Name: における機能のパフォーマンスを評価する MDXマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ筋肉機能評価法を用いた神経筋疾患の前臨床研究。握力試験、ローターロッド、ハンギングテストなどの非侵襲的手法でマウスモデルの運動機能を測定し、治療薬の効果を評価します。

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我々は彼らの非常に建設的なコメントのためにマウスやレビューアの画像を得るの彼女の写真の援助、助けをMargriet Hulskerに感謝したいと思います。この作品はZonMw治療-NMD（契約番号LSHM-CT-2006から036825）、及びデュシェンヌ型の親プロジェクトによってサポートされていました。

ここで説明する実験は、ライデン大学医療センター（LUMC）の動物倫理委員会（12月）により承認された。マウスは、LUMCの動物施設で飼育し、12時間の明暗サイクルで個別換気ケージの中で飼育した。彼らは、水と標準飼料への不断のアクセスを持っていた。 以下に記載の機能試験のいずれかを行う際に、実験条件は厳密にばらつきを低減するように制御されなければならない。パフォーマンスは、年齢や性別で異なるように好ましくは、年齢や性別適合マウスを使用すべきである。同じゴミに属するマウスは実験群の上にランダム化されるべきである。動物は、実験グループを知らされていないのと同じオペレータによってテストする必要があります。試験は、個々のマウスおよび時点間の大きな変動が14すべてについて観察することができるなど 、その日およ ​​び曜日の同じ時間に行われ、臭気を等化する同じ部屋、ノイズされるべきである機能テストは、したがって、6〜8匹のマウス/実験群を使用する必要があります。機能テスト性能も大きく異なる近交系、野生型株との間で異なることができる。そのため、実験およびコントロール野生型マウスでは、常にバックグラウンドに対応している必要があります（MDXマウスの場合C57BL/10ScSnJ野生型株を使用してください）。ここに記載されているすべてのデータは、我々がここにから野生型を参照C57BL/10ScSnJ野生型株、得られている。ここで説明する試験は、 のmdxマウスおよび野生型マウスにおける加齢の少なくとも1〜19ヶ月から長手方向に使用することができる。テストは、関心とタスクを実行する意欲を失ってからマウスを防ぐために、週に複数回繰り返されるべきではありません。 1。前肢握力テスト前肢の強度を測定するために前肢握力テストを使用。テストは尾15で吊り下げたときに本能的にグリッドを把握するマウスの傾向に基づいており、adapteさからD <a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/dmd_m.2.2_001.pdf" target="_blank">DMD_M2.2.001.pdf</a> 。 <ol><li>この装置は、最大セット：プル時にグリッド上でマウスで適用される最大の力を測定する力変換器、グリッドを取り付けます。設定は引きのピークテンションモード（T-PK）であることを確認します。力の単位は、いずれかの情報オブ力、グラム重の力、重量ポンドの力、キログラムオブ力、又はニュートン単位で調整することができる。 注：私たちは、値の単位としてグラムと働くことを好む。複数のメーターは市販されているが、レバー式力変換器は負レバー効果の物理法則によって影響されるだけ軸方向変換器は、信頼性の高い結果を得た。非柔軟性グリッド又は三角形のいずれかは、直径1〜2mmであるバーを使用することができる。 </li><li>試験の前に、体重のための正規化を可能にするために、マウスの体重を評価する。 </li><li>値の単位としてグラムを使用してください。各RECOの開始時にメーターをリセットrding。 </li><li>しっぽをつかんで、グリッドに向けて水平に移動することで、そのケージからマウスを外します。 </li><li>マウスが両方の前足でしっかりとグリッドを把握していることを確認してください。 </li><li>その把握が壊れているように、離れてグリッドからマウスを引っ張って、グリッドに印加される最大力は、手動または自動で記録することができ、変換器のディスプレイ上に表示されます。 </li><li>マウスは、実験者への耐性を示しているにおいて考慮引っ張るだけを取る。唯一の1前足、または後肢を使用しているマウスは、プル時になってされた措置を拒否します。 </li><li>マウスがグリッドを連続で3回引いて1分以上の休止期間、ケージ内に戻ってみましょう（注）。一連の間休止期間を引き、マウスが回復し、習慣の形成を回避することが必要である。 </li><li>その後、マウスを引っ張るの4つのシリーズ、短い休息期間が続くそれぞれを実行してみましょう。このように覚書Eは15倍（3引っ張る×5回= 15引っ張る）の合計を引いています。 </li><li>最大握力を決定し、収集した15の値から3の最高値の平均をとることによって、体重を標準化。 </li><li>オプション：最初の2の平均と引っ張る1 +2 +3 = A、4 +5 +6 = B、10 +11 +12 = Cおよび13 +14 +の最後の2シリーズ間の減少分を算出することで疲労を決定します15 = D.