発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング
2014年6月4日
神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。
この手順の全体的な目標は、生きたマウスの脳スライスにおける神経前駆細胞の有糸分裂のイメージングと分析を行うことです。これは、最初に胚から脳を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、ビブラートで脳のスライスを準備することです。
次に、脳切片のライブイメージングを行います。最後のステップは、映画から情報を抽出して、関心のある有糸分裂パラメータを分析することです。最終的に、タイムラプス顕微鏡法を使用して、脳の祖先集団がどのように分裂するかをリアルタイムで示します。
この手法が既存の方法(固定解析など)よりも優れている点は、生きた脳スライスにおける神経前駆細胞分裂の時間的ダイナミクスについて重要な洞察を得ることができることです。また、遺伝的摂動が神経前駆細胞の分裂にどのように影響するかを理解するためにも使用できます。皮質の発達を理解するためにこの方法を使用しますが、私たちが説明した分析は、他の脳領域や脳外の幹細胞の有糸分裂の研究にも適用できます。
この手順を実証するのは、私の研究室のポスドク研究員であるLouis yです。この手順は、マウスの胚を採取することから始め、後脳と2つの大脳半球を持つ4つの脳を含む胚の脳を解剖します。氷の入ったバケツに、埋め込み型用の穴を氷に開けます。
次に、3%アロス培地をプラスチックの型に流し込み、その型を氷の穴に入れます。温度が摂氏35度に達するまで、デジタル温度計の先端でaros培地をかき混ぜます。次に、脳を埋め込み媒体に迅速に移し、脳とアロスの間の界面で過剰なHBSSを除去します。
埋め込み溶液中で脳を慎重にゆっくりと繰り返し回転させます。鉗子を使用すると、氷と接触する型の底にゲル化したアロスのクッションが形成されます。脳を攪拌しながら鉗子の先端でクッションを感じることができれば、背側を上にして脳を配置すると、脳が型の底に沈むことはありません。
アロスを氷で少なくとも5分間固めてから、かみそりの刃で型の角を切ります。脳の周りに慎重にarosブロックを彫り、埋め込まれた脳を乱さないように切り傷の数を最小限に抑えるようにしてください。VT 1000 s Viomeを使用すると、200〜250ミクロンのスライスが生成されます。
次に、成長因子と12ウェルプレートを添加したスライス培養培地で、細胞11を最終濃度0.5〜1マイクロモルに希釈し、1つの脳からのスライスを各ウェルの染色溶液2.5ミリリットルで摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、溶液を染色せずに2.5ミリリットルのスライス培地でスライスを20分間洗浄します。脳切片をマウントするには、35mmのガラス底のマイクロウェル皿の底にコラーゲン溶液を一滴垂らします。
スライスのサイズに合わせてピペットチップで広げます。次に、スライスをコラーゲンの滴に移します。スライスを室温で10分間インキュベートしてから、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに移します。
ガラス底ミクロに合計1.2ミリリットルのスライス培養培地を20分後、一度に600マイクロリットルの培地をよく皿に盛り付け、ピペットチップで広げる。スライスをインキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で少なくとも1時間30分間回復させてから、同じ条件でスピニングディスク共焦点顕微鏡のインキュベーションチャンバーに移します。ライブイメージングに関しては、作動距離が300ミクロン、開口数が1.3の60 xシリコンオイル対物レンズを使用します。
細胞イメージング画像の場合、30ミクロンのZスタック内の細胞は、スライスの表面から約40ミクロン下に位置するZスタックの中心にあります。必要に応じて、レーザー出力と露光時間を調整して光退色を制限し、Cyto 11シグナルの強度に応じて30〜200ミリ秒の範囲の露光時間を使用します。これは、この分析から画像Jの有糸分裂像を特定するために達成できる代表的なデータです.ハイパースタックとして1つの位置のデータセットを開いた後、組織と細胞が健康に見えるZ平面を1つ選択します。
時間をさかのぼってスクロールして、細胞が有糸分裂に入る時点を特定します。セルは Z 平面を横切って移動することがありますが、前述の時間分解能と Zack パラメーターは、このプロセスを可能にするために最適化されています。スプレッドシートで、細胞が有糸分裂に入るときの細胞の4つのD座標をハイパースタックに記録します。
これらの座標を知っていると、同じセルを何度もカウントするのを防ぐことができます。時間を前方にスクロールし、セルが 1 つのフェーズから別のフェーズに進行する時間を記録します。特定の細胞の各有糸分裂期の期間を文書化して、細胞の3D再構成と中期の回転の定量化を行います。
複数の有糸分裂細胞が特定されたら、細胞の座標を使用して、先頭まで時間を前方にスクロールします。中期は、心室境界が平坦になるようにハイパースタック全体を回転させます。角度ツールを使用して、この回転に適用する角度を決定します。
対象のセルがその平面で最も目立つ Z 平面を特定します。四角形選択ツールを使用して、セル全体を含む選択範囲を描画します。次に、対象のセルを含むZ平面を特定し、image duplicateコマンドを使用してサブスタックを作成します。
ダイアログボックスで、スライスを「duplicate hyper stack」にチェックを入れたままにします。Z パラメーターはセル全体を含む Z 平面に対応し、フレーム T パラメーターは現在の時点に対応します。その後、セルの 3D 再構成を生成します。
現在の時点。スライス間隔は、各 Z 平面イメージ間の間隔 (ミクロン単位) に対応します。スクロールバーを使用して、結果として得られる3D再構成を回転させ、中期プレートの端が見えるようにします。
フレームの番号はベータ角に対応します。この番号を記録します。次に、水平と整列の間の角度を測定します。
中期プレートを垂直に解剖します。これが角度アルファレコードです。これらの角度は、対象細胞のすべての中期時間点についてです。
時間点 t と t の間の回転角度から 1 を引いた角度は、t での角度と T でのこの角度から背側腹軸に沿った 1 を引いた角度の絶対値に等しくなります。有糸分裂は、R GCの基礎プロセスが短く、したがってバイオムによって切断される可能性が低いため、脳スライスの背側領域で最も簡単に画像化されます。ROSコドル軸に沿って、背側皮質のコドル領域のスライスが最も一貫した結果をもたらします。
これらは、イメージングに適した領域と悪い領域の例です。良い地域で。核は楕円形で、不良領域でのタイムラプスイメージングの前に心室の境界に多くの有糸分裂細胞が観察されますが、心室の境界には有糸分裂細胞がほとんど観察されず、核は丸いです。
これは、ライブイメージングの前に低倍率顕微鏡で観察された良好なスライスの例であり、有糸分裂のさまざまな段階でのCyto 11標識細胞の例です。ここに示されているのは、この手順に従って、2つの神経前駆細胞が異なる色でマークされた有糸分裂の異なる段階を通過する心室の境界にある領域のモンタージュです。DNAコンストラクトの中性エレクトロポレーションなどの他の方法を実行して、分裂する細胞の運命や細胞骨格の振る舞いなど、追加の質問に答えることができます。
また、有糸分裂の追跡には、H 2 VGFPトランスジェニックマウスなど、CY 11を超える二次的な方法を使用するのが最善です。このビデオを見れば、脳スライスの操作方法、最適なマッチングパラメータ、データの分析方法についてよく理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、生きたマウスの脳切片における神経前駆細胞の分裂のイメージングと分析について説明します。この技術により、制御された環境で分裂の高い時間的・空間的解像度での観察が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生体イメージング技術
