Name: 粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶ粒子追跡マイクロレオロジーを用いた3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定法。この非破壊的手法により、腫瘍微小環境の力学的変化を定量的に解析し、がん進行の理解と治療戦略の向上に貢献する。

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Maria Kilfoil 氏 (<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/) から提供された MATLAB 粒子追跡コード</a>と、John C. Crocker 氏と Eric R. Weeks 氏から提供された以前の IDL コードと広範なドキュメンテーションがオープンソースで共有されたことに感謝します。この研究は、国立がん研究所(NCI / NIH)、K99CA155045およびR00CA155045(PI:JPC)からの資金提供によって可能になりました。

1。培養腫瘍球<ol><li> 1％アガロース溶液を得るために、アガロース0.1gの細胞培養グレードの水10mlを混合する。 </li><li> 96ウェルプレートにウェルにアガロース溶液40μlを小分けする前に、70℃以上（標準電子レンジでまたは加熱板を用いておよそ14秒）への熱アガロース溶液。 </li><li>標準的な技術を用いて細胞を採取しながら、少なくとも1時間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>懸濁液中の細胞の濃度を決定するために、血球計を使用する。 </li><li>千個/ mlに細胞懸濁液を希釈し、十分に硬化したアガロース床を含む、この希釈液100μlを加える。 </li><li> 37℃、5％CO 2に設定したインキュベーター内で一晩振とう機上でサンプルを置きます。 </li><li>シェーカーからサンプルを取り出して、細胞培養培地を100μlを加える。 </li><li>所望の直径に到達するまでスフェロイドをインキュベートする。例えば、9日後に、SPheroidは、直径約450ミクロンとなります。この時間の間、新鮮な増殖培地をウェルに添加することができるが、これは回転楕円体の除去をもたらすので、吸引は避けるべきである。 </li></ol> 2。ECMに埋め込まれた3D腫瘍球の準備<ol><li>層流フード内に必要な材料とワークステーションを準備します。 </li><li> 25部の滅菌水に2部株価プローブ（2％固体）を添加することにより、カルボン酸で修飾された直径1μm蛍光トレーサープローブの希釈液を調製する。 </li><li>冷蔵庫から3.1 mg / mlのウシコラーゲンのボトルを取り出して、氷の上に置きます。 </li><li>空の2ミリリットルバイアルにアリコートコラーゲンの125μlの。 </li><li>プローブを配布するために簡単にコラーゲンと渦を含むバイアルに希釈したトレーサープローブ溶液50μlを追加します。 </li><li> 41の総容積のために（黄色に変わります）フェノールレッドを含む適切な細胞培養培地の235μl加え205ミリリットル（ハーフ総量）を除去し、新たな2ミリリットルバイアル中に配置する前に簡単に0ミリリットルと渦。バイアル1は、腫瘍スフェロイドが含まれていますし、バイアル2は、対照混合物となります。 </li><li>中性pH（フェノールレッドを含む培地が赤に戻らなければならない）に戻す解決策を持って来るために1をバイアルに1 M NaOHでの〜2を添加する。これは混合物は、それが氷上に保持されていない場合は、硬化を開始させることに注意してください。簡単に、すぐに氷棚に戻り、その後、混合する渦。 注：回転楕円体は、文化の9日後に肉眼ではほとんど見えないし、アガロース床からの除去がデリケートな作業である。解剖顕微鏡の使用は、一部のユーザーのために有用であり得る。転送中に回転楕円体の完全性を維持することが最重要である。 </li><li>広口ピペットチップを使用して、静かによく腫瘍スフェロイドを含むからメディアを40μlを削除します。次のステップを行いながら、この40μlを保管しておいてください。 </li><li>回転楕円体かどうかを確認するために十分に確認してください前のステップで除去した。それがあった場合は、1をバイアルに回転楕円体を含む40μlを加える。ていない場合は、バックウェルに40μLを配置し、前の手順を繰り返します。 </li><li>静かに96ウェルプレートの3つの別々のウェルに60μlの部分に物を転送する前に（ボルテックスを危険にさらすしないでください、それは回転楕円体に損傷を与える場合があります）バイアル1をかき混ぜる。うまく回転楕円体が含まれているかを決定するために混合物を添加した後に顕微鏡で各ウェルを検査します。 </li><li>コントロールとして96ウェルプレートとラベルの空のウェルにこの混合物の60μlのを等分する前にバイアル2と渦に〜2μlの1 M NaOHおよび細胞培養培地40μlを追加します。 </li><li>少なくとも1時間、硬化させるために37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol> 3。サンプル点のグリッドを構築し、各ポイントで動画を撮影<ol><li>顕微鏡のステージにインキュベーターからサンプルプレートを転送します。サンプルのための10分EQUILすることができます加熱されたステージが利用できない場合、室温でibrate。 </li><li>必ずそれはそのままとイメージングのための準備ができているように、低パワーの対物レンズで試料を観察する。ウェル内の腫瘍の位置を決定する。 </li><li>取る何サンプル点を決める。一般的には、回転楕円体の周囲に同心円状に分布して各ウェル中の20のサンプル点は、十分に詳細な結果が生成されます。 </li><li>各目的の位置にステージを移動し、（ソフトウェアのインタフェースが使用できない場合は、手動で座標またはレコード）は、x座標とy座標を記録するために顕微鏡のインタフェースソフトウェアを使用しています。 </li><li>ハイパワーの対物レンズ（通常は100倍）に顕微鏡を切り替え、トレーサープローブの励起波長のための適切なフィルターキューブを選択します。グリッドの最初のポイントに移動するために、ステップ3.4で作成された点のリストを使用してください。 </li><li>視野を見つける上に移動して、ウェルの底を見つけることでピントを合わせる（FOV）は、いくつかの焦点の合ったTracを含むERプローブ。 </li><li>輝度ヒストグラムを観察し、画像が飽和しないようにしながら可能な最大のダイナミックレンジを与えるために露光強度や時間を調整します。 </li><li>フレーム当たり20〜30ミリ秒のフレームレートでビデオシーケンスを取得する（約800フレームまたは長さが16〜24秒では、各空間格子点における捕捉時間を最小化する必要性とのバランスがロバストMSD計算のための十分な統計を提供することをお勧めします）そして、適切な慣例で保存します。録音中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。 </li><li>繰り返しは、グリッド内の各サンプル点のために3.9〜3.6を繰り返します。 </li><li>繰り返し実験で各ウェルについて3.10に3.3を繰り返します。 </li></ol> 4。各サンプル点でのレオロジー特性を計算するためにビデオデータの分析<ol><li> （おそらく別のコンピュータ上の）分析フォルダに、すべてのビデオ·データをコピーします。 </li><li> MATLABにインポートされた画像データや他の解析ソフトウェア。 NOTEは：ここで採用したMATLABの粒子追跡ルーチンのセットに関する詳細なドキュメントは次の場所にあります<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> 。異なる位置に複数のファイルの処理を自動化するためのカスタム呼び出し元の関数の使用が推奨されます。 </li><li>適宜、プローブの中心位置を識別するための選択および拒絶パラメータ（サイズ、帯域など）を決定するために、ビデオのいくつかのフレームを分析することによってソフトウェアを較正する。これらの重要なステップのための広範囲な背景はクロッカーとグリアに記載されている。 </li><li>自動的にすべてのビデオフレームのための各プローブの位置を決定し、軌道にこれらの位置をリンクするためにソフトウェアを使用する。 </li><li>など具体的な対物レンズ、任意のピクセルビニングのために適切な空間較正係数（ピクセルあたりμm）を適用してくださいという、遅れ時間の関数としての平均二乗変位（MSD）を計算するために軌跡データを使用します（通常は行わメタデータ）。 </li><li>特定のサンプル24,28,43用GSERの適用可能性の限界は、また、ユーザは単にべき乗スケーリング、プラトーを比較することにより、MSDから直接ECMのプロパティを解釈したい場合を考慮し一般化されたストークス·アインシュタインの関係を用いて、G *は（計算異質性やその他のパラメータの値、指標。 </li><li>繰り返し実験で、各FOVのために4.6を通じて4.2を繰り返します。 </li><li>関心のある特定の周波数での粘弾性moduliiでステップ3.4からの位置データを共同登録してください。使用される顕微鏡の製造業者によっては、このステップは、顕微鏡メタデータまたは位置データを手動で表にすることができる読み出すカスタムルーチンによって促進することができる。 </li><li> ECMの空間的なレオロジーマップを生成する3次元の補間関数を使用します。 </li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルでは、3D腫瘍モデルにおけるECM剛性の局所的な変化を縦断的に追跡するための堅牢で広く適用可能な戦略を導入します。この方法論は、腫瘍の成長および浸潤プロセス中のマトリックスリモデリングに関与する機械感受性挙動に関心のあるがん生物学者および生物物理学者によって採用される可能性があると想定しています。マトリックス分解速度論の正確な定量化は、マトリックスリモデリングに直接関連する3D腫瘍モデルにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ、リシルオキシダーゼ、またはその他の関連する生化学種の活性を研究する人々にとって特に価値がある可能性があります。ここで説明する3D腫瘍モデルへの適用を超えて、時間の経過に伴うマトリックスレオロジーの変更が重要な役割を果たす他の疾患モデルシステムと組み合わせて、このアプローチの実装をさらに想像することができます46,47。この方法の有用性は、プロセスをさらに自動化し、スループット研究の向上を可能にするソフトウェアの改善を通じて強化され続けています。これにより、マルチウェルフォーマットで使用するために、多くのサンプルの物理的状況のスナップショットが同時にますます詳細になります。...