式：（C + D）/（A + B）が疲労していないマウスのための1の値を与える。疲労のないマウスが0％の値および前肢が完全に100％の値を有し、疲労しているマウスを有するように、これは、パーセンテージで表すことができる。 </li></ol> 2。ハンギングテストぶら下がり試験、バランス調整及び筋条件と評価することができる。これらのテストは、マウスが枯渇16までのワイヤまたはグリッドに掛かったままに熱望しているという知識に基づいています。試験開始時に2つの特徴的な吊りテストがどちらかあります2前肢または四肢のみが、それぞれのワイヤグリッドを使用して、使用されている。ワイヤーグリッドを使って吊り下げ試験はから適応最長中断時間法である<a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.004.pdf" target="_blank">DMD_M.2.1.004.pdf</a>と<a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf" target="_blank">DMD_M.2.1.005.pdf</a>それぞれ。固定ぶら下げ制限は600秒で使用されている。ジストロフィーマウスはできませんが、野生型マウスの大多数は、600秒間ハングアップすることができます。この試験を行う時の費用を削減するために、最大吊り時間が所定の位置にセットした。その前に、ワイヤグリッドから落ちるマウスは2回までは試行まで与えられている。これは、マウスがハングアップすることが本当にできず、原因不器用に該当しないことを再保険するために行われます。 <ol><li> 2手足でテストをぶら下げ<ol><li>装置のセットアップ、密テープで棚に2mm厚の金属布ハンガーを確保し、約37ハンガーを維持0;寝具の層の上のCM。注：または、しっかりと2垂直スタンドの間に固定されている広い2ミリメートルの厚さの金属線55センチメートルを使用することができる。 37センチメートルの距離が吊り下げたままにしたマウスを奨励するのに十分なだけでなく、落下時の怪我からマウスを防ぐのに十分に低い。ワイヤーが振動したり、これはマウスの性能を妨害する可能性があるので、テスト中に移動させるべきではありません。 </li><li>尾を経由して、マウスを処理し、電線の近くに持ってきて。 </li><li>マウスのみ2前足でワイヤーをつかみましょう、とマウスだけワイヤ上の2前肢（ 図2B）でハングアップするように、後肢を下げる。 </li><li>マウスが離されたときに直接タイマーを開始する。リリース後に、強力なマウス（ 図2C）許可されているすべての四肢と尾、とワイヤーをキャッチしてみてください。 </li><li>マウスバランシングまたは故意SH、ワイヤから飛び降りるような（不適切な挙動を示している場合には） 図2D及び2Eに所有し、直接タイマーを停止することなく、ワイヤ上でマウスを交換することによってこの問題に対処。 </li><li>マウスが電線から落ちたときに、タイマーを停止し、吊り時間を記録。 </li><li>マウスは600秒間ハングすることがある場合は、線材を、それらを脱いで、ケージに戻す。この制限の前に落ちるのマウスは2回までは試行の最大を与えられている。 </li><li> （試験の最長IE）の最大吊り時間を記録し、さらなる分析のためにこれを使います。 </li></ol></li><li>四肢でテストをぶら下げ<ol><li>装置は、最大セット：いずれかを使用正方形またはこのテストのために、ラットやウサギの大きなケージの蓋造り手。落下時に自分自身を傷つけるからマウスを防ぐために、25センチメートル柔らかい寝具の上にグリッドを配置するだけでなく、意図的にグリッドをオフにジャンプするマウスを阻止する。実験者は、これらの動きは、私かもしれませんが、手動で実験中にグリッドを保​​持する必要がないように、しっかりとグリッドを確保マウスのパフォーマンスにnterfere。 </li><li>それは、その4本の足でそれを把握するようにグリッド上にマウスを置きます。 </li><li>マウスがハングしているように、グリッドを反転し、直接、タイマーを開始します。 </li><li>テストセッションは、600秒の間、ハングアップすることが可能であるマウスのために終了します。グリッドから2回までは試行の初期の最大立ち下がりマウスを与える。 </li><li>さらなる分析のために、最大吊り時間（ すなわち 。試験の最長）を使用しています。 </li></ol></li></ol> 3。ロータロッドランニングロータロッド試験筋力と、協調、バランス、条件は17を決定することができる。 <ol><li>この装置は、最大セット：このテストでは、マウスが回転チューブ上で実行する必要があります。安定した速度は毎分5回転（rpm）に設定されていることを確認し、最初の15秒での5-45 RPMから回転数が上昇を開始したときに。この後、それはその速度を維持しなければならない。 </li><li>ロータロッドのチューブにマウスを置くそれは5回転の遅い一定の速度で回転する。 5匹のマウスを同時に試験することができる。 </li><li>一度にすべてのマウスが配置されているファイル名を指定して実行を開始します。最初の15秒以内の管の速度は、それがその速度を維持した後、5〜45回転から加速します。 </li><li>実行を監視します。稼働時間は、継続的にソフトウェアで記録されている。