可溶性画分に存在していましたが、ネイティブ単離では、37 °Cおよび18 °Cの両方の誘導条件下で収率が低くなりました。一方、再自然化を伴う非ネイティブ単離により、より高いNGF収率が得られました。その結果、NGFは非天然条件で単離されました。18°Cで一晩誘導した後、非天然単離ではSEMA3Aの産生は認められませんでしたが、天然単離では2Lのメインカルチャーあたり8.61 ± 3.1 mgの産生が認められました。したがって、SEMA3Aを37°Cで4時間誘導し、天然単離のパラメータを用いて単離しました。FPLCピークを回収し、NGFおよびSEMA three AサンプルをSDS-PAGEで分析した。SEMA three AのFPLC出力で検出されたその他のタンパク質ピークを回収してSDS-PAGEで分析したところ、SEMA three Aの分子量領域には存在しなかった。これらの画分は、SEMA threeと同様の細胞ベースのアッセイにおける機能的挙動を示さなかったため、分解産物である可能性が極めて高い。ここにピークが示されています。組換えタンパク質の作製方法が確立され、習熟していれば、適切に実施することで単離および精製はわずか数日で完了します。しかし、タンパク質の溶解性を適切に確認するために、最初の細菌への形質転換および試験的発現段階にはより多くの時間を要します。溶解度を決定した後、形質転換した細菌のライブラリーを-80°Cで保存することができます。さらに、タンパク質発現後、E. coliペレットも、その後の単離および実験まで同様に-80°Cで保存可能です。この手順を行う際は、プロテアーゼによるタンパク質の変性や分解を防ぐため、バッファーを滅菌し、調製直後の新鮮なものを使用することが重要です。分離バッファーは4〜6週間ごとに調製し、滅菌させる必要があります。また、透析バッファーは分離の前日に調製してください。複数のビオチン化タンパク質によるクロスコンタミネーションを防ぐため、N-I-N-T-AおよびFPLCカラムは製造元のプロトコルに従って洗浄しておく必要があります。このビデオを視聴することで、細菌宿主発現システムを用いて、カスタム設計されたビオチン化タンパク質を発現、分離、および精製する方法について十分に理解できるはずです。これは、小規模および大規模の両方において、科学的および商業的に行われている手法と同様です。したがって、幅広い応用が可能です。

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

このビデオは、アストロサイト培養物からの細胞表面および細胞内タンパク質の単離を示しています。アストロサイト培養物を氷上に置いてエンドサイトーシスを阻害し、細胞表面タンパク質をビオチン化試薬で標識します。細胞を溶解して、ビオチン化細胞表面タンパク質と非ビオチン化細胞内タンパク質を放出します。最後に、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用して、ビオチン化された細胞表面タンパク質を細胞内タンパク質から分離します。...

アストロサイト培養物からの細胞表面および細胞内タンパク質の単離

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。...

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。...

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。...

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

ここでは、インビトロ神経内皮共培養システムと、一次神経幹および前駆細胞を拡張し、その表面に標識するバイオオルトホグナル機能基を持つシアログリカンの代謝組み込みを組み合わせたプロトコルです。細胞表面マーカーのイメージングまたは質量分析分析のためのサイアログリコタンパク質。...

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。...

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Avi配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)は、コスト効率の高い方法でHEK293細胞で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。BDNFaviは、その後、チューブ内の酵素BirAで直接モノビオチン化されます。BDNFaviおよびモノビオチン化BDNFaviは、市販のBDNFと比較して生物学的活性を保持します。...

ニューロンの細胞密売研究のためのチューブ内の組換えBDNFを精製し、直接モノビオチン化するための改良されたプロトコル

このプロトコルは、目的のタンパク質に融合したビオチンリガーゼへのビオチンの近接性に基づいて、タンパク質へのビオチンの in vivo...

インビボParamecium tetraureliaにおけるタンパク質相互作用研究のための近接ビオチン化

学ぶ ビオチン化タンパク質の発現・精製法。プラスミドを大腸菌に導入し、アフィニティークロマトグラフィーで精製する。神経組織再生などの応用研究に有用です。

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

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