それは、癌細胞が、非悪性の哺乳動物の上皮細胞と同様に、周囲の細胞外マトリックス（ECM）の機械的および生物物理学的特性および他の微小環境の成分1-9に非常に敏感であることが文献において多くの証拠から明らかである。エレガントなメカニズムの研究は、悪性増殖挙動や形態形成2,3,10,11を規制する複雑な機械受容シグナル伝達パートナーのような細胞外剛性の役割への洞察を提供してきました。この研究は、生物学的に関連する組織の構造を復元し、調整可能な力学と足場材料中で増殖させ、光学顕微鏡12-19によって画像化することができるインビトロ腫瘍モデルにおける 3Dの開発によって、特に、促進された。しかし、今度は癌細胞がその周囲のレオロジーを改変を通して、腫瘍微小環境との間のこの対話mechanoregulatory、他方の側は、多少残る勉強するのがより困難。例えば、侵入プロセスの間、腫瘍の周囲の細胞は、順番にの機械受容増殖挙動に影響を与えるECM 20-22の局所的な劣化を引き起こす間葉移行（EMT）に上皮を受け、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現を増加させることができる他の近位の腫瘍細胞。生化学的プロセスのさまざまな、癌細胞は、継続的に異なる時間に異なるプロセスに合わせて上下にその環境の局部剛性をダイヤルします。ここに記載された方法論は、3D腫瘍モデルと統合され、文化を終了せずに生化学的および表現型の変化を縦方向に相関させることができる成長中の剛性とECMの遵守の局所的な変化を報告分析ツールの必要性が動機とされている。 これに関連して実施するための適切な技術を求めて、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）が有力な候補として浮上。この方法は、メイソンとワイツ23,24によって元々の先駆者、ミクロンの長さスケールでの周波数依存性複合体の粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために、複雑な流体中に埋め込 ​​まれたトレーサプローブの動きを使用しています。この一般的なアプローチは、ソフト凝縮物質、コロイド、生物物理学、高分子物理学25-31で別の用途に適した複数のバリエーションで展開してきた。局所粘弾性の読み出しを培養調製時に組み込まれ、成長の長期間にわたって定位置に残留する生化学的に不活性トレーサープローブの非破壊ビデオイメージングにより提供されているのでPTMは、他の方法に比べて特定の利点を有している。これは必ずしも文化の終了を必要とし、複雑な3D腫瘍microenvir内のポイントの測定値ではなく、サンプルのバルク巨視的レオロジーを報告する振動剪断バルクレオメーター、とゴールドスタンダードの測定とは対照的であるふりかかる。実際、多くの研究は、細胞遊走32、拡大回転楕円体33によって誘発される機械的ストレス、細胞内レオロジー34,35に関連付けられた変形を測定するために、癌または非癌細胞または周りトレーサープローブの動きの測定値を解釈するの有用性を例示している機械的応力とひずみエンジニアリング組織36内、および細孔径および浸潤速度の37との関係をマッピングする。