粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

この手順の全体的な目標は、3次元がんモデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の縦方向の変化を測定することです。これは、最初にがん細胞を採取し、腫瘍ステロイドを適切な方法で成長させることによって、目的のサイズに達するまで達成されます。第2ステップは、腫瘍ステロイドをコラーゲンまたは他の適切な細胞外マトリックスに埋め込むことです。

次に、サンプルポイントのグリッドが構築され、各ポイントでビデオが撮影されます。最後のステップは、ビデオ データを分析し、各空間ポイントで実際の論理プロパティを計算してコレジストレーションすることです。最終的に、このプロトコルはトレーサープローブの軌跡の分析を使用して、細胞外マトリックス力学の空間変化を非破壊的に経時的に定量化します。

この考え方は、細胞外マトリックス放射線学のイメージングベースの測定とin vitro 3D腫瘍モデルを組み合わせることで、細胞外マトリックス相互作用を回復させることにより、このアプローチは、腫瘍増殖浸潤プロセスに伴う機械的微小環境の時間依存性の変化、および治療への反応に関する定量的な洞察を提供できるというものです。このビデオで示されている方法は、aros オーバーレイアプローチを採用して、確立された膵臓がん細胞株 pan one から非接着性の 3D OID を生成します。まず、10ミリリットルの細胞培養グレードの水と0.1グラムのアロスを混合して、1%アロス溶液を得ます。

アリの前にaros溶液を摂氏70度以上に加熱します。96ウェルプレートの各ウェルに40マイクロリットルの溶液を引用し、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、トリプシンを介して癌細胞を収穫し、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり1000細胞に希釈する前に単一細胞懸濁液を調製します。この希釈液の100マイクロリットルを、硬化したアロスベッドを含むウェルに加えます。

インキュベーション後、サンプルを摂氏37度、CO2濃度5%に設定されたインキュベーターで一晩シェーカーに置きます。シェーカーからサンプルを取り出し、100マイクロリットルの細胞培養培地を加え、得られたステロイドを所望の直径に達するまでインキュベートする。例えば、9日後、鍋、1つのステロイドは直径で約450ミクロンになります。

まず、層流フードの内側にワークステーションを準備し、2つの2ミリリットルバイアルを準備します。バイアル 1 には腫瘍ステロイドが含まれ、バイアル 2 には無細胞コントロールが含まれます。カルボン酸修飾1ミクロン径蛍光トレーサープローブの希釈混合物を調製し、ストックプローブ25部を滅菌水25部に加えます。

冷蔵庫からミリリットルあたり3.1ミリグラムのボトル、ウシコラーゲンを取り出し、氷のアリコート125マイクロリットルのコラーゲン、続いて50マイクロリットルの希釈トレーサープローブ溶液をバイアル1ボルテックスに短時間置いてプローブを分配します。次いで、フェノールレッドを含有する適切な細胞培養培地235マイクロリットルを総量410マイクロリットルに加え、205マイクロリットルを取り出してバイアル2に入れる前に、短時間ボルテックスします。次に、約2マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムをバイアルに加えます。

1つは、溶液を中性pHの渦に戻し、短時間混合することです。その後、混合物が硬化し始めないように、すぐにアイスラックに戻します。腫瘍ステロイドを含むウェルから40マイクロリットルの培地を静かに取り出します。

次のステップを実行する間、この40マイクロリットルを保持します。ウェルをチェックして、前のステップでステロイドが除去されたかどうかを確認します。そうでない場合は、40マイクロリットルをウェルに戻し、前の手順を繰り返します。

もしそうなら、ステロイドを含む40マイクロリットルをバイアルに加えます。1つは穏やかに攪拌バイアル1つは、96ウェルプレートの3つの別々のウェルに60マイクロリットルの部分で混合物を移す前に、混合物を追加した後、顕微鏡で各ウェルを検査し、ステロイドが含まれているウェルを決定します。次に、約2マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムと40マイクロリットルの細胞培養培地をバイアル2に加え、アリの前にボルテックスします。

