Name: 視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶカスパーゼ3/7多重化アッセイによる視床下部神経細胞のアポトーシス評価法。パルミチン酸誘導ストレス下で蛍光・化学発光を用い、細胞生存率とカスパーゼ活性を同時測定する高速スクリーニング技術です。

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ここで説明する作業は、退役軍人の米国農務生物医学研究所研究開発BX001686-1A1およびVAリハビリテーション研究開発によって資金を供給された。

細胞培養物の1。メッキとメンテナンス<ol><li>暖かいダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン）を37℃まで</li><li> -80℃から凍結されたA12細胞の株式を取得</li><li>急速に37℃の水浴中で細胞を解凍する;一度解凍した、優しくピペット細胞が75cm 2の通気培養フラスコに移し、培養液の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃で5％CO2インキュベーター内でフラスコ一晩インキュベート培地を吸引し、24時間後に、新鮮な培地と交換します。 70〜80％のコンフルエンスが得られるまで細胞を増殖させるコンティニュ（2-3日間増殖）。 </li></ol> 2。計数及びめっきセル<ol><li>暖かいDMEMおよび37℃に1X-トリプシン-EDTA溶液</li><li>細胞から培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄する。 </li><li>トリプシン溶液500μlを加え、2〜5分間37℃でインキュベートする。 </li><li>切り離すスクレーパーを使用し、5mlの培地中で細胞を懸濁フラスコからの細胞。ストレーナーを通して細胞をパスし、きれいな50ミリリットルチューブにセルストレーナーを通過する。複数回ストレーナーを通して細胞を渡す必要があるかもしれませんが、以上の3回を繰り返さないでください。 </li><li>メディアの最終容量100μl、96ウェル透明底黒または白の壁のプレートに6000細胞/ウェルに播種するために培養するための細胞の量を測定する血球計数器を用いて細胞を数える。 24時間、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。 </li></ol> 3。細胞生存率およびカスパーゼ3/7活性測定<ol><li>無菌の5mlガラスバイアルに移し、PA、100％ジメチルスルホキシド（DMSO）に可溶化する。 DMSOにストックPAソリューション1:10に希釈し、0.1 mMのPAの最終作業濃度を得るために、DMEMを予め温めに追加します。制御メディアの場合、PAを含む培地に添加されている同じ濃度のDMSOを加える。 </li><li>各ウェルに培地を除去し、50μlのメディア+ /で置き換える -ペンシルバニア州。 37℃、5％CO 2中で2時間、プレートをインキュベート次いで、5μlのレサズリン試薬を追加し、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>細胞生存率を測定するためのマルチモードマイクロプレートリーダー、蛍光レコード（560 EX / 590 EM）を用いて。結果は相対蛍光単位（RFU）として提示される。 </li><li>同じプレートに、カスパーゼ試薬55μLを加え、2時間室温でインキュベートする。 </li><li>再度カスパーゼ3/7活性を測定するためにマイクロプレートリーダー、レコード発光を用いて。結果は、カスパーゼ3/7活性に直接比例して発光、相対発光単位（RLU）として提示される。 </li><li>細胞数にカスパーゼ3/7活性が正常化するには、カスパーゼ3/7活性（RLU）での細胞生存率（RFU）を分割します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示する競合がない。

多重アッセイ、例えばPCRマイクロアレイ、免疫検出、および他のタンパク質に基づく検出法13、14のような多数の用途に科学者によって使用されている広く受け入れられた技術である。最近では、多重アッセイは、ますますin vitroのプレートベースの実験に利用され、細胞毒性を評価する正確な方法として、検証され、12の実行可能性されたとなっている。上記のプロトコルでは、PA攻撃後のA12細胞におけるカスパーゼ3/7活性及び細胞生存率を決定するために、多重蛍光および発光アッセイの有効性を実証する。細胞生存率は、生存細胞の迅速かつ信頼性の表現を可能にする、初期PA傷害の10分以内に測定した。それはrezasurin系試薬が測定されるエンドポイントをさらに可能にする生細胞アッセイであることに留意すべきである。しかし、カスパーゼ3/7活性を決定するために、インキュベーション時間を最適化することであるessentia使用可能な結果15を得るためのL。 アポトーシスは、外部刺激、細胞内部のシグナル、および別個の形態学的お...