例えば、原子間力顕微鏡（AFM）などのマイクロレオロジーのに適した他の技術は、実現することができるが、主に、試料表面の点をプロービングするための長手方向の測定値38を複雑培養無菌性の問題を引き起こすことがある。 ここでは、確実に空間をマッピングするためのビデオの粒子追跡および分析方法のために埋め込まれた蛍光プローブを用いたECMへの転送に適した3D腫瘍スフェロイドの成長のための方法を網羅する総合的なプロトコルを記述文化の中で時間をかけてマイクロレオロジーの変化。現在の実装では、3次元腫瘍モデルはこのフォーマットが助長している他の伝統的なアッセイ（ 例えば 、細胞毒性）とマイクロレオロジー測定を組み込むことを視野に、マルチウェル形式で増殖させる。この方法論のこの代表的な実例では、本明細書に記載のPANC-1細胞を用いてインビトロ 3Dスフェロイド培養 、スフェロイド39を形成することが知られている確立された膵臓癌細胞株が、すべての測定は、様々な細胞株を用いて、固形腫瘍を研究するために広範に適用可能である3D培養に適しています。この方法は、本質的に画像化ベースであるためには、理想的に細胞の増殖、移動および表現型の変化をレポートビューの大透過光のフィールドを持つ高解像度のマイクロレオロジーデータの共同登録のために適しています。このように、透過光顕微鏡と統合され、PTMの実装では、顕微鏡ステージWHの再現可能なポジショニングを前提としていICHは電動商用広視野落射蛍光生物顕微鏡に一般的に使用可能です。下の開発されたプロトコルは、いかなる合理的に装備し、自動化蛍光生物顕微鏡を用いて実施することができる。これはオフライン処理のためのデジタルビデオ顕微鏡ギガバイトのデータの取得が必要で、本質的にデータ集約型の方法である。 以下のプロトコルにおいて、プロトコル1アガロース上でオーバーレイを使用してここに記載されているが、このような懸滴40、又は41回転培養技術などの他の様々な方法で置換することができる腫瘍スフェロイドの最初の調製に関する。プロトコル2は、代替的に、 インビトロの3D腫瘍はECM 12,15で再懸濁された細胞ではなく、単一の予め形成された非接着性スフェロイドの封入又は包埋することによって成長させることができたもののコラーゲン足場でスフェロイドを埋め込 ​​む方法が記載されている。その後のプロトコルは、Oのための手順について説明それぞれ、ビデオ顕微鏡データを取得し、処理することにより、時間分解マイクロレオロジー測定をbtaining。データ処理は、もともとも広範囲に異なるソフトウェア·プラットフォーム用に開発されているクロッカーとグリア42で説明したアルゴリズムに基づいて構築さPTMのためのオープン·ソース·ルーチンを利用して、MATLABを使用して記述されている（参照http://www.physics.emory.edu/ 〜週/ IDL /）。

