粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

本手順の全体的な目的は、3次元がんモデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の経時的変化を測定することです。まず、がん細胞を回収し、適切な方法で腫瘍スフェロイドを所望の大きさに達するまで育成します。次に、腫瘍スフェロイドをコラーゲンまたはその他の適切な細胞外マトリックスに包埋します。

次に、サンプルポイントの格子を構成し、各ポイントでビデオ撮影を行います。最終ステップでは、ビデオデータを解析し、各空間ポイントにおける実際の論理的特性を算出して共登録します。最終的に、本プロトコルではトレーサープローブの軌跡解析を用いることで、細胞外マトリックス力学の空間的変化を非破壊的な手法で経時的に定量化します。

この手法のコンセプトは、細胞外マトリックスの放射線学的イメージングに基づく測定と、細胞外マトリックスの相互作用を再現したin vitro 3D腫瘍モデルを組み合わせることにより、腫瘍の増殖、浸潤プロセス、および治療への反応に伴う機械的な微小環境の時間依存的な変化について、定量的な知見を提供することにあります。本ビデオで示す手法では、確立された膵がん細胞株であるpan oneから非付着性の3D OIDを生成するために、arosオーバーレイ法を採用しています。まず、細胞培養グレードの水10 millilitersに0.1 gramのarosを混ぜ、1%aros溶液を作成します。

Ali前に、aros溶液を70°C以上に加熱します。96ウェルプレートの各ウェルに溶液を40 µLずつ分注し、プレートを37°Cで1時間インキュベートします。トリプシンを用いてがん細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製した後、細胞懸濁液を1000 cells/mLに希釈します。この希釈液100 µLを、硬化したarosベッドを含むウェルに添加します。

培養後、サンプルを37°C、5%CO2に設定したインキュベーター内のシェーカーに置き、一晩振とうします。シェーカーからサンプルを取り出し、100 µLの細胞培養培地を加え、目的の直径に達するまで得られたステロイドを培養します。例えば、9日後には、1つのステロイドの直径は約450 micronsになります。

まず、ラミナーフローフード内にワークステーションを準備し、2 mLのバイアルを2本用意します。1本目のバイアルには腫瘍ステロイドを、2本目のバイアルには無細胞コントロールを入れます。ストックプローブ2部に対して滅菌水を25部の割合で加え、カルボキシ基修飾1 µm径蛍光トレーサープローブの希釈混合液を調製します。

3.1 mg/mLのウシコラーゲンが入ったボトルを冷蔵庫から取り出し、氷上に置きます。バイアル1にコラーゲン125 µLを分注し、続いて希釈したトレーサープローブ溶液50 µLを加えます。ボルテックスで短時間混合し、プローブを分散させます。次に、フェノールレッドを含む適切な細胞培養培地235 µLを加え、全量を410 µLにします。短時間ボルテックスした後、205 µL分取してバイアル2に移します。最後に、1 M 水酸化ナトリウムを約2 µL、バイアルに加えます。

溶液を中性pHに戻した後、ボルテックスで短時間攪拌します。その後、混合液が硬化し始めないよう、すぐにアイスラックに戻します。腫瘍ステロイドを含むウェルから、培地を40 µL静かに分取します。

次のステップを行う間、この40 µLを保持しておきます。前のステップでステロイドが除去されたかウェルを確認してください。除去されていない場合は、40 µLをウェルに戻し、前のステップを繰り返します。

そうであった場合は、ステロイドを含む40 µLをバイアルに加えます。バイアル1を軽く撹拌した後、混合液を60 µLずつ96ウェルプレートの3つの異なるウェルに分注します。分注後、各ウェルを顕微鏡で観察し、どのウェルにステロイドが含まれているかを確認します。次に、1 M 水酸化ナトリウムを約2 µL、細胞培養培地を40 µLバイアル2に加え、ボルテックスミキサーで撹拌してから分注します。

この混合液を96ウェルプレートの空のウェルに60 µLずつ分注し、細胞フリーコントロールとしてラベルを貼ります。プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、少なくとも1時間キュアリングを行い、サンプルポイントのグリッドを構築します。まず、サンプルプレートをインキュベーターから顕微鏡ステージへ移動させます。

