発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

この手順の全体的な目的は、マウス脳の生体スライスにおいて、神経前駆細胞の有糸分裂のイメージングおよび解析を行うことです。これは、まず胚から脳を摘出することで達成されます。次のステップでは、ビブラトームを用いて脳スライスを作製します。

次に、脳切片のライブイメージングを行います。最終ステップでは、動画から情報を抽出し、目的の有糸分裂パラメータを解析します。最終的に、タイムラプス顕微鏡を用いて、脳の前駆細胞集団がどのようにリアルタイムで分裂するかを示します。

固定分析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、生きた脳切片において神経前駆細胞分裂の経時的なダイナミクスに関する重要な知見を得られることです。また、遺伝的な摂動が神経前駆細胞の分裂にどのような影響を与えるかを理解するためにも利用可能です。本研究では皮質の発達を理解するためにこの手法を用いていますが、ここで述べた解析は、他の脳領域、さらには脳以外の幹細胞の有糸分裂の研究にも応用できます。

この手順の実演は、私の研究室の博士研究員である Louis y が行います。まず、マウス胚を回収し、後脳および2つの大脳半球を含む4つの脳からなる胚脳を切り出します。氷を入れたバケツに、包埋用モールドを置くための穴を開けておきます。

次に、3% aros培地をプラスチック製の型に注ぎ、その型を氷の中の穴に配置します。デジタル温度計の先端でaros培地を撹拌し、温度が35 °Cに達するまで待ちます。その後、速やかに脳を包埋剤に移し、脳とarosの界面にある余分なHBSSを取り除きます。

脳を包埋液の中で、慎重に、かつ優しく繰り返し回転させます。ピンセットを使用すると、氷に接しているモールドの底部に、ゲル化したアガロースのクッションが形成されます。脳を撹拌している間に、ピンセットの先でクッションが感じられるようになったら、脳の背面を上にして配置します。このとき、脳がモールドの完全に底部まで沈み込まないようにしてください。

カミソリの刃でモールドの角を切り出す前に、氷の中でアロスを少なくとも5分間硬化させます。埋没させた脳への乱れを避けるため、切断回数を最小限に抑えながら、脳の周囲にアロスブロックを慎重に切り出します。VT 1000 s Viomeを用いて、200から250 micronの切片を作成します。

次に、Cyto 11を成長因子を添加したスライス培養液で、最終濃度が0.5から1 µMになるように希釈します。12ウェルプレートの各ウェルに染色液2.5 mLを入れ、1つの脳から採取したスライスを37 °Cで1時間インキュベートします。その後、染色液を含まないスライス培養液2.5 mLでスライスを20分間洗浄します。脳切片をマウントするために、35 mmガラスボトムマイクロウェルディッシュの底にコラーゲン溶液を1滴滴下します。

ピペットチップを用いて、スライスのサイズに合わせて広げます。次に、スライスをコラーゲンの一滴の中に移します。スライスを室温で10分間インキュベートした後、5% carbon dioxide濃度の37 degree Celsiusインキュベーターに移します。

ガラスボトムマイクロウェルディッシュにスライス培養液を合計1.2 milliliters加え、20分後、一度に600 microlitersずつ培養液を加え、ピペットチップで広げます。スライスを、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideのインキュベーター内で少なくとも1時間30分間回復させた後、同条件の回転ディスク共焦点顕微鏡のインキュベーションチャンバーへと移します。ライブイメージングには、作動距離300 microns、開口数1.3の60 xシリコンオイル浸漬対物レンズを使用してください。

細胞イメージングでは、スライス表面から約40 µm下に中心を据え、30 µmのZスタックで細胞を撮影します。必要に応じて、光退色を抑えるためにレーザー強度と露光時間を調整してください。露光時間はcyto 11信号の強度に応じて30から200 millisecondsの範囲で使用します。以下は、Image Jを用いて有糸分裂像を特定するために、この解析から得られる代表的なデータです。ある1箇所のデータセットをハイパースタックとして開いた後、組織と細胞が健全に見えるZ平面を1つ選択します。

時間を遡り、細胞が有糸分裂に入る時点を特定します。細胞はZ平面をまたいで移動する可能性がありますが、時間分解能および前述のZackパラメータは、このプロセスを可能にするよう最適化されています。スプレッドシートに、有糸分裂に入る際のハイパースタック内における細胞の4つのD座標を記録してください。

これらの座標を把握しておくことで、同一の細胞を重複してカウントすることを防げます。時間を進めながら、細胞がある相から次の相へと移行した時間を記録してください。特定の細胞における各有糸分裂相の持続時間を記録し、細胞の3D再構築および中期の回転の定量化を行います。

複数の有糸分裂細胞を特定した後、ある細胞の座標を使用し、開始時点まで時間を前方へスクロールします。中期のハイパースタック全体を回転させ、脳室境界を平面状にします。この回転に適用する角度を決定するには、アングルツールを使用してください。

対象の細胞が最も鮮明に観察できるZ平面を特定します。矩形選択ツールを使用して、細胞全体を含むように選択範囲を指定します。次に、対象の細胞が含まれるZ平面を特定し、画像の複製（duplicate）コマンドを使用してサブスタックを作成します。

ダイアログボックスで、「Duplicate Hyperstack」にチェックが入っていることを確認し、スライスを選択します。Zパラメータは、細胞全体を含むZ平面に対応し、Tパラメータは現在のタイムポイントに対応します。その後、細胞の3D再構成を行います。

現在のタイムポイントです。スライス間隔（slice spacing）は、Z平面画像の各画像間の間隔をミクロン単位で示したものです。スクロールバーを使用して、得られた3D再構成画像を回転させ、中期板（metaphase plate）の端が見えるようにしてください。

フレーム番号はベータ角に対応しています。この番号を記録してください。次に、水平線とアライメントバイズの間の角度を測定してください。

メタフェーズプレート（中期の赤道面）を垂直に切断します。これが角度αの記録です。対象となる細胞の、中期のすべてのタイムポイントにおけるこれらの角度を示しています。

時点tとt-1の間の回転角は、背腹軸に沿った時点tにおける角度と時点t-1における角度の差の絶対値に等しくなります。放射状グリア細胞（RG cells）の基底部突起は短く、そのため切片作成時に切断される可能性が低いため、脳切片の背側領域で有糸分裂を最も容易にイメージングできます。吻尾軸に沿っては、背側皮質の吻側領域の切片が最も一貫した結果をもたらします。

これらは、イメージングに適した領域と不適切な領域の例です。適切な領域では、核が楕円形であり、タイムラプスイメージングの前に脳室の境界で多くの有糸分裂細胞が観察されます。不適切な領域では、脳室の境界で観察される有糸分裂細胞が非常に少なく、核は円形です。

ここでは、ライブイメージング前に低倍率顕微鏡で観察された良好な切片の例と、有糸分裂の異なる段階にあるcyto 11標識細胞の例を示します。ここでは、本手順に従った後、脳室境界領域において2つの神経前駆細胞が異なる色の有糸分裂の段階を経ていく様子をモンタージュで示しています。分裂細胞の運命や細胞骨格の挙動など、さらなる疑問を解消するために、DNAコンストラクトの中性エレクトロポレーションなどの他の手法を実施することも可能です。

また、有糸分裂を追跡するためには、CY 11に加えて、H2B-VGFP transgenic miceなどの二次的な手法を用いるのが最適です。このビデオを視聴することで、脳切片の操作方法、最適なマッチングパラメータ、およびデータの解析方法について十分に理解できるはずです。