神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

この手順の全体的な目標は、プローブ、センサー、薬物送達、組織工学などのさまざまなアプリケーションに組み込むことができる組換えビオチン化タンパク質の設計、発現、単離を成功させることです。これは、まずカスタムデザインのプラスミドを小規模培養物を用いて細菌宿主細胞株に形質転換し、次に標的タンパク質の発現を誘導することによって達成されます。次に、適切な精製手順を策定するために、標的タンパク質の存在と溶解性を決定します。

次に、手順をスケールアップして標的タンパク質の収量を増やし、アフィニティークロマトグラフィー技術を使用して単離します。最後に、タンパク質は精製され、ダウンストリームアプリケーションと分析のために濃縮されます。最終的に、SDSページとFPLCの結果により、組換えタンパク質の単離と精製が成功したことが確認され、タンパク質の機能性がさらに試験されます。

組換えタンパク質工学の主な利点は、当社の正確な科学的仕様を満たすために、大規模またはミリグラムスケールのカスタム設計タンパク質を作成できることです。例えば、これらのタンパク質の一部に新たな機能を追加して、新たな特性を実現することができます。今日は、特定のタンパク質の末端にビオチンを添加する方法をお見せします。これを使用して、これらのタンパク質を表面に特異的に固定化またはつなぎ、ニューロンの成長やニューロンの分化などの細胞機能をガイドします。

この技術に不慣れな個人は、ネイティブまたは非ネイティブタンパク質の単離の手順に従う際にそれほど困難はありません。多くのステップは同じですが、ネイティブまたは非ネイティブ条件のいずれかに定式化された特定のバッファーが必要です。最初の間は細部にまで細心の注意を払います。

形質転換および発現試験の段階により、後の最終スケールアッププロセスで高いタンパク質収量を確保できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、簡単な実験装置と消耗品を使用して組換えタンパク質を作成する方法を示しているため、重要です。単純なバッチ反応を利用して、e equalizeと増殖培地はリーダースケールで成長し、メイン培養ごとに10ミリグラムのタンパク質が生成されます。

さらに、クロマトグラフィー技術を使用して、タンパク質が下流のアプリケーションのためにさらに精製される方法を示すことができます 今日、大学院のCinema LabであるAliciaは、目的の標的タンパク質での発現をクローニングしてテストした後、20ミリリットルの培養物を一晩で成長させる手順をデモンストレーションします。テキストプロトコルに従って、アンピシリンと無菌増殖培地の1.8リットルに一晩の培養液を注ぎ、パスターピペットを使用して、0.2ミクロンのフィルターを介して37°Cの水浴に6〜8滴の滅菌反泡2 0 4場所培養物を追加し、曝気石を介して培養物に圧縮空気を泡立てます。培養物が1ミリモルのIPTGで0.7〜0.8のOD600に達し、37°Cで4時間、または18°Cで一晩誘導すると、タンパク質が試験発現の可溶性画分に見つかったか不溶性画分に見つかったかによって異なります。

細胞を収集し、培養物を1リットルの遠心分離瓶に移し、14,000倍の重力と摂氏4度で15分間回転させる実験。スーパーナチンを注ぎ、細いヘラを使用して、バクテリアペレットを2本の50ミリリットルのチューブにすくい取ります。細胞を再び遠心分離して数分間ペレット化してから、ペレットを摂氏マイナス80度で保存します。

非天然タンパク質を実行するため。各凍結大腸菌ペレットへの不溶性タンパク質の分離。20ミリリットルの溶解液、洗浄バッファー、ボルテックスを加え、振とうして再懸濁し、大きな塊を取り除きます。

ミューテーター上で一晩インキュベートすると、溶液は粘性のあるスラリー遠心分離機のようになります。スラリーを 20 、 500 倍の重力と室温で 30 分間放置します。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄して天然タンパク質を分離します。

Resusは、再懸濁したペレットを氷上に置き、最終容量30ミリリットルで溶解バッファーにペレットを懸濁します。超音波処理を30%に設定 amp30秒オフで30秒のパルスで、5分間超音波処理します。超音波処理中にチューブを上下に揺らして、細胞ペレットを完全に分解します。

スラリーを20、500倍の重力と摂氏4度で30分間遠心分離します。次に、上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。非天然単離タンパク質でアフィニティークロマトグラフィーを行うには、各遠心チューブに1ミリリットルのニッケルNTA樹脂溶液を添加し、ミューテーターまたはシェーカーで室温で少なくとも1時間インキュベートします。

スラリーをアフィニティーカラムに注ぎ、溶液がストップコックバルブを介して廃棄物ビーカーに完全に滴下されるようにします。遠心分離管に10ミリリットルの洗浄バッファーを加えて残留レジンを除去し、溶液が滴り落ちた後に溶液をカラムに加えます。ガラス製の攪拌棒を使ってレジンを攪拌し、滴下を止めてから、再度洗浄を加えます。