パルミチン酸（PA）などの飽和脂肪酸が豊富な食事は、心血管疾患および糖尿病1、2を含む、肥満および他の併存疾患に関連している。高脂肪食はまた、酸化ストレス、アポトーシス、および視床下部の神経変性、食欲及びエネルギー消費3-7の重要な調節因子を増加させることが示されている。高脂肪食の露出が視床下部調節不全を誘導するメカニズムを理解することは、肥満のための薬理学的治療の開発のためのが重要である。しかし、食事の脂肪が神経機能に影響を与えるそれを通して細胞メカニズムは不明である。このようなPAとして脂肪が視床下部アポトーシス経路の発症を誘発するかもしれない方法をよりよく理解するには、この目的に向けて必要な最初のステップです。この記事の目的は、Hの研究に使用するために開発されたPA暴露に対する神経細胞応答のin vitro試験のためのマルチプレックスアッセイを、説明することであるypothalamic神経変性。我々は、PA 8との酸化的攻撃後（A12と称する）に分化する不死化成体マウスの視床下部細胞株における細胞の総数あたりの3月7日の活動カスパーゼを測定するためのin vitroでの 96ウェルフォーマットの多重検定の詳細な説明を提供する。 簡潔には、細胞生存率をレサズリン基づくアッセイを介してPAチャレンジを下記判定される。レサズリンは、代謝的に活性な細胞中の酵素の減少、ミトコンドリア9を介して起こると考えプロセスを受ける細胞透過性化合物である。生存細胞は、連続的に生細胞数に比例する蛍光シグナルを生成するレゾルフィンレサズリン変換する。カスパーゼ3/7活性を、次いで、DEVD-lumogenicベースのアッセイを用いて分析する。 DEVDはカスパーゼ3により切断されるアミノ酸配列（のAspのGlu-Aspで、ヴァル）である。この配列は、細胞内カスパーゼ3/7の活性化およびその後の切断の際に、lumogenic物質に結合されるとDEVD基板から、発光生成物が放出される。この反応は、カスパーゼ活性を、したがってアポトーシスの誘導に比例する。死んだ細胞は、カスパーゼを生産することができないように、カスパーゼ3/7活性を、自然の過渡的である。したがって、解析は細胞ストレッサーの効果によって、4時間後にチャレンジに30分の間に完了する必要があります。細胞生存率は、カスパーゼ3/7活性に反比例し、細胞死のメカニズムを決定するために用いることができる。例えば、この方法は、以前にオレキシンが、この処置によって影響メカニズムは酸化的損傷10に対する保護において重要であることを示唆し、過酸化水素でチャレンジ視床下部の細胞においてアポトーシスを減少させるペプチドホルモンとその前処理を示すために使用されている。それは、それらがアッセイ試薬を減少させるためにミトコンドリア活性に依存して、これらのアッセイは、細胞株および組織に依存する注意することが重要である。このプロトコルは、成体マウスの視床下部（A12）細胞用に最適化されています。しかし、記載された方法は、類似の研究の範囲内に収まるように変更することができる。 単一培養ウェルからの多重化アッセイは、いくつかの理由で個別のアッセイを行う従来の方法に勝る利点を提供する。時間、細胞試料、および培養試薬を保存することに加えて、多重化アッセイは、細胞生存と死の知識を提供内部対照を提供し、反復的な実験11,12の必要性を排除することができる。 代替法は、96ウェルフォーマットを使用している場合は特に、信頼性の高いアッセイであるウェスタンブロットまたはELISAを、依拠するが、費用と時間がかかる（1〜2日）であるている。それは、多重化アッセイのために細胞を培養するのに要する時間を除くと、合計時間は3時間未満である。このプロトコルはA12細胞との使用に最適化されたが、細胞の完全性に影響を及ぼし得る要因を念頭に保ちながら、それは他のモデルで使用するために変更されてもよい。抑止するこのプロトコルは、一連の実験のために働くかどうマイニングは、サンプルや実験条件の数にして計画されたダウンストリーム実験に依存します。

<table><tbody><tr><td>成体マウス視床下部細胞株 mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>セルティオンズ・バイオシステムズ(株)</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>パルミチン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>ジメチ スルホキシド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