<table><tbody><tr><td>ウシ1型コラーゲン</td><td>BDバイオサイエンス、カリフォルニア州サンノゼ</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>アメリカンタイプ細胞培養、マナサス、バージニア</td><td>州CRL1469</td><td>またはその他の適切な細胞タイプ</td></tr><tr><td>蛍光マイクロスフィア</td><td>ライフサイエンス、カリフォルニア州カールスバッド</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス、ベッドフォード、マサチューセッツ州</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td><td>スフィッシャーBioreagents, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96-well Imaging plates</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>または適切な細胞培養培地</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Microscope</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>ハイスピードカメラを含むおよびイメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

機械的な微小環境は、それ自体が複雑な、双方向の機械受容相互作用のセットの一部として改造および修飾された腫瘍増殖挙動およびシグナル伝達の重要な調節因子として作用することが示されている。生物学的に関連する3D腫瘍モデルの開発は、腫瘍成長に対するマトリックスレオロジーの影響に関する機構研究を促進してきたが、腫瘍によって誘発される機械的環境におけるマッピングの変更の逆問題は、依然として厳しい。ここでは、縦方向にその場で 、腫瘍微小環境内の物理的変化を監視するための堅牢かつ実行可能なアプローチの一環として、膵臓癌の3Dモデルと連携して、粒子追跡マイクロレオロジー（PTM）の実装について説明します。ここに記載した方法では、蛍光標識プローブが均一に経口投与するための分散モデル細胞外マトリックスI型コラーゲンの（ECM）足場内に埋め込 ​​まインビトロ 3Dモデルを製造するシステムを統合試料全体sitionおよび時間依存性マイクロレオロジー測定。 インビトロ腫瘍はマルチウェルイメージングプレートを用いた並列状態でプレーティングし、プローブする。確立された方法で描画、トレーサプローブの動きのビデオは複雑な周波数依存粘弾性せん断弾性率G *（ω）を報告するために一般化ストークスアインシュタインの関係（GSER）を介して変換されます。この方法は画像ベースであるため、機械的特性評価も同時に3Dの腫瘍の大きさと表現の質的変化を報告するために大規模な透過光の空間のフィールドにマッピングされます。ローカライズされた侵入に誘導されるマトリックス分解だけでなく、システムのキャリブレーションに関連するサブ地域での機械的応答を対比示す代表的な結果は、検証データを提示する。一般的な実験誤差およびこれらの問題のトラブルシューティングから望ましくない結果も提示されています。このプロトコルで実装された96ウェルの3D培養メッキ形式はc治療スクリーニングアッセイまたは機械的微小環境に対する治療的または生化学的な刺激の影響に新たな洞察を得るための分子イメージングとマイクロレオロジー測定の相関onducive。

複雑な腫瘍微小環境モデル内の局所的な位置におけるG*(ω)測定の妥当性を検証するため、2つの初期検証実験が行われました。まず、バルク振動せん断レオメトリーという「ゴールドスタンダード」に対して、我々の測定値が妥当であるかを確認しました。コラーゲン濃度 1.0 mg/ml のコラーゲンマトリックス（細胞なし）の同一サンプルを用意しました。これらのサンプルをバルクレオメータ（TA Instruments AR-G2、40 mm パラレルプレートジオメトリを使用）および PTM（本プロトコル全体を通じて同じパラメータを使用）で測定し、得られた G'(ω) および G" (ω) の測定値を比較しました（Figure 2A）。2つの測定値の間で極めて良好な一致が見られました。次に、ECM レオロジーの点的な変化を測定する本プロトコルの能力を確立するため、1.0 mg/ml のコラーゲンマトリックスを用意し、トレーサービーズを埋め込みました。その後、コラーゲンを急速に消化する dispase 5 μl を中心に注入しました（Figure 2B）。局所的なコラーゲン...

粒子追跡マイクロレオロジーは、3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の変化を非破壊的に定量化し、空間的にマッピングするために使用できます。