次に、10ミリリットルの洗浄バッファーを使用して、遠心分離管のすすぎを繰り返し、カラムに移します。次に、各洗浄ごとに 10 ミリリットルの溶解洗浄バッファーを使用してカラムをさらに 8 回洗浄します。洗浄が完了したら、ストップコックを閉じ、廃棄物ビーカーを50ミリリットルの遠心分離管と交換します。

15ミリリットルのelucian緩衝液をカラムに加え、樹脂を攪拌し、溶液を5分間放置します。次に、ストップコックを開いてEITを回収し、さらに15ミリリットルの溶出バッファーで繰り返してネイティブタンパク質を精製します。ニッケルNTA樹脂をタンパク質溶液に添加した後、4°Cのミューテーター上で少なくとも1時間インキュベー

洗浄バッファーを使用してカラムを10回洗浄した後、5ミリリットルの溶出バッファーを添加し、レジンを5分間インキュベートしてから、新しいチューブを使用してEITの大部分を回収し、EITがカラムから滴下している間に、ブラッドフォード試薬のウェルあたり90マイクロリットルを透明な96ウェルプレートに加えます。バッファーを含む 5 ミリリットルの elucian ごとに、10 マイクロリットルの溶液をカラムから 90 マイクロリットルの Bradford 試薬を含むウェルに滴下します。透析および/またはRenaのための蛋白質が検出されなくなるまでEEUを続けます。

タンパク質は、各EITを透析チューブに移し、適切なバッファーに対して、摂氏4度で1時間透析した後、それぞれのバッファーと交換します。摂氏4度で一晩中2回。スピン濃縮器を使用して、透析タンパク質を5ミリリットル未満に濃縮し、必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィーを使用してさらに精製します。

試験発現中のテキストプロトコールによれば、NGFおよびSE 3 Aを最初に摂氏37度で4時間誘導し、SDSページ解析により、両方のタンパク質がこの可溶性画分に位置していることが決定されました。タンパク質の発現は良好であると思われたため、摂氏18度で一晩誘導した別の試験発現が検討されました。NGF発現は可溶性画分で改善しましたが、SEMA 3では顕著な差はありませんでした。

NGFは、ネイティブおよび非ネイティブの条件下で単離し、FPLCカラムを通過して精製しました。試験発現中にNGFは可溶性画分に含まれていましたが、ネイティブ分離は摂氏37度と摂氏18度の両方の誘導で低収率を示しました。しかし、再ナチュレーションを伴う非天然単離により、より高い収量のNGFが得られました。

その結果、NGFは非天然条件下で単離されました。摂氏18度で一晩の誘導後、非ネイティブ分離は、ネイティブ分離のための2リットルのメイン培養あたり8.61プラスマイナス3.1ミリグラムの生産にSEMA3をもたらしませんでした。したがって、SEMA 3 Aを摂氏37度で4時間誘導し、ネイティブ分離パラメータを使用して分離しました。

FPLCのピークを収集し、NGFおよびSEMAの3つのAサンプルをSDSページで分析しました。SEMA three A の FPLC 出力で見つかった追加のタンパク質ピークは、SDS ページで収集および分析されましたが、SEMA 3 A 分子量領域には存在しませんでした。これらの画分は、SEMA 3のように細胞ベースのアッセイでは機能的に振る舞わなかったため、分解生成物である可能性が最も高いです。

ここにピークを示します。組換えタンパク質が確立され習得されると、適切に実施されれば、分離と精製には数日しかかかりません。しかし、初期の細菌形質転換と試験発現試験の段階では、タンパク質の溶解性を適切に特定するために、より長い時間がかかります。

溶解度が決定されると、形質転換された細菌のライブラリをマイナス80度で保存できます。さらに、タンパク質発現後、大腸菌ペレットは、さらなる単離および実験までマイナス80度で保存することができます。この手順を試みるときは、プロテアーゼが変性してタンパク質を分解するのを防ぐために、バッファーが滅菌され、新鮮にされていることを確認することが重要です。

分離バッファーは4〜6週間ごとに作成および滅菌する必要があり、透析バッファーは分離の前日に作成する必要があります。N-I-N-T-A および FPLC カラムは、複数のビオチン化タンパク質によるクロスコンタミネーションを防ぐために、メーカーのプロトコルに従って清浄である必要があります。このビデオを見れば、細菌の宿主発現システムを使用してカスタムデザインのビオチン化タンパク質を発現、単離、精製する方法を十分に理解できるはずです。

これは、科学的にも商業的にも小規模に行われていることと似ています。したがって、これは幅広い用途があります。