これは、チューブの下方に位置するタイムバーをアクティブにし、マウスがチューブから落下するときの時間を実行すると、自動的に停止します。回転させるためにチューブを停止することなく、実行中のチューブには逆方向を向いている向きを変え、マウスの位置を変更。 </li><li> 500秒の間、実行することができますマウスのためのテストセッションを終了します。マウスに彼らが先に落ちたときに彼らは、彼らの実行時間を改善することができ、さらに2つの試行の最大値を与える。 </li><li>さらなる分析のために（試験の最長IE）の最大実行時 ​​間を使用してください。 </li></ol> 4。トレッドミル運動ザ·トレッドミルは、前臨床研究におけるツールとしての三つの方法で使用することができる。まず、強制トレッドミルランニング（参照：このプロトコルで説明したように、疾患の病態を悪化させるために使用することができます<a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.001.pdf" target="_blank">DMD_M2.1.001.pdfを</a> ）。第二に、マウスの最大運転能力とこれに関する治療の効果は、（マウスが枯渇するまでに実行できるようにする方法を参照してください評価することができる<a href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.003.pdf">DMD_M.2.1.003.pdf</a> ）。最後に、実行中のトレッドミルは、それが第二のテスト13であまりうまく機能するようにマウスを排出する前に、別の機能をテストするために使用することができます。これは、直接プロトコル1〜3に記載の機能テストのいずれか1に続いて、以下に述べるように、2回または週3回マウスを行使することによって行われます。 <ol><li>この装置は、最大セット：RU数匹のマウスができる上、商業的に利用可能ないくつかのトレッドミルがあります。nは同時に、仰角、持続時間および速度を調整することができるれる。いくつかのトレッドミルを実行するために、マウスを奨励するために低強度のショックを送出するために、グリッドを完備しています。しかし、mdxマウスは、ストレスに敏感であり、簡単に走行方向の手で優しく押しで友好的に動機付けすることができます。したがって、強くショックグリッドを使用しないよう推奨されています。一般的に、手による刺激は最初、実行中のセッションの間に必要とされている。 </li><li>水平トレッドミル上でマウスを置きます。 </li><li> 12メートル/分の走行速度でトレッドミルを開始する。より高い速度を容易に疲労をもたらし、低速（8メートル/分）のマウス（&gt; 15ヶ月）で使用しなければならない。 </li><li>最初のセッションの間に、彼らはベルトの端の近くにあるときに優しく、それらを押すことで実行するために、マウスをお勧めします。 </li><li>マウスは30分の期間中に実行したら、戻って自分のケージに入れます。 </li><li> 例えば 12週間の週二回、これを繰り返します。 </李&gt; <li>必要なときに期間を休んで許可する。例えば、一部のMDXマウスは、実行を停止する必要があり、数分間休ませなければならない。このような場合は、ベルトをオフにし、すべてのマウスを2分の休止期間を与え、4メートル/分で2分間にベルトを回す。この後、12メートル/分の速度を増加させ、マウスがプロトコルを完了することを可能にする。これは、すべてのマウスは、全体の実行プロトコルを完了することが重要です。 注：MDX マウスは休息期間を必要とする場合、30分の運動プロトコルの前にウォームアップを考えてみましょう。ただちに/分8メートルで8分のウォームアップに続いて4メートル/分の速度で2分間の順応期間、このウォームアップセッションで構成されています。 私たちの手で4月16日週齢の雌のmdxマウスは休憩なしで30分の運動プロトコルを完了することができます。他の時代に、マウスの45％が運動を完了するために休憩期間が必要なのですかオスのmdxマウスと一致したことを報告している。ウォームアッププロトコルが軽減停止12の量は、S。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ここで紹介する機能テストは、再現性の実施が容易と野生型と自分の年齢とは無関係にジストロフィーマウスにも適用可能である。テストは、事前に臨床的に筋機能、強さ、状態、および調整を評価するための便利なツールを提供しています。疾患の自然史に関する化合物の効果を試験する場合、ここで説明する非侵襲的検査（前肢握力、ぶら下げテストとロータロッド試験の両方）がうまくこれらのテストは、連続した日に実行され、機能テスト体制で組み合わせることができる。これらのプロトコルは、mdxマウスに有害ではなく、長手方法10で使用することができる。それは、これらのテストのそれぞれの成果ではなく、個々の筋肉の異なるまたは部分的にオーバーラップする筋肉群によって生成されることに留意すべきである。そのため、複数のテストを組み合わせて使用​​すると、より完全な画像を得ることをお勧めし、それによって実験の機能性に優れた洞察さ精神的なグループ。あるいは、靴底筋の機能的改善は、筋肉の生理学的測定値20を使用して評価することができる。 行動試験と同様に、また、機能テスト...