加熱ステージが使用できない場合は、サンプルを室温に平衡化させるために10分間待機します。低倍率の対物レンズでサンプルを観察し、損傷がなくイメージング可能な状態であることを確認します。ウェル内における腫瘍の位置を特定し、後で空間的な共登録（co-registration）を行うため、透過光画像でこれを記録します。

通常、Sスフェロイドの周囲に同心円状に配置された各ウェル内の20箇所のサンプルポイントを測定すれば、十分詳細な結果が得られます。ステージを目的の各位置に移動させ、顕微鏡インターフェースソフトウェアを使用してXNY座標を記録します。顕微鏡を高倍率の対物レンズに切り替え、トレーサープローブの励起波長に適したフィルターキューブを選択してください。

作成したポイントのリストを使用して、グリッド内の最初のポイントへ移動します。上方向に移動する前に、ピントを調整してウェルの底部を確認してください。その後、ピントが合った複数のトレーサープローブが含まれる視野を探します。

強度ヒストグラムを確認し、画像が飽和しないように注意しながら、可能な限り広いダイナミックレンジが得られるよう、露光強度と露光時間を調整します。1フレームあたり20〜30ミリ秒のフレームレートでビデオシーケンスを取得し、適切な命名規則に従って保存します。録画中は、顕微鏡やテーブルに触れないでください。

グリッド内の各サンプルポイントについて、記録を繰り返します。次に、この工程を繰り返して実験の各ウェルにグリッドを作成し、縦断的モニタリング期間中の各時点について全工程を繰り返します。

データ解析を開始します。すべてのビデオデータを解析用フォルダにコピーしてください。画像データをMATLABまたは他の解析ソフトウェアにインポートします。

ビデオの数フレームを解析してソフトウェアをキャリブレーションし、プローブ中心位置を特定するための選択および排除パラメータを適切に決定します。次に、ソフトウェアを使用してすべてのビデオフレームにおける各プローブ位置を自動的に決定し、これらの位置をトラジェクタリー（軌跡）として連結します。このトラジェクタリーデータを用いて、ラグ時間の関数として平均二乗変位（MSD）を算出します。その際、使用した特定の対物レンズやピクセルビニングに応じた適切な空間キャリブレーション係数を必ず適用してください。

特定のサンプルの generalized Stokes Einstein relation の適用限界を考慮した上で、generalized Stokes Einstein relation を用いて G Star を算出します。実験における各視野に対して分析手順を繰り返します。使用した顕微鏡のメーカーに応じて、位置データを特定の関心周波数の viscoelastic mod I と共登録します。

この工程は、顕微鏡のメタデータまたは位置データを読み取るカスタムルーチンによって効率化できますが、手動で表を作成することも可能です。3D腫瘍結節を含む代表的なウェル内の複数の空間的位置でビデオシーケンスを取得し、それらをリンクさせることで、パンの周辺部にある細胞集団を縦断的にモニタリングした際のサンプルの空間的なマイクロラジオロジーマップを提供します。この例で使用されているある種のスフェロイドは、数日以内に周囲のコラーゲン繊維を自発的に分解し、細胞外マトリックスへと浸潤します。

この例では、マイクロロジーの共登録により、ステロイドの左側で起こっている明らかなマトリックスへの浸潤が定量的に読み取れますが、右側では認められません。これらの異なる空間領域を縦断的にモニタリングすると、浸潤に伴い、複素粘弾性せん断弾性率の実部が約4桁低下することがわかります。4日目における領域1と領域2のマテリアルのレオロジー特性を対比させた、完全な周波数依存性データが示されています。

本手順を実施する際は、プローブの軌跡解析において不適切な結論を導き出す原因となる、よくある落とし穴を避けるよう注意することが重要です。サンプルドリフトや不均一性の解釈などの検討事項について述べられている、本稿で引用したPTMに関する文献を参照することを推奨します。本手順を、さらなる縦断的または終点的な蛍光イメージングと組み合わせることで、機械的なリモデリングが主要なシグナリングイベントや介入に対する細胞毒性反応とどのように相関しているかなど、他の疑問に対する答えを得ることが可能です。