マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

本手順の全般的な目的は、RNA干渉を用いて、候補遺伝子が自然免疫応答に及ぼす影響を調べることです。マウスマクロファージを用いてこれを行うため、マウスマクロファージ細胞株をトリプシン処理し、トランスフェクション溶液および目的のsiRNAと混合させます。その後、この混合液を96ウェルNucleoVetプレートに移し、Maxa 96ウェル・トランスフェクションシステムを用いてマクロファージにsiRNAをトランスフェクションします。細胞培養培地でインキュベートした後、トランスフェクションしたマクロファージにLPSなどの自然免疫活性化剤を添加して刺激を与えます。最後に、ELISAを実施してサイトカイン産生をモニタリングし、siRNA処理が自然免疫応答に及ぼす影響を評価します。

脂質媒介トランスフェクションに対する本手法の主な利点は、アッセイの堅牢性が高く、多くの遺伝子に対してハイスループットに適用できる点にあります。本法の鍵は、健全な細胞を用い、細胞を慎重に扱い、トランスフェクションの工程を効率的に行うことです。これから実演するように、本プロトコルではRAW 264.7マウスマクロファージ細胞株を使用し、これは付属文書に記載の方法で培養しています。

INAトランスフェクションプレートの準備として、細胞を20%の密度で播種し、細胞密度が80%以下になるまで1〜2日間培養します。継代数が3回から10回の細胞を使用することが重要です。解凍後、トランスフェクションに使用する96ウェルシャトルシステムのプログラミングから本手順を開始してください。

この操作を行うには、シャトルに接続されたコンピュータの左上にあるファイルメニューから、96ウェルシャトルソフトウェアを起動します。「new parameter file」を選択し、表示された96ウェルプレートの概略図上で、トランスフェクションを行うウェルをハイライトします。

選択されたウェルは緑色の枠で表示されます。RAW 264.7細胞に使用するマクロファージ細胞株に対応するプログラムを選択してください。「DS 1 36」を選択し、「Apply」をクリックします。

プログラムを選択すると、プレートの概略図上のウェルに色が付きます。濃い青色の白抜き円は、プログラムが割り当てられていないため、電撃が行われないウェルを示しています。次に、SF細胞株用96ウェル核エフェクター溶液に、付属のサプリメントチューブの内容量すべてを混合し、核エフェクター作業溶液を調製します。

混合した試薬を室温で平衡化させる。D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTAおよびPBSを37 °Cで加温する。接着性マクロファージを細胞培養ディッシュから剥離させるため、実験用のS-I-R-N-A-P max GFPコントロールプラスミドまたは蛍光標識siRNAを氷上で融解して準備する。

培地を吸引し、10 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。その後、PBSを除去し、細胞が剥離し始めるまで、プレートあたり1 mLの予め加温した0.25%トリプシンEDTAで細胞をインキュベートします。これには1〜2分かかります。

トリプシン処理の効果を最大化するため、インキュベーション中にプレートを軽く叩き、溶液を動かします。細胞が剥離した後、DMEMとFBSの混合液9 mLをピペッティングで静かに加え、その後、細胞をピペッティングで滅菌チューブに回収します。Hema Cytometerを用いて、単離したマクロファージの数を計測します。

10 cmプレートあたり約1,000万個のマクロファージが得られる見込みです。96ウェルシャトルの各ウェルに200,000個の細胞が必要なことから、必要なマクロファージの総数を算出してください。算出した細胞数を遠心チューブにピペットで分注します。

室温で150 G、10分間、細胞を滅菌済みの96ウェル丸底プレートに遠心分離します。このプレートを使用することで、試薬の損失を最小限に抑えつつ混合を容易にできます。トランスフェクションを行う各ウェルに、各siRNAを2 µLずつ添加します。siRNAの種類数によっては、マクロファージの遠心分離ステップの間にこの操作を行うことができる点に注意してください。

この手順で最も困難な点はエレクトロポレーションであり、重要なのは細胞を非常に穏やかに扱い、極めて迅速に作業することです。細胞が毒性のあるトランスフェクション溶液にさらされることになるため、遠心分離した細胞から培地を吸引し、その後、サプリメント溶液を含むNucleoEffector溶液で穏やかに再懸濁してください。