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は1:5,000新生児の男の子に影響を与える最も一般的な神経筋疾患である。この重度および進行性の筋消耗疾患は、オープンリーディングフレームを破壊し、機能性ジストロフィンタンパク質の合成を防止するDMD遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンを欠損する筋線維は、誘発された損傷を行使する脆弱性が存在します。筋肉の再生能が消耗すると、損傷を受けた筋肉の慢性炎症に起因する、繊維は、その後、機能の損失につながる、結合組織および脂肪で置換されている。一般的には、DMD患者は、二十年の初期の下肢の歩行を失う。その後、また腕や肩帯の筋肉が影響を受けている患者は、しばしば脊髄を支える筋肉の非対称弱体化に胸腰椎脊柱側弯症を開発しています。補助換気は一般的に十代後半や20代前半が必要である。呼吸や心臓の障害リード第三又は第四十年1死まで。 原因遺伝子は、25年以上前に2が発見されたが、DMDのために利用可能な治療法はありません。ただし、健康管理を改善し、コルチコステロイドの使用は、西洋の世界3で平均寿命を増加している。 mdxマウスのような動物モデルを用いて、前方の潜在的な治療戦略の発見への主要な工程が行われている。 mdxマウスは、最も一般的に使用されるDMDのマウスモデルである。それは、マウスDMD遺伝子のエクソン23に点変異を有し、その結果、ジストロフィン4を欠いている。ここ数年、多くの提案された戦略は、臨床試験5-9に進んでいる。これらの試験では、筋機能の改善は、検査の前臨床段階でのマウスで筋機能に対する化合物の利点をテストすることの重要性を根底に、主要評価項目である。 DMDのような患者はまた、mdxマウスのジストロフィン陰性筋線維が誘発される損傷を行使する脆弱であり、それらの筋肉機能をC57BL/10ScSnJ野生型マウスと比較して損なわれている。この障害は、機能テストの様々な評価することができる。これらのテストのいくつかは、非侵襲的であり、筋肉の病理（ 例えば 、前肢握力、テスト、ロータロッドランニングをぶら下げ）に干渉しない。したがって、それらは、疾患の自然経過を監視したり、疾患の進行に対する化合物の効果を決定するために使用することができる。 mdxマウスにおける筋機能に対する化合物の影響の深さの画像を得るために、これらのテストの全てからなる疾患の進行を妨げない機能的なテスト体制は、10を使用することができます。 あるいは、強制トレッドミル走行を意図的に疾患の進行を悪化させ、化合物11の保護能力を試験するために使用することができる。トレッドミルにもすることができます彼らは治療群13の性能の大きな違いを確実に後続の機能試験であまりうまく機能するように枯渇するまでの時間を実行しても12を測定したり、疲労MDXマウスためのツールとしてされているアウトカム指標として使用されます。機能テストを選択するときには、病気の進行への影響は、mdxマウス 14のようなジストロフィーマウスをテストする場合は特に注意が必要です。 ここでは、TREAT-NMDネットワークから利用可能な標準的な操作手順に基づいて、信頼性と再現性のある方法で最も一般的に使用される機能テストを実行する方法を詳細に説明します。 <a href="http://www.treat-nmd.eu/resources/research-resources/dmd-sops/" target="_blank">TREAT-NMDここをクリックし</a> 。

