Name: Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ 海馬スライスからのCA1核エンリッチ画分単離法を用いた長期増強誘導と活性依存的核タンパク質輸送の研究。この手法は学習と記憶の分子メカニズム解明に貢献します。

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この研究はDFG(SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK)、DIP助成金(MRK)、EU FP7 MC-ITN NPlast(MRK)、Center for Behavioral Brain Sciences(CBBS、Sahsen-Anhalt)、(AKおよびSB)によって資金提供されました。MMは、European Molecular Biology Organization(EMBO)のLong-Term Fellowship（EMBO ALTF 884-2011)およびMarie-Curie IEFの受賞者です。

成体ラットの脳からの急性海馬スライスの調製<ol><li>イソフルランでラットを麻酔。注意：クローズexicatorを使用しての手順を実行して、イソフルランを吸入しないでください。動物が完全に麻酔をかけていることを確認します。 </li><li>ラットを斬首、すぐに脳を隔離し、mM単位precarbonated（95％O 2/5％CO 2ガス混合物）の氷冷をゲイ液（組成物中にそれを浸す：130のNaCl、4.9のKCl、1.5のCaCl 2·2H 2 O 、0.3のMgSO 4·2H 2 O、11のMgCl 2·6H 2 O、0.23 KH 2 PO 4、0.8のNa 2 HPO 4·7H 2 O、5グルコース·H 2 O、25 HEPES、22 NaHCO 3を、pHが7.32） 30分1,2,10,16のため。 </li><li>嗅内皮質の小脳及び一部を削除します。その内側表面に各半球を下に置き、その後、正中矢状カットで皮質半球を分離します。その後作る各半球13,14の背側縁に沿って50〜70カット（50〜70°の横）。 </li><li>セクショニングシステムのスライスプラットフォーム上で新鮮にカット面を各半球を接着。プラットフォームはprecarbogenated、氷冷をゲイのソリューションでカバーしなければならない。 </li><li> z軸の振動を最小化するように調整ビブラトームを使用して前方から後方側に350μmの50〜70の横断スライスをカットします。海馬、嗅内皮質subicularとだけでなく、海馬に背外側に位置している皮質を実験13,14に使用するスライスの一部となります。 </li><li> U字型や水没型保育器に海馬スライスを移し、carbogenated人工脳脊髄液（単位：mm含むACSFで32℃で少なくとも2時間インキュベートする：110のNaCl、2.5のKCl、2.5のCaCl 2·2H 2 O、1.5マグネシウム4·2H 2 O、1.24 KH 2 PO 4、10mMグルコース·H 2O、27.4 炭酸水素ナトリウム、pH7.3）で1,2,10,16。 </li></ol> 2電極のポジショニング、ベースラインの記録、およびLTPの誘導<ol><li>顕微鏡下に取り付けられた水没型の記録室に海馬スライスを転送します。 32℃で少なくとも30分間carbogenated ACSFで（6〜7ミリリットル/分）を灌流する。 </li><li> （チップ抵抗は3-5MΩです）ACSFを充填したガラスキャピラリー微小電極を準備します。 </li><li>刺激のためとのfEPSPは1,2,10（ 図2）を記録するのCA1放線層におけるCA1シェーファー担保繊維にACSFを充填したガラス微小電極を配置します。電極間の距離は約300μmであるべきである。 </li><li> 3-4 Vの範囲で、二相性の矩形電流パルス（200ミリ秒/極性）を持つシェーファー担保繊維の刺激によってフィールド興奮性シナプス後電位（fEPSPs）を想起</li><li> INPを測定することにより、最大刺激テストを実行しますUT-出力の関係とは、得られた最大のfEPSP-勾配値の40％として、刺激の強さを定義し、実験を通じて一定に保つ。 </li><li>最大刺激試験後、少なくとも15分間のベースライン記録を開始します。実験の間、毎分の刺激テストするための応答を測定します。低周波刺激とベースラインのレコーディングを行ってください。 </li><li>少なくとも30分間のベースラインを記録します。 </li><li>後期LTP誘導は5分あいだの間隔で100Hzで3 1秒刺激トレインからなる高周波数100 Hzの強直誘発を適用するため。 CA1領域内の刺激の場を増やすには5μMのビククリンは強直誘発前の2分で洗浄することができますし、すぐに最後の強直誘発した後に洗浄する必要があります。 </li></ol> 3 LTPの誘導後のスライスの収集とスナップ凍結<ol><li>後期LTPを誘導するテタヌス刺激の3列車の後に2分または30分の記録を停止LTP。 </li><li&gt;は、電極を取り出し、すぐにドライアイス上に置きColD前駆金属プラットフォームにスライスを転送する。 U字型のインキュベーターで維持制御スライスするための手順を繰り返します。注意：ドライアイスでの作業中に手袋を使用してください。 </li><li> -80℃で1.5mlチューブとストア内の各スライスを収集します。 </li></ol>海馬のCA1領域から核エンリッチ画分の4の単離<ol><li> -80℃から凍結切片と1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブを取り出し、氷上に保管してください。 </li><li>チューブに、プロテアーゼ（PI）およびホスファターゼ（PS）阻害剤を含有する新鮮な冷たいTBS緩衝液を0.5ml加える。 2〜3分間インキュベートし、実体顕微鏡に移す。注意：PIおよびPSでの作業中に保護手袋と白衣を使用してください。 </li><li> 2本の針を使用して、海馬のCA1錐体層域を解剖。実体顕微鏡とのCA1領域を切断するための第二の針の下にスライスを保持するための一方の針を使用してください。 </li><li>解剖したCAを収集50μlの溶解緩衝液（：10 HEPES、1.5のMgCl 2、10、PIおよびPSとのKCl、pHは7.9、mMの中に含む1×低張溶解バッファー）を含む新しい1.5 mlチューブに（グループごとに）5スライスから1地域。材料のこの量は2-3イムノブロットを実行するのに十分であることに注意してください。 </li><li>慎重なピペッティングを上下することにより採取した組織を均質化する。 200μlのピペットを使用してください。細胞が膨潤することを可能にするために5-7分間氷上でライセートをインキュベートする。 </li><li> 、溶解液2μlのを取り、顕微鏡スライド上にドロップし、明視野顕微鏡下で細胞の膨潤を可視化する。細胞の適切な腫れで核が無傷の構造ラウンドとして表示されます。 </li><li> &#39;ホモジネート分画」として新しい1.5mlチューブにサンプルを20μlを収集します。 