背景
- 神経前駆細胞の分裂は神経形成に不可欠です。
- 従来の研究では固定組織の分析に頼っていました。
- 生体イメージングは細胞プロセスの動的な視点を提供します。
- 分裂の理解は発生生物学と神経発達性障害に情報を与えることができます。
研究の目的
- 神経前駆細胞の分裂の生体イメージングを行うこと。
- リアルタイムで分裂パラメータを分析すること。
- 脳前駆細胞の動態の理解を深めること。
使用された方法
- マウス胚からの脳の解剖。
- 振動ブレードを用いた脳切片の準備。
- 分裂を観察するための脳切片の生体イメージング。
- 前駆細胞分裂の詳細な分析のためのタイムラプス顕微鏡検査。
主要な結果
- 生体切片における神経前駆細胞分裂の成功したイメージング。
- 前駆細胞集団分裂のリアルタイム観察。
- 主要な分裂パラメータの特定。
- 神経形成の動態に関する洞察。
結論
- 生体イメージングは神経前駆細胞の挙動を研究するための強力なツールです。
- このアプローチは神経形成のより良い理解につながる可能性があります。
- 今後の研究はこれらの発見を基に神経発達プロセスを探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live imaging of mitosis in embryonic mouse cortex enables direct observation of neural progenitor division dynamics, providing critical insights for early neurodevelopmental target validation. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies by capturing real-time cellular events and quantifiable mitotic parameters. The method supports translational continuity from discovery biology to preclinical model development in neuropharmaceutical R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitotic mechanisms underlying neurodevelopmental disorders.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting neural progenitor division.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying mitotic phase durations and spindle dynamics.
- Provides high-resolution data for prioritizing neurodevelopmental targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated ex vivo brain slice systems for compound or genetic screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs on mitotic progression and cellular morphology.
- Enables standardization of imaging and analysis parameters for cross-study comparability.
- Prepares robust platforms for evaluating candidate interventions on neural progenitor mitosis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitotic phenotypes with disease-relevant neurodevelopmental models.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of neuroactive compounds.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on live cellular outcomes.
- Facilitates biomarker identification through dynamic imaging of mitotic events.
Pipeline & Workflow Integration
This live imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational model development for neuropharma pipelines.
- Discovery Biology: Provides direct hypothesis testing of mitotic regulation and pathway involvement in neural progenitors.
- Screening: Offers assay-ready, reproducible brain slice systems with quantitative mitotic readouts.
- Analytics: Delivers time-resolved, spatially precise measurements of mitotic phases and spindle orientation.
- Translational Research: Connects cellular phenotypes to disease models for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible platform adaptable to diverse genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental research.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing high-content, quantitative mitotic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection, live imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and computational analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data annotation.
- Adaptable to various genetic backgrounds and fluorescent labeling strategies.
- Imaging depth and tissue health may limit applicability to certain brain regions or developmental stages.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Dissection and Embedding of the Embryonic Brains
2:24
Embedded Brain Sectioning and Staining
3:59
Live Imaging of the Slices
4:55
Post-acquisition Analysis of Mitosis
7:34
Results: Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex
8:43
Conclusion