<table><tbody><tr><td>マウスグリップ力計</td><td>Chatillon DFE(コロンバスインスツルメンツ再販)</td><td>#80529</td><td></td></tr><tr><td>ハンギングワイヤー 2肢デバイス</td><td>布ハンガーまたはカスタムメイドデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンギングワイヤー4肢デバイス</td><td>ラットケージの蓋またはカスタムメイドデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ローターロッド</td><td>ウーゴバジル</td><td>#47600</td><td></td></tr><tr><td>マウス用トレッドミル エクサー 3/6</td><td>コロンバスインスツルメンツ</td><td>#1055SRMの</td><td></td></tr></tbody></table>

における機能のパフォーマンスを評価する<em&gt; mdx</em&gt;マウスモデル

Assessing Functional Performance in the Mdx Mouse Model

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、治療法は利用できないため、重度かつ進行性の筋消耗障害である。それにもかかわらず、いくつかの潜在的な医薬化合物および遺伝子治療アプローチは、臨床試験に進んでいる。筋肉機能の改善は、これらの試験で最も重要なエンドポイントであると、強調の多くは、信頼性の設定に置かれた、再現性、および機能テストを行うことが容易で事前に臨床的に筋機能を評価するため、強さ、状態、および調整でDMD のMDXマウスモデル。両方の浸潤性および非侵襲性のテストが用意されています。病気を悪化しないテストは、疾患の自然経過および治療 ​​的介入（ 例えば 。前肢握力試験、ワイヤまたはグリッドとロータロッド走行のいずれかを使用して2つの異なる吊り試験）の効果を決定するために使用することができる。あるいは、強制トレッドミル走行は、疾患の進行を増強および/または評価するために用いることができる疾患病理に対する治療的介入の保護効果。ここでは、信頼性と再現性のある方法でこれらの最も一般的に使用される機能テストを実行する方法について説明します。標準作業手順に基づいて、これらのプロトコルを使用すると、異なる研究所間でのデータの比較が可能になります。