マルチチャンネルピペットを用いて、細胞を直ちに滅菌済みのトラフに移します。再懸濁した細胞混合液を20 µLずつ、siRNAが含まれピペッティングで穏やかに混合した96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、細胞とINAの混合液20 µLを96ウェル核導入プレートに移します。このステップで気泡が発生すると、核導入時にエラーが生じる可能性があるため、気泡が入らないようにすることが極めて重要です。

すべての実験サンプルをトランスフェクションプレートに分注した後、付属のリッドで蓋をし、硬い表面に軽く叩きます。気泡を除去するため、96ウェルプレートを96ウェル Nucleo Effector シャトルにセットし、プログラム画面の右下にある「upload and start」を選択してください。その後、プログラムの指示に従い、Nucleo Effector プロセスが正常に完了したウェルの結果を保存します。

トランスフェクション済みサンプルは、画面上の96ウェル概略図において、プラス記号が入った緑色の円で表示されます。マイナス記号が入った赤色の円は、核酸導入直後の気泡または試薬の分注量誤りに起因する可能性が高いエラーを示しています。マルチチャンネルピペットを使用して、あらかじめ温めておいたRPMI 1640を80 µL添加してください。

それぞれの側面に培地を滴下します。この段階のトランスフェクション後の細胞は非常に繊細であるため、培地をゆっくりと混ぜ合わせます。培地を急速に添加すると、生存率が大幅に低下します。

トランスフェクションしたサンプルとRPMI 1640を含む96ウェルプレートを、37 °C、5% CO2のインキュベーター内に2分以上静置します。さらなる操作を行う前に、細胞を回復させることが重要です。プレートをインキュベーターから取り出した後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの混合液を96ウェル組織培養プレートに慎重に転移します。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、それぞれにFBS含有DMEMを100 µLずつ加えます。トランスフェクション直後に24〜36時間インキュベートし、回復させた後、フローサイトメトリーを行います。蛍光標識SI RNAのトランスフェクション効率を評価する場合、トランスフェクション翌日のアッセイで細胞の99%以上がトランスフェクションされている必要があります。GFPプラスミドのトランスフェクション効率については、細胞の30〜50%がGFPを発現している必要があります。24〜36時間のインキュベーション後、新鮮な培地でLPSまたはその他の自然免疫活性化剤を調製します。LPSをFBS含有DMEMで最終濃度20 ng/mLまで希釈してください。

次に、96ウェルプレートから培地を慎重に吸引し、LPSを含む新鮮な培地を細胞に加えます。プレートをインキュベーターに入れ、刺激後さまざまな時間におけるLPSまたはその他の自然免疫刺激剤への反応をモニタリングします。細胞の上清をピペットで採取し、ELISA分析用の96ウェル保存プレートに移します。

細胞生存率をモニターするために上清を除去した後、PBSで1:100に希釈したフルオレセインジアセテートを各ウェルに100 µL加え、室温で1〜5分間インキュベートします。生細胞内の細胞エステラーゼによって切断された際の細胞の蛍光をプレートリーダーを用いてモニターします。この化合物は蛍光を発するため、先天性免疫応答をモニターする上での本アプローチの有用性が示されます。

既知の自然免疫調節遺伝子を標的とするsiRNAを、RAW 264.7マクロファージ細胞株にトランスフェクションしました。その後、細胞をLPSで刺激し、前炎症性サイトカインであるIL-6およびTNF-αの産生を、ここに示すようにELISA法でモニターしました。

LPSの受容体であるtoll-like receptor fourを阻害しますが、他のTLRは阻害しません。SIRを用いた結果、LPSによって誘導されるIL sixおよびTNF alphaの産生が著しく減少しました。irnaによるIL sixの阻害はIL sixの産生を減少させましたが、TNF alphaの産生には影響しなかったことに留意してください。

これらのデータは、siRNAを用いた自然免疫の候補調節因子のノックダウンにおいて、良好な有効性と特異性が得られることを示唆しています。良好な transfection および細胞の回復を実現するための鍵は、非常に健康な細胞を使用し、transfection および回復プロセスにおいて細胞を丁寧に扱い、細胞を核注入用エフェクター溶液に入れた後は迅速に作業することです。この手順に従うことで、遺伝子ノックダウンを監視するための qPCR や、自然免疫応答を調査するためのその他の多くの解析を実施することが可能です。