この混合物の60マイクロリットルを96ウェルプレートの空のウェルに引用し、無細胞コントロールとしてラベル付けします。プレートを摂氏37度のインキュベーターに置き、少なくとも1時間硬化させてサンプルポイントのグリッドを構築します。まず、サンプルプレートをインキュベーターから顕微鏡ステージに移します。

加熱ステージが利用できない場合は、サンプルが室温まで平衡化するまで10分間待ちます。低倍率の対物レンズでサンプルを観察し、サンプルが無傷でイメージングの準備ができていることを確認します。ウェル内の腫瘍の位置を決定し、これを透過光画像で文書化し、その後の空間的共レジストレーションに使用します。

通常、S回転楕円体の周囲に同心円状のリングに分布する各ウェルの20個のサンプルポイントは、十分に詳細な結果を生成します。ステージを各希望の位置に移動し、顕微鏡インターフェースソフトウェアを使用してXNY座標を記録します。顕微鏡を高倍率対物レンズに切り替え、トレーサープローブのxサイテーション波長に適したフィルターキューブを選択します。

作成したポイントのリストを使用して、グリッド内の最初のポイントに移動します。上に移動する前に、焦点を調整して井戸の底を見つけます。焦点が合ったトレーサープローブがいくつか含まれている視野を見つけるため。

強度ヒストグラムを観察し、露出強度と時間を調整して、画像が飽和しないようにしながら、可能な限り最大のダイナミックレンジを提供します。フレームあたり 20 から 30 ミリ秒のフレーム レートでビデオ シーケンスを取得し、適切な命名規則で保存します。記録中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。

グリッド内の各サンプルポイントに対して録音を繰り返します。次に、実験の各井戸にグリッドを構築するプロセスを繰り返し、毎回プロセス全体を繰り返します。縦方向のモニタリング期間をポイントします。

データ分析を開始します。すべてのビデオデータを解析フォルダにコピーします。画像データをMATLABまたは別の解析ソフトウェアにインポートします。

ビデオの複数のフレームを分析してソフトウェアをキャリブレーションし、プローブの中心位置を特定するための選択パラメータと拒否パラメータを適切に決定します。次に、ソフトウェアを使用して、すべてのビデオフレームの各プローブ位置を自動的に決定し、これらの位置を軌道にリンクします。軌跡データを使用して、平均二乗変位またはMSDをラグタイムの関数として計算し、特定の対物レンズまたは任意のピクセルベニングに適切な空間キャリブレーション係数を適用するようにします。

一般化されたストークス・アインシュタイン関係を使用して、特定のサンプルに対する一般化されたストークス・アインシュタイン関係の適用限界を考慮して、G Starを計算します。実験の各視野について、分析手順を繰り返します。位置データを特定の対象周波数で粘弾性mod Iと共登録します(使用する顕微鏡のメーカーによって異なります)。

このステップは、顕微鏡のメタデータを読み取ったり、位置データを手動で集計したりするカスタムルーチンによって促進できます。ビデオシーケンスは、3D腫瘍結節を含む代表的なウェル内の複数の空間位置で取得され、パンの周辺にある細胞の集団を縦断的にモニターすると、サンプルの空間マイクロ放射線マップを提供するためにリンクされます。この例で使用されているステロイドの1つは、周囲のコラーゲン繊維を自発的に分解し、数日以内に細胞外マトリックスに侵入します。

この例では、マイクロ オロジーの共レジストレーションにより、ステロイドの左側で発生するマトリックスへの明らかな侵入が定量的に読み取られますが、右側では発生しません。これらの異なる空間領域を縦断的にモニタリングすると、侵入に伴って約4桁の複素粘弾性せん断弾性率の実成分が低下していることが示されています。全周波数依存のデータは、4日目の領域1と領域2の資料の対照的な神学的特性を示しています。

この手順を試行する際は、プローブの軌跡の分析中に不適切な結論につながる一般的な落とし穴を避けるように注意する必要があります。読者の皆様には、ここで引用されているPTMの文献を参照することをお勧めします。この文献では、サンプルのドリフトや不均一性の解釈などの考慮事項が取り上げられています。この手順は、追加の縦方向または末端蛍光イメージングと組み合わせることで、機械的リモデリングが主要なシグナル伝達イベントや介入に対する細胞毒性反応とどのように相関するかなど、他の疑問に答えることができます。