4×SDSサンプル緩衝液の変性8を添加する。 </li><li> 1分間11000 rpmで、残りの溶解物を遠心。 </li><li>慎重に、TRトップ（ &#39;サイトゾル画分」）から上清を収集ansfer新しいチューブに4倍サンプル緩衝液20μlを加える。 </li><li>低張性緩​​衝液60μlの中でペレットを再懸濁し、4倍のサンプル緩衝液20μlを加える。この画分は、「核濃縮画分」と呼ばれる。 </li><li>ホモジネート、細胞質ゾル、核濃縮された画分は、後で免疫ブロッティングのために℃〜-20℃または-80℃で保存することができる。 </li></ol> Synapto核タンパク質のための5。半定量免疫ブロッティング<ol><li>サンプルをDefreeze 95°Cで5分間それらを沸騰。 </li><li>各画分からの5μlを取り、アミド黒のテストまたはBCA試験によりタンパク質濃度を決定する。 </li><li> SDS-PAGE上ホモジネートからのタンパク質サンプルを同量、細胞質および核に富む画分をロードします。コントロールとLTPスライスからのサンプルを、直接比較のために同じゲル上に配置する必要があります。 </li><li>標準ウェスタンブロッティングの手順を実行します（ウェット転送を推奨します）。 </li><li>トンを有する膜をプローブ好きな彼は、抗体。その後、同じブロット（または同じ試料を並行して実行される）、細胞質マーカーを用いてプローブすることができます - ニューロン特異enolase2（NSE2）および核マーカー - のNeuNおよびローディング対照としてアクチン抗体。 </li></ol> 6。データ解析<ol><li> LTP誘導の効率は、Clampfitソフトウェアによって分析することができる。ベースライン記録の平均勾配は、二元配置ANOVAを使用して強直誘発後の斜面と比較して、p &lt;0.05での有意差があると考えした。のfEPSPの勾配値は、平均±SEMとして図に描かれた</li><li>イムノブロットの定量化のために、オートラジオグラフィーフィルムのいずれかをスキャンし、LICORシステムをImageJのまたは蛍光バンドによってタンパク質バンドの積分密度を分析する。免疫反応性バンドの値がロードおよびブロッティング制御のために正規化されるべきである。 nonparametricalマンホイットニーU検定を使用してもよい制御およびLTP群の比較のために。 </li></ol><table border="0"CELLPADDING = &quot;0&quot; CELLSPACING = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> バッファの名前 </td><td> 試薬 </td><td> 濃度（mM）の </td><td> 額 </td><td> コメント/説明 </td></tr><tr><td> をゲイ液 （pH：7.3〜7.4） </td><td> NaClを</td><td> 130 </td><td> 7.6グラム</td><td>除菌</td></tr><tr><td>千ミリリットル</td><td>塩化カリウム</td><td> 4.9 </td><td> 0.37グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>のCaCl 2·2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.22グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> の MgSO 4·2H 2 O </td><td> 0.3 </td><td> 0.0739グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>のMgCl 2·6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2.24グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> 0.0313グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>のNa 2 HPO 4·7H 2 O </td><td> 0.8 </td><td> 0.2145グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>グルコース·H 2 O </td><td> 5 </td><td> 0.9909グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5.96グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 炭酸水素ナトリウム</td><td> 22 </td><td> 1.85グラム</td><td></td></tr><tr><td> ACSF液（pH：7.3〜7.4） </td><td> NaClを</td><td> 110 </td><td> 6.428グラム</td><td>除菌</td></tr><tr><td>千ミリリットル</td><td>塩化カリウム</td><td> 2.5 </td><td> 0.1865グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>のCaCl 2·2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0.368グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> の MgSO 4·2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370グラム</tD&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0.169グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>グルコース·H 2 O </td><td> 10 </td><td> 1.9817グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 炭酸水素ナトリウム</td><td> 27.4 </td><td> 2.3グラム</td><td></td></tr><tr><td> 1×低張緩衝液 （7.9） </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0.23グラム</td><td></td></tr><tr><td> 100ミリリットル</td><td>のMgCl 2·6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.0304グラム</td><td></td></tr><tr><td></td><td>塩化カリウム</td><td> 10 </td><td> 0.07455グラム</td><td></td></tr></tbody></table> 表1。バッファ。

