マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

この手順の全体的な目標は、RNA干渉を使用して、自然免疫応答に対する候補遺伝子の影響を調査することです。これを行うためにマウスマクロファージでは、マウスマクロファージ細胞株をトライプしてトランスフェクション溶液および目的のSI RNAと組み合わせ、混合物を96ウェルヌクレオVETEプレートに移し、Maxa 96ウェルトランスフェクションシステムを使用してsiRNAをマクロファージにトランスフェクションし、細胞培養物とのインキュベーション後に、 中程度、LPSまたは自然免疫の他の活性化因子がトランスフェクトされたマクロファージに適用され、それらを刺激します。最後に、Eliza'sは、サイトカイン産生をモニターし、自然免疫応答に対するsiRNA処理の効果を評価するために実行されます。

脂質媒介トランスフェクションに対するこの技術の主な利点は、当社のアッセイが堅牢であり、ハイスループット専門職の多くの遺伝子に適用できることです。この方法の鍵は、健康な細胞に働きかけ、それらを優しく扱い、トランスフェクションプロセス中に効率的に働くことです。我々が示すように、このプロトコルは、添付の文書に記載されているように培養される生の2 64 0.7マウスマクロファージ細胞株を使用します。

INAトランスフェクションプレートの準備として、細胞は20%coの流暢さで増殖し、細胞が80%以下になるまで1〜2日で増殖します。継代3と10の間にあるセルを使用することを忘れないでください。解凍後、トランスフェクションに使用する96ウェルシャトルシステムをプログラミングして、この手順を開始します。

これを行うには、シャトルに接続されているコンピューターで、左上のファイルメニューから96ウェルシャトルソフトウェアを起動します。新しいパラメータファイルを選択します。表示された96ウェルプレートの概略図でトランスフェクションされるウェルを強調表示します。

緑色のボックスは、選択したウェルを示します。生の2 64 0.7細胞に使用されているマクロファージ細胞株に対応するプログラムを選択してください。DS 1 36 を選択し、[適用] を選択します。

プログラムを選択すると、回路図プレート上のウェルが色付けされることに注意してください。濃い青色の空の円は、プログラムが割り当てられておらず、ショックを受けない井戸を示しています。次に、SF細胞株96ウェルヌクレオエフェクター溶液を付属のサプリメントチューブの全内容物と混合することにより、作業用ヌクレオエフェクター溶液を調製する。

混合試薬を室温で平衡化させます。D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTAおよびPBSを摂氏37度で温めます。実験用S-I-R-N-A-P max GFPコントロールプラスミドまたは蛍光標識siRNAを氷上で解凍して調製し、細胞培養皿から付着性マクロファージを剥離します。

培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、PBSを除去した後、細胞が剥離し始めるまで、プレートあたり1ミリリットルの事前に警告された0.25%トリプシンEDTAで細胞をインキュベートします。これには 1 分から 2 分かかります。

インキュベーション中にプレートを軽くたたいて溶液を動かし、トリプシンの化を最大化します。細胞が分離した後、9ミリリットルのDMEMとFBSをピペッティングで上下させて穏やかに混合し、滅菌チューブにピペッティングして細胞を回収します。Hema Cytometerを使用して単離されたマクロファージの数をカウントします。

10cmプレートあたり約1,000万個のマクロファージが予想されます。96ウェルシャトルの各ウェルに必要なマクロファージの総数を計算するには、200, 000個の細胞が必要です。計算された数の細胞を遠心分離チューブにピペットで移します。

細胞を室温で150 Gで10分間遠心して、滅菌済みの96ウェル丸底プレートにすると、試薬の損失を最小限に抑えながら混合が容易になります。トランスフェクションする各ウェルに各IRNAを2マイクロリットル加えます。siRNAの数によっては、マクロファージの遠心分離ステップ中にこれを達成できることに注意してください。

この手順の最も難しい側面は、細胞を非常に穏やかに扱い、非常に迅速に機能させるキーであるエレクトロポレーションです。細胞が有毒なトランスフェクション溶液に入ったら、遠心分離細胞から培地を吸引し、核エフェクター溶液に穏やかに再懸濁します。サプリメント溶液を含むSF。