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

本手順の全体的な目的は、3次元がんモデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の経時的変化を測定することです。まず、がん細胞を回収し、適切な方法で腫瘍スフェロイドを所望の大きさに達するまで育成します。次に、腫瘍スフェロイドをコラーゲンまたはその他の適切な細胞外マトリックスに包埋します。次に、サンプルポイントの格子を構成し、各ポイントでビデオ撮影を行います。最終ステップでは、ビデオデータを解析し、各空間ポイントにおける実際の論理的特性を算出して共登録します。最終的に、本プロトコルではトレーサープローブの軌跡解析を用いることで、細胞外マトリックス力学の空間的変化を非破壊的な手法で経時的に定量化します。この手法のコンセプトは、細胞外マトリックスの放射線学的イメージングに基づく測定と、細胞外マトリックスの相互作用を再現したin vitro 3D腫瘍モデルを組み合わせることにより、腫瘍の増殖、浸潤プロセス、および治療への反応に伴う機械的な微小環境の時間依存的な変化について、定量的な知見を提供することにあります。本ビデオで示す手法では、確立された膵がん細胞株であるpan oneから非付着性の3D OIDを生成するために、arosオーバーレイ法を採用しています。まず、細胞培養グレードの水10 millilitersに0.1 gramのarosを混ぜ、1%aros溶液を作成します。Ali前に、aros溶液を70°C以上に加熱します。96ウェルプレートの各ウェルに溶液を40 µLずつ分注し、プレートを37°Cで1時間インキュベートします。トリプシンを用いてがん細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製した後、細胞懸濁液を1000 cells/mLに希釈します。この希釈液100 µLを、硬化したarosベッドを含むウェルに添加します。培養後、サンプルを37°C、5%CO2に設定したインキュベーター内のシェーカーに置き、一晩振とうします。シェーカーからサンプルを取り出し、100 µLの細胞培養培地を加え、目的の直径に達するまで得られたステロイドを培養します。例えば、9日後には、1つのステロイドの直径は約450 micronsになります。まず、ラミナーフローフード内にワークステーションを準備し、2 mLのバイアルを2本用意します。1本目のバイアルには腫瘍ステロイドを、2本目のバイアルには無細胞コントロールを入れます。ストックプローブ2部に対して滅菌水を25部の割合で加え、カルボキシ基修飾1 µm径蛍光トレーサープローブの希釈混合液を調製します。3.1 mg/mLのウシコラーゲンが入ったボトルを冷蔵庫から取り出し、氷上に置きます。バイアル1にコラーゲン125 µLを分注し、続いて希釈したトレーサープローブ溶液50 µLを加えます。ボルテックスで短時間混合し、プローブを分散させます。次に、フェノールレッドを含む適切な細胞培養培地235 µLを加え、全量を410 µLにします。短時間ボルテックスした後、205 µL分取してバイアル2に移します。最後に、1 M 水酸化ナトリウムを約2 µL、バイアルに加えます。溶液を中性pHに戻した後、ボルテックスで短時間攪拌します。その後、混合液が硬化し始めないよう、すぐにアイスラックに戻します。腫瘍ステロイドを含むウェルから、培地を40 µL静かに分取します。次のステップを行う間、この40 µLを保持しておきます。前のステップでステロイドが除去されたかウェルを確認してください。除去されていない場合は、40 µLをウェルに戻し、前のステップを繰り返します。そうであった場合は、ステロイドを含む40 µLをバイアルに加えます。バイアル1を軽く撹拌した後、混合液を60 µLずつ96ウェルプレートの3つの異なるウェルに分注します。分注後、各ウェルを顕微鏡で観察し、どのウェルにステロイドが含まれているかを確認します。次に、1 M 水酸化ナトリウムを約2 µL、細胞培養培地を40 µLバイアル2に加え、ボルテックスミキサーで撹拌してから分注します。この混合液を96ウェルプレートの空のウェルに60 µLずつ分注し、細胞フリーコントロールとしてラベルを貼ります。プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、少なくとも1時間キュアリングを行い、サンプルポイントのグリッドを構築します。まず、サンプルプレートをインキュベーターから顕微鏡ステージへ移動させます。加熱ステージが使用できない場合は、サンプルを室温に平衡化させるために10分間待機します。低倍率の対物レンズでサンプルを観察し、損傷がなくイメージング可能な状態であることを確認します。ウェル内における腫瘍の位置を特定し、後で空間的な共登録（co-registration）を行うため、透過光画像でこれを記録します。通常、Sスフェロイドの周囲に同心円状に配置された各ウェル内の20箇所のサンプルポイントを測定すれば、十分詳細な結果が得られます。ステージを目的の各位置に移動させ、顕微鏡インターフェースソフトウェアを使用してXNY座標を記録します。顕微鏡を高倍率の対物レンズに切り替え、トレーサープローブの励起波長に適したフィルターキューブを選択してください。作成したポイントのリストを使用して、グリッド内の最初のポイントへ移動します。上方向に移動する前に、ピントを調整してウェルの底部を確認してください。その後、ピントが合った複数のトレーサープローブが含まれる視野を探します。強度ヒストグラムを確認し、画像が飽和しないように注意しながら、可能な限り広いダイナミックレンジが得られるよう、露光強度と露光時間を調整します。1フレームあたり20〜30ミリ秒のフレームレートでビデオシーケンスを取得し、適切な命名規則に従って保存します。