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

上記のプロトコルに記載の手順は、どのように迅速にスライスの誘導エリアを分析し、活動依存性タンパク質のダイナミクスを研究するための核濃縮画分を準備し、LTPを、若年または成体ラットからスライス海馬急性の準備誘導し、記録するためのガイダンスを提供する。このアプローチは、互いに独立して使用されるいくつかの異なる方法の組み合わせに由来する。私たちは、ワークフローを最適化し、LTPの誘導によって、タンパク質の細胞内再分布を研究するために、独自の実験をセットアップするための初心者のための十分な詳細を提供します。例として、私たちは、LTPの後期形はS180リン酸化されたヤコブの核蓄積を誘導することを実証している。所与のタンパク質の既存の核プールのリン酸化およびシナプス活性後のリン酸化形態の移動を区別するために、このアプローチは、核濃縮画分中の目的のタンパク質の総レベルの制御と組み合わせることができる。また、TESTILTP誘導後の異なる時点にわたるngのサンプルは、タンパク質活性化/不活性化または核ターンオーバーの時間経過を研究するための非常に洞察力に富んだかもしれません。 刺激されたスライスか...

シナプスN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDARを）は、シナプスNMDARをの活性化に対し、シグナル伝達、シナプス可塑性および細胞の生存に重要な役割を果たす神経変性および細胞死を誘発することができる。これらの変更は、厳密に制御/調整された活動依存性遺伝子発現に依存し、このようにして活性化シナプスや樹状突起および核7との間に一定の通信を必要とする。 MAPは、ERK1 / 2シグナル伝達シナプスNMDARを下流のエフェクターであるとシナプス外NMDA受容体を介したシグナルがないか、またはERK1 / 2活性8,11に対する阻害効果を有するのに対し、NMDAR活性化によって誘導される遺伝子発現に関与していませんキナーゼ。 遠位樹状突起と核の間を往復することが示されているタンパク質の数があります。これらのタンパク質の多くは、核局在化シグナルを含有し、積極的に核6,9にダイニンとインポーチン依存的に微小管に沿って輸送される。 Interestinglyは、これらのメッセンジャーのいくつかの特定のシナプスの刺激に応答して、核への唯一のトランジット。例えば、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質2（CREB2）の逆行性輸送は、化学LTDなくLTP 12によって誘導される。ローカライズされたNMDAR依存シナプス刺激は、長期的な海馬可塑4に関与している転座法、核内にCREB調節される転写コアクチベーター（CRTC1）を駆動する。最近、蛋白質メッセンジャーヤコブは、シナプスとシナプス外NMDA受容体活性化の両方の後に核へ移行し、CREB依存性遺伝子の転写5を調節することが示された。信号のシナプスまたはシナプス外起源は、ヤコブの翻訳後修飾で符号化される。シナプス活性は、初代海馬培養物中の核へのその後の転座のための必要条件である180位（pJacobS 180）での重要なセリンでヤコブのERK1 / 2依存性リン酸化を誘導する。また、私nは急性海馬スライスのpJacobSのCA1ニューロンは180はシャファー側枝LTP後に核に移行したが1,10 LTDません。 pS180ヤコブは可塑性関連遺伝子の発現の増加につながり、この遺伝子の発現は、シナプス機能にフィードバックする。著しく対照的に、シナプス外NMDARを活性化がSer180でリン酸化されておらず、核内の異なるタンパク質複合体と関連する可能性があります後に核へ移行ヤコブは原因となる「CREBを遮断&#39;とシナプスの接点10の後退。 synapto-核タンパク質のメッセンジャーの核内移行のほとんど発表された研究は、解離神経細胞初代培養で行われてきた。従って、そのような知見は、神経細胞の接続性と機能がはるかに優れた保存された海馬スライスを使用して、生理学的に関連性の高い状態で再現できるかどうかを確認するために興味深いものになるだろう。ここでは、LTPドを評価するための最適化されたプロトコルを提示イムノブロットによるタンパク質メッセンジャーの核移行をペンダント。この方法は、粗核画分中のタンパク質の活性依存性リン酸化を分析するのに適している。具体的には、現在のプロトコルは、急性CA1海馬スライス、誘導、およびLTPの記録の調製を含む。次に、CA1領域が微視的に刺激された領域を分離するために解剖される。私たちは、趙と同僚17で導入された変更でCellLytic核抽出キットにより提供される核を単離するためのプロトコルを組み合わせて変更しました。最適化された手順では、細胞膨張および核の放出を可能にする低張性緩衝液中で解剖し、CA1領域の溶解が含まれています。細胞溶解および核の形態は、顕微鏡検査により決定することができる。核濃縮は、短い遠心分離工程によって達成される。のNeuN及びNSE2、核または細胞質画分の特異的マーカーに対する抗体で免疫ブロットすると、このアプローチは速いとして使用できることを示しこれらの細胞成分分画を分離し、タンパク質リン酸化のような非常に不安定な翻訳後修飾を研究するために、再現性のプロトコル。