複雑な細胞メカニズムの研究においてアッセイを多重化する能力は、反復的な実験の必要性を排除する内部コントロールを提供し、コストおよび試薬の無駄を減少させる。ここでは、96ウェル中の生存細胞数およびカスパーゼ3/7活性を測定するために、蛍光及び発光ベースのアッセイの両方を使用して、 インビトロ視床モデルにおけるパルミチン酸（PA）チャレンジ後のアポトーシスを評価するために、多重アッセイの最適化を記載マイクロタイタープレートフォーマット。 PAチャレンジ後、生存細胞を、レサズリン系蛍光アッセイにより決定した。カスパーゼ3/7活性次に発光基質、DEVD、そして細胞数に対して正規化を使用して決定した。この多重アッセイは、例えば、飽和脂肪酸チャレンジとしてアポトーシス刺激、次のカスパーゼ活性の変化を決定するために有用な技術である。飽和脂肪酸は、潜在的なPA importaですを示し、視床下部酸化ストレスおよびアポトーシスを増加させることができる例えば、そのようなアッセイのNCEは、飽和脂肪酸および神経機能の関係を研究する中で、ここで説明。

上記のプロトコルは、細胞死のメカニズムを決定するために、多重つの別々のアッセイ結果を記載する。 図1は、細胞生存率とカスパーゼ3/7活性を測定するためのプロトコルの概要を示している。カスパーゼ活性は、有意に2時間インキュベートした（ 図2Aおよび表1）の後にPAでチャレンジ細胞において増加した。細胞膜の完全性の喪失は、PA（ 図2B）に2時間曝露した後に細胞において明らかであるアポトーシスの誘導に関連する形態学的変化である。 図3は、PAがアポトーシスを誘導し、インキュベーションを最適化することの重要性を実証している潜在的な経路を概説DEVD試薬中の時間。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51305/51305fig1highres.jpg" width...