録画中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。グリッド内の各サンプルポイントについて、記録を繰り返します。次に、この工程を繰り返して実験の各ウェルにグリッドを作成し、縦断的モニタリング期間中の各時点について全工程を繰り返します。データ解析を開始します。すべてのビデオデータを解析用フォルダにコピーしてください。画像データをMATLABまたは他の解析ソフトウェアにインポートします。ビデオの数フレームを解析してソフトウェアをキャリブレーションし、プローブ中心位置を特定するための選択および排除パラメータを適切に決定します。次に、ソフトウェアを使用してすべてのビデオフレームにおける各プローブ位置を自動的に決定し、これらの位置をトラジェクタリー（軌跡）として連結します。このトラジェクタリーデータを用いて、ラグ時間の関数として平均二乗変位（MSD）を算出します。その際、使用した特定の対物レンズやピクセルビニングに応じた適切な空間キャリブレーション係数を必ず適用してください。特定のサンプルの generalized Stokes Einstein relation の適用限界を考慮した上で、generalized Stokes Einstein relation を用いて G Star を算出します。実験における各視野に対して分析手順を繰り返します。使用した顕微鏡のメーカーに応じて、位置データを特定の関心周波数の viscoelastic mod I と共登録します。この工程は、顕微鏡のメタデータまたは位置データを読み取るカスタムルーチンによって効率化できますが、手動で表を作成することも可能です。3D腫瘍結節を含む代表的なウェル内の複数の空間的位置でビデオシーケンスを取得し、それらをリンクさせることで、パンの周辺部にある細胞集団を縦断的にモニタリングした際のサンプルの空間的なマイクロラジオロジーマップを提供します。この例で使用されているある種のスフェロイドは、数日以内に周囲のコラーゲン繊維を自発的に分解し、細胞外マトリックスへと浸潤します。この例では、マイクロロジーの共登録により、ステロイドの左側で起こっている明らかなマトリックスへの浸潤が定量的に読み取れますが、右側では認められません。これらの異なる空間領域を縦断的にモニタリングすると、浸潤に伴い、複素粘弾性せん断弾性率の実部が約4桁低下することがわかります。4日目における領域1と領域2のマテリアルのレオロジー特性を対比させた、完全な周波数依存性データが示されています。本手順を実施する際は、プローブの軌跡解析において不適切な結論を導き出す原因となる、よくある落とし穴を避けるよう注意することが重要です。サンプルドリフトや不均一性の解釈などの検討事項について述べられている、本稿で引用したPTMに関する文献を参照することを推奨します。本手順を、さらなる縦断的または終点的な蛍光イメージングと組み合わせることで、機械的なリモデリングが主要なシグナリングイベントや介入に対する細胞毒性反応とどのように相関しているかなど、他の疑問に対する答えを得ることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞外マトリックスの剛性が強く、接着細胞の複数の動作に影響を与えます。マトリックスの剛性は、組織全体に空間的に変化し、様々な疾患状態の修正を受ける。ここでは、原子間力顕微鏡のmicroindentationを使用して、通常と線維化マウスの肺組織における剛性の空間的な変動を特徴付けるための方法を開発する。...

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

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PTMベースの腫瘍微小環境モニタリング:腫瘍スフェロイドを使用してECM剛性の変化を追跡する方法

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細胞外マトリックスの硬さ依存性細菌播種を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡法

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落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

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粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

ここでは、架橋および終末糖化産物（AGEsの）によって誘導された基底膜（BM）の剛性の増加は、病理学的関連性を持っている生物物理学的微小環境をモデル化するためのプロトコルを説明します。...

前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

光コヒーレンストモグラフィ...

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

学ぶ粒子追跡マイクロレオロジーを用いた3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定法。この非破壊的手法により、腫瘍微小環境の力学的変化を定量的に解析し、がん進行の理解と治療戦略の向上に貢献する。

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

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