視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

このビデオの全体的な目標は、カスパーゼによって測定されるアポトーシスの発症を決定するための高出力マルチプレックスアッセイを実証することです。3 7。まず、視床下部ニューロンは、アポトーシスを誘導する飽和脂肪酸であるパルミチン酸で挑戦されます。

次に、アポトーシスの発症後に、蛍光ベースの試薬とマイクロプレートリーダーを使用して、ニューロンの細胞生存率を測定します。カスパーゼ3によって切断されたアミノ酸配列であるルミノ基質DEVDが細胞に追加されます。手順の最後のステップは、マイクロプレートリーダーを使用して発光を測定し、アポトーシスを受けている細胞で増加するカスパーゼ活性を決定することです。

最終的に、生細胞あたりのカスパーゼ活性比は、5〜6時間未満で得ることができます。96ウェルフォーマット。ウェスタンブロットや溶解などの既存の方法のこの技術の主な利点は、複数のウェルフォーマットでカスパーゼ37活性を直接測定できる迅速で安価なアッセイであることです。

この方法は、アポトーシスの主要なモジュレーターの決定など、この分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の有用性は、このマルチプレックス化を細胞毒性と生存率を正確に評価する方法として使用できることです。アッセイはかなり簡単ですが、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、アッセイが成功裏に完了することを保証するために重要です。

この方法は神経変性に関する洞察を提供しますが、他の疾患やがん研究で使用されるようなin vitroモデルにも適用できます。この方法を初めて使用する個人は、エンドポイントが細胞株とアゴニストに依存するため、この手法を最適化する必要があります。カスパーゼ37活性は一過性です。

したがって、細胞ストレッサーの有効性によっては、キャスト塩基活性をアッセイする適切なタイミングを決定するには、ある程度の努力を要して迅速に開始することができる。12細胞を37°Cの水浴中で凍結した。解凍したら、細胞を75cm四方の通気式培養フラスコに静かにパイプでつなぎ、10ミリリットルの温かいデルコ、改変ワシ、培地、またはDMEMを加え、フラスコを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。

24時間後、培地を吸引し、新鮮な培地と交換すると、成長の2〜3日後に70〜80%のコンフルエンスが得られるまで細胞を成長させ続けることができます。細胞をカウントするには、まずDMEMと1つのxトリプシンを温め、EDTA溶液を摂氏37度にします。フラスコから培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄します。

500マイクロリットルのトリン溶液を加えてから、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。スクレーパーを使用してフラスコから細胞を分離し、細胞を5ミリリットルの培地に懸濁します。細胞をセルストレーナーに通し、清潔な50ミリリットルのチューブに入れます。

細胞を複数回ストレーナーに通す必要があるかもしれないが、ヘモサイトメーターの種子を使用して細胞を数えた後、3回以上繰り返さないでください。100マイクロリットルの培地の最終容量で、96ウェルの透明な底の黒または白の壁のプレートにウェルあたり6, 000個の細胞、 プレートを5%二酸化炭素と摂氏37度で24時間インキュベートします。パルミチン酸を滅菌済みの5ミリリットルガラスバイアルに移し、100%DMSOで可溶化します。

原液パルミチン酸溶液をDMSOで1〜10に希釈した後、PREWARM DMEMに添加して最終使用濃度0.1ミリモルのパルミチン酸をコントロール培地に求め、パルミチン酸を含む培地に添加したDMSOと同濃度のDMSOを添加します。各ウェルの培地を取り出し、50マイクロリットルの培地プラスマイナスチック酸と交換し、プレートを5%二酸化炭素と摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、5マイクロリットルの樹脂試薬を添加し、インキュベーション後、室温で10分間インキュベートし、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーにロードし、励起波長560ナノメートル、発光波長590ナノメートルで蛍光を記録します。

細胞の耐久力を測定するために、結果は同じプレートに対する相対的な蛍光単位として提示されます。55マイクロリットルのDEVDキャスト試薬を加え、室温で2時間インキュベートします。再びマイクロプレートリーダーを使用して発光を記録し、カスパーゼ37活性の結果は、カスパーゼ37に正比例する発光を持つ相対的な発光単位として提示され、カスパーゼ37活性を細胞数に正規化し、細胞生存率をカスパーゼ37活性で割る。

このプロトコルは、アポトーシスによる細胞死のメカニズムを決定するために、2つの別々のアッセイを多重化する結果を説明しています。カスパーゼ活性は、パルミチン酸を添加した細胞で有意に増加しました。2時間のインキュベーション後、パルミチン酸の存在下で細胞膜の完全性が目に見えて変化します。

ここに示されているのは、パルミチン酸がアポトーシスを誘導する潜在的な経路です。アポトーシスを誘導するために使用されるストレッサーの根底にあるメカニズムを理解することは、ストレッサーのインキュベーション時間の長さを決定するのに役立ちます。カスパーゼ酵素はDEVD基質と相互作用する前に活性化する必要があるため、習得すると、この手法は適切に実行されれば5〜6時間以内に実行できます。

このビデオを見れば、視床下部神経細胞培養モデルを用いたマルチプレックスカスパーゼ37活性アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、インキュベーション時間は細胞の種類や使用するストレッサーまたはアゴニストに依存することを覚えておくことが重要です。この技術の開発により、神経科学の分野の研究者は、アポトーシス研究に信頼性が高く時間を節約する技術を使用できるようになりますこの手順に続いて、アポトーシスプロセス内の特定のタンパク質を標的とする追加の薬理学的アッセイを実行して、変性疾患を開始する根本的なメカニズムを描写することができます。