マルチチャンネルピペットを使用して、細胞を滅菌トラフに直ちに移し、再懸濁した細胞混合物の20マイクロリットルをsiRNAを含む96ウェルプレートの各ウェルに移し、ピペッティングで上下に穏やかに混合します。次に、20マイクロリットルの細胞INA混合物を96ウェル核ベテプレートに移します。このステップで気泡が発生しないようにすることが重要です。これは、核の愛情伝達中にエラーを引き起こす可能性があるためです。

すべての実験サンプルをトランスフェクションプレートに入れた後、付属の蓋で覆い、硬い表面を非常に優しく軽くたたきます。気泡を除去するには、96ウェルプレートを96ウェル核エフェクターシャトルにセットし、プログラム画面の右下にある[アップロードして開始]を選択します。次に、プログラムプロンプトに従って、核の愛情プロセスウェル中に結果を正常に保存します。

トランスフェクトは、画面上の96ウェルの概略図に、プラス記号付きの緑色の円で示されます。マイナス記号の付いた赤い円は、核の作用の直後に気泡または試薬の量が正しくないピペッティングによるエラーである可能性が高いことを示しています。マルチチャンネルピペットを使用して、80マイクロリットルのプレウォームRPMI 1640を追加します。

それぞれの側面に中程度。この段階では非常にデリケートなトランスフェクションされた細胞と培地をゆっくりと混合させます。培地の添加が早すぎると、生存率が大幅に低下します。

トランスフェクションしたサンプルとRPMI 1640を入れた96ウェルプレートを、5%CO2を含む摂氏37度のインキュベーターに2分以上置きます。さらなる操作を行う前に、細胞が回復するのを待つことが重要です。インキュベーターからプレートを取り出した後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルからの混合物を96ウェル組織培養プレートに慎重に移します。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、それぞれにFBS入りのDMEMを100マイクロリットル追加します。トランスフェクションおよびリカバリー直後に24時間から36時間ウェルインキュベートし、フローサイトメトリーを行います。蛍光標識SIirnaのトランスフェクション効率を評価するには、細胞の99%以上をトランスフェクションアッセイの翌日にトランスフェクションする必要があります GFPプラスミドのトランスフェクション効率については、細胞の30〜50%がGFPを発現する必要があります 24〜36時間のインキュベーションに続いて、LPSまたは自然免疫の他の活性化剤を新鮮な培地で調製し、LPSをFBSとDMEMで20ナノグラム/ミリリットルの最終濃度に希釈します。

次に、96ウェルプレートから培地を慎重に吸引し、LPSを含む新鮮な培地を細胞に加えます。プレートをインキュベーターに入れて、刺激後のさまざまな時点でLPSまたはその他の自然免疫刺激物質に対する応答を監視します。細胞から上清を96ウェル保存プレートにピペットで移し、Elizaによる分析を行います。

上清を除去して細胞生存率をモニターした後、PBS中の1〜100フルオレセインジアセテートを100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で1〜5分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して、生細胞の細胞エステラーゼによって切断された細胞内の蛍光をモニターします。この化合物は、自然免疫応答をモニタリングするためのこのアプローチの有用性を示すために蛍光化します。

既知の自然免疫調節遺伝子を標的とするsiRNAを、生の2 64 0.7マクロファージ細胞株にトランスフェクションしました。次に、細胞をLPSで刺激し、炎症誘発性サイトカインを産生しました。IL 6とTNF alphaは、ここに示すようにElizaによってモニターされました。

LPSの受容体であるToll様受容体4の阻害が、他のTLRの阻害は抑制されない。SIRを使用すると、LPSの産生が大幅に減少し、IL6およびTNFアルファが誘導された。IRNAによるIL 6の阻害はIL 6の産生を減少させたが、TNFαの産生には影響しなかったことに留意されたい。

これらのデータは、自然免疫の候補調節因子のsiRNA媒介ノックダウンの良好な有効性と良好な特異性を示唆しています。良好なトランスフェクションと良好な細胞回収の鍵は、非常に健康な細胞と働き、トランスフェクションと回復の過程で細胞を優しく扱い、細胞が核エフェクター溶液に入ったら迅速に働くことであることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、遺伝子ノックダウンをモニターするQPCRや、自然免疫応答を調査する他の多くのアッセイなど、他の多くのアッセイを実施することができます。