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

このビデオの全体的な目的は、caspase-3によって測定されるアポトーシスの開始を判定するための高スループット・マルチプレックスアッセイを実証することです。まず、視床下部ニューロンにアポトーシスを誘導する飽和脂肪酸であるパルミチン酸を添加し、負荷をかけます。その後、アポトーシスの開始に伴い、蛍光試薬とマイクロプレートリーダーを用いてニューロンの細胞生存率を測定します。カスパーゼ-3によって切断されるアミノ酸配列である発光基質DEVDを細胞に添加します。手順の最終ステップとして、マイクロプレートリーダーを用いて発光を測定し、アポトーシスが進行している細胞で上昇するカスパーゼ活性を決定します。最終的に、生存細胞あたりのカスパーゼ活性比を5〜6時間以内に得ることができます。これは96ウェル形式で実施可能です。ウェスタンブロットやライシスなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、迅速かつ低コストなアッセイであり、複数のウェル形式でカスパーゼ3および7の活性を直接測定できることです。この手法は、アポトーシスの主要な調節因子の特定など、この分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法の有用性は、このマルチプレックス解析を細胞毒性と生存率を評価する正確な方法として利用できる点にあります。アッセイの手順自体は非常にシンプルですが、アッセイを確実に完遂させるためには、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。この手法は神経変性の解析に有用であるだけでなく、がん研究などで用いられるin vitroモデルやその他の疾患にも適用可能です。エンドポイントは細胞株やアゴニストによって異なるため、この手法を初めて用いる場合は、条件の最適化を行う必要があります。Caspase 3/7活性は一過性です。したがって、細胞ストレス因子の有効性によって、カスパーゼ活性を測定する適切なタイミングを決定するには、ある程度の労力を要する場合があります。まず、凍結保存したA12細胞を37 °Cのウォーターバスで急速解凍します。解凍後、細胞を75 cm²のベント付き培養フラスコに緩やかにピペッティングし、10 mLの温めたDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）を添加します。その後、フラスコを37 °C、5% CO₂インキュベーター内で一晩培養します。24時間後、培地を吸引して新しい培地と交換します。2〜3日間の培養後、コンフルエンシーが70〜80%になるまで細胞を培養し続けます。細胞数をカウントするために、まずDMEMと1×トリプシン-EDTA溶液を37°Cに温めておきます。フラスコから培地を吸引し、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄します。tryin溶液を500 µL加え、37 °Cで2～5分間インキュベートします。スクレイパーを用いてフラスコから細胞を剥離させ、5 mLの培地に懸濁します。細胞をセルストレーナーに通し、清潔な50 mLチューブに回収します。細胞をストレーナーに通す操作を複数回繰り返す必要がある場合がありますが、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を算出した後、3回を超えて繰り返さないでください。96ウェル透明底の黒色または白色壁プレートに、1ウェルあたり6,000個の細胞を最終容量100 µLの培地で播種し、5% CO2、37 °Cで24時間インキュベートします。パルミチン酸を滅菌済みの5 mLガラスバイアルに移し、100% DMSOで溶解させます。パルミチン酸ストック溶液をDMSOで10倍に希釈した後、あらかじめ加温したDMEMに加え、コントロール培地用として最終的に0.1 millimolarのパルミチン酸濃度になるように調製します。また、パルミチン酸を含む培地に追加したのと同濃度のDMSOをコントロール培地にも添加します。各ウェルの培地を除去し、パルミチン酸を含む（または含まない）培地を50 microliters加え、5%carbon dioxide、37 degrees Celsiusの条件下で2時間インキュベートします。その後、レジン試薬を5 microliters加え、室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにセットし、励起波長560 nanometers、蛍光波長590 nanometersで蛍光を測定します。細胞生存率を測定するため、結果を同一プレート内の相対蛍光単位（relative fluorescence units）として示します。DEVD試薬を55 µL加え、室温で2時間インキュベートします。再度マイクロプレートリーダーを用い、caspase 3/7活性を測定するためにルミネッセンスを記録します。結果は相対ルミネッセンス単位（relative luminescence units）として示され、ルミネッセンスはcaspase 3/7活性に正比例します。caspase 3/7活性を細胞数で標準化するには、細胞生存率をcaspase 3/7活性で除します。本プロトコルでは、アポトーシスによる細胞死のメカニズムを決定するために、2つの個別のアッセイをマルチプレックス化した際の結果について説明します。パルミチン酸で刺激した細胞では、カスパーゼ活性が有意に上昇しました。2時間のインキュベーション後、パルミチン酸の存在下で細胞膜の完全性が視覚的に変化していることが確認されました。ここでは、パルミチン酸がアポトーシスを誘導する潜在的な経路を示しています。アポトーシス誘導に用いるストレス因子の基礎的なメカニズムを理解することは、ストレス因子のインキュベーション時間の決定に役立ちます。カスパーゼ酵素はDEVD基質と相互作用する前に活性化される必要があるため、この手法を習得し適切に実施すれば、5〜6時間未満で完了させることができます。このビデオを視聴することで、in vitro視床下部神経細胞培養モデルを用いたマルチプレックス caspase-3/7 活性アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、インキュベーション時間が細胞の種類や使用するストレス因子またはアゴニストによって異なることに留意することが重要です。この技術の開発により、神経科学分野の研究者は、アポトーシス研究において信頼性が高く時間短縮が可能な手法を利用できるようになります。本手順に続き、アポトーシス過程における特定のタンパク質を標的とした追加の薬理学的アッセイを行うことで、変性疾患を誘発する基礎的なメカニズムを解明することが可能です。

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Research

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Neuroscience

神経科学

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

このビデオでは、細胞死またはアポトーシスを定量するためのin vitro...

Caspase-3/7 Assay:カエルの皮膚外植片におけるCaspase-3/7活性を測定することによりアポトーシスを定量化する発光ベースのアッセイ

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。...

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

アナスタシスは、細胞死のプロセスを逆転させた細胞は通常の健康な細胞と形態学的区別することができますので、生体内で検出する技術的に困難です。ここでの検出と追跡システムを使用して、新たに開発した生体内でCaspaseTracker バイオ センサー...

アナスタシスはIn Vivo CaspaseTracker バイオ センサーによる検出

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。...

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

ここでは、複雑な組織における機能的に関連するカスパーゼを同定、検証、標的化するための詳細な免疫組織化学プロトコルを示します。...

網膜組織における免疫染色カスパーゼ-9の定量

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

学ぶカスパーゼ3/7多重化アッセイによる視床下部神経細胞のアポトーシス評価法。パルミチン酸誘導ストレス下で蛍光・化学発光を用い、細胞生存率とカスパーゼ活性を同時測定する高速スクリーニング技術です。

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

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