野生型およびmdxマウスの前肢握力は4月12日週齢の間で増加し、高齢のマウスで再び減少します。力の障害は、すでに若いmdxマウスにおいて観察することができる。 9週齢の雌のマウスの代表的なデータを図1A及び1Bに示されている。疲労がこの年齢でまだ株の間で異なっていませんが、mdxマウスは野生型マウスよりも弱い。私たちは、古いMDXと野生型マウスで疲労性にまだデータがありません。 信頼性と再現性のある結果を得るために、多数の評価は、同じ実験者によって行われる必要がある。ここで我々はまた、信頼性の高いデータを提供引っ張るの15回/個別しかし少数（5引っ張るという低）を引っ張って説明します。細心の注意は、これは主に成果に影響を与えることができ、グリッド上の足の位置に描画する必要がある。プル中、唯一の両方の前足を使用する必要があり、彼らはbにする必要がありますeは、次の（ 図1C）は、互いにうまく配置された。マウスは、...

神経筋疾患のための臨床試験における主要評価項目は、通常、筋肉の機能を向上させることができる。従って、マウスモデルにおいて、臨床的にあらかじめ筋性能に対する潜在的な治療化合物の効果を評価することは非常に重要である。ここでは、この問題に対処するためのいくつかの機能テストを記述します。

における機能のパフォーマンスを評価する<em&gt; MDX</em&gt;マウスモデル

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe and progressive muscle wasting disorder for which no cure is available. Nevertheless, several potential ...

これらの手順の全体的な目的は、いくつかの非破壊的な機能テストを用いて筋肉の機能性を判定することです。四肢の筋力は握力テストで評価でき、バランス調整能および筋肉の状態は、二肢および四肢吊り下げテストで評価できます。また、ローターロッドを用いてバランス、協調性、および状態の評価を行います。強制トレッドミル走行は、疾患の進行を悪化させるため、あるいは機能テストの前にマウスを疲弊させるために利用できます。これらの機能テストを用いることで、遺伝学的役割や潜在的な治療化合物の筋肉性能への影響を確実に評価することが可能です。最初に、四肢握力テストについて説明します。フォーストランスデューサの設定を、牽引用のピークテンションモードにし、単位をグラムに設定してください。各記録の開始時にメーターをリセットします。各マウスに3回連続で牽引させます。マウスの尾を掴み、グリッドに向かって水平に移動させます。マウスが4本の足すべてで格子をしっかりと掴んでいることを確認し、そのまま引いて掴んでいた手を離させます。格子に加えられた最大荷重がトランスデューサーのディスプレイに表示され、これを手動または自動で記録します。マウスが片側の前足のみを使用した場合、後肢を使用した場合、ポール（格子）の間に回転した場合、あるいは明らかにポールへの抵抗を示さなかった試行はすべて除外してください。マウスが3回牽引した後、ケージに戻して少なくとも1分間の休息時間を設けます。その後、マウスに4回の一連の牽引を行わせ、それぞれの後に短い休息時間を設けます。このようにして、マウスに合計15回の牽引を行わせます。2肢懸垂試験に使用する装置は、厚さ2 mmの金属製ハンガーをテープで棚にしっかりと固定したものです。マウスを尾から保持し、ハンガーを床材から37 cm上の高さに維持します。その後、マウスをワイヤーに近づけます。マウスが前肢2本のみでワイヤーを掴ませ、後肢を下ろして、前肢2本だけでワイヤーにぶら下がった状態にします。マウスを放した瞬間にタイマーを開始します。放した後、筋力の強いマウスは4肢すべてと尾でワイヤーを掴もうとすることがありますが、これは許容されます。マウスがワイヤーの上でバランスを取ろうとする、あるいは意図的に飛び降りるなどの不適切な行動を示した場合は、タイマーを停止させずに直ちにマウスをワイヤーに戻してください。マウスが600秒間ぶら下がることができた場合は、ワイヤーから取り外してケージに戻します。マウスがワイヤーから落下した場合は、タイマーを停止し、ぶら下がっていた時間をそのまま記録してください。これらのマウスを最大でさらに2回再テストします。四肢懸垂試験では、マウスが落下した際に怪我をすることを防ぎつつ、意図的にグリッドから飛び降りるのを抑制するため、ラットケージの蓋を柔らかい敷材から25 centimeters上の位置に設置します。次に、マウスが4つの足でグリッドを掴むようにしてグリッド上に置きます。次に、マウスがぶら下がった状態になるようグリッドを反転させ、直ちにタイマーを開始します。マウスが600秒間ぶら下がることができた場合は、そのままケージに戻します。600秒経過前にグリッドから落下したマウスについては、ローターロッド試験を最大2回まで再試験します。テストとして、初期速度を5 RPMに設定します。次に、チューブがゆっくりと回転している間に、最大5匹のマウスをチューブ上に配置します。すべてのマウスが配置されたら、15秒かけてチューブの速度を5 RPMから45 RPMまで上げます。その後、走行終了まで45 RPMのままにします。試験中は継続的に走行状態を監視してください。走行時間はソフトウェアによって継続的に記録され、マウスがチューブから転落すると自動的に停止します。これにより、チューブの下に配置されたタイムバーが作動します。回転チューブを停止させることなく、走行中に向きを変えたマウスを正しい方向に戻してください。500秒間走行できたマウスはテストセッションを終了し、ケージに戻します。早めに脱落したマウスには、走行時間を改善させるため、最大2回まで再試行させてください。トレッドミル運動試験では、マウスを水平トレッドミル上に配置します。トレッドミルの走行速度を12 meters per minuteに設定して開始します。最初のセッションでは、マウスがベルトの端に近づいた際に軽く押して、走行を促します。30分間の走行後、直ちに2肢懸垂試験を行うか、またはマウスをケージに戻します。ここに示す通り、9週齢の雌性MDXマウスの四肢握力は、野生型マウスと比較して低下していました。しかしながら、週に1回実施した二肢懸垂テストにおける平均疲労度は10%未満であり、系統間での差は見られませんでした。雄のMDXマウスおよび野生型マウスはいずれも、テスト開始後の数週間に学習曲線を示しました。しかしながら、MDXマウスの成績は、すべてのタイムポイントにおいて野生型マウスよりも劣っていました。許容される最大懸垂時間である600秒を点線で示しています。4. 雄のMDXマウスおよび野生型マウスにおいて、四肢懸垂能を週1回評価しました。時間の経過とともに、MDXマウスは野生型マウスよりも短い時間しかぶら下がらなくなりました。トレッドミルで30分間走行した直後では、若齢雄のMDXマウスと野生型マウスの間でローターロッドの走行時間に差は見られませんでした。雌マウスを2肢懸垂試験にかけたところ、すべての野生型マウスは最大許容時間までぶら下がったままでした。すべてのMDXマウスは、より早い段階でワイヤーから落下しました。膜損傷の有無は、膜の裂け目を通じて筋線維から漏出する血清クレアチンキナーゼ値の評価によって判定しました。運動前からMDXマウスでは野生型マウスに比べてクレアチンキナーゼ値が上昇しており、トレッドミル運動によってMDXマウスの数値はさらに上昇しましたが、野生型マウスでは低いままでした。MDXマウスの筋肉は、トレッドミル運動に対して非常に脆弱です。数週間の走行後、疾患の病理学的状態が著しく悪化します。16週齢の非運動群およびトレッドミル運動群の大腿四頭筋のH&amp;E染色像では、MDXマウスにおいて広範な線維化と壊死が認められますが、同様の走行プロトコルを行った野生型マウスの筋肉には影響は見られませんでした。遺伝的背景の違いが機能的なパフォーマンスに影響を与えるため、2系統のMDXマウス間で2肢懸垂テストの成績に有意な差が認められました。4肢懸垂テストの結果は、混合背景のMDXマウスでわずかに高い値を示しました。ローターロッドの走行時間も、系統間でわずかに異なりました。この手順を実施する際は、常に遺伝的背景が一致し、年齢および性別を合わせた、十分な数のマウス群を使用することが重要です。また、実験条件は可能な限り標準化して維持してください。例えば、同じ時間帯と曜日、同じ部屋、そして同じ実験者を用いてください。

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Behavior

行動

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