さらに、この方法は、海馬スライスの解剖CA1領域に由来する小さな組織サンプルのために有利であり、海馬切片の免疫組織化学的に組み合わせて使用​​することができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DAコンバーター</td><td>Cambridge Electronics Design, UK</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a</td><td>>Leica S4E, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイブロトーム</td><td>ライカ VT1000S, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>絶縁パルス刺激装置</td><td>A-Mシステム、米国</td><td></td><td>モデル 2100</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE システム</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ルイグス &ノイマン、SM-5、ドイツ</td><td></td><td></td></tr>ブロ<tr><td>ッティングチャンバーおよび電力供給業者</td><td>のHoefer Scientific Instruments、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>サンフランシスコの</tr><tr><td>水中タイプ録音チャンバー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のU字型および水中タイプインキュベーター&nbsp;</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の小さな外科用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄いヘラプラスチック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック培養皿&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge;99.5%、PA、ACS、ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>ロス</td><td>アート-Nr.6781.1</td><td>&ge;99.5%、年率、ACS、ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>メルク</td><td>1.02382.0500</td><td>pro 分析</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>AppliChem</td><td>CAS-NO:7791-18-6;EC-NO:2320946</td><td>分子生物学用</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>分子生物学用</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td><td>余分な純粋な</td></tr><tr><td>ブドウ糖&middot;H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>分子生物学</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge;年率99.5%</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホスフォストップ</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>企業</td><td>カタログ番号</td><td>種数</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>Biogenes</td><td></td><td>rabbit (希釈 1:100)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>マウス (希釈 1:1,000)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Cell Signaling</td><td>D20H2</td><td>rabbit (希釈 1:1,000)</td></tr><tr><td>Β-actin</td><td>Sigma</td><td>A-5441</td><td>マウス (希釈 1:5,000)</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>種</td></tr><tr><td>IgG HRP 抱合型</td><td>DAKO</td><td></td><td>ヤギ 抗マウス (1:5,000)</td></tr><tr><td>IgG HRP 抱合型</td><td>NEB</td><td></td><td>ヤギ 抗ウサギ (1:5,000)</td></tr></tbody></table>

synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからca1原子力エンリッチ画分の単離

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

勉強活動依存性タンパク質の発現、細胞内転座、またはリン酸化がシナプス可塑性の基礎となる細胞メカニズムを理解することが不可欠です。長期増強（LTP）および急性海馬スライスにおいて誘導される長期抑圧（LTD）が広く学習および記憶の細胞モデルとして受け入れられている。活動依存性タンパク質の動態を可視化するために、ライブセルイメージングまたは免疫組織化学の手法を使用する多くの研究があります。しかし、これらの方法は、単一ニューロンにおける蛍光タグ融合タンパク質の免疫細胞または過剰発現のための抗体の適合性に依存している。タンパク質のイムノは調査結果の独立した確認を提供する代替的な方法である。個別のtetanized海馬スライスからの細胞成分分画の製造における最初の制限要因は、材料の量が少ないです。第二に、処理手順は非常に重要ですlとさえ非常に短いとマイナーな操作のためスライスをivingすると、特定のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導し得る。ここでは、ラット脳からの急性海馬スライスのCA1領域から十分な純度の核濃縮画分の十分な量を得るために最適化されたワークフローを説明する。代表的な例として、私たちはsynapto-核タンパク質のメッセンジャーのERK1 / 2リン酸化形態はヤコブが積極的にLTPの誘導時に核に移動し、CA1ニューロンの核濃縮画で検出できることを示している。

私たちは、以前にsynapto-核タンパク質メッセンジャーヤコブはLTPの誘導ではなく、LTD 1以下の核内に蓄積することが示されている。また、シナプス刺激後のヤコブの転座は、MAPK ERK1 / 2およびSer180でのヤコブのリン酸化（ 図1）の活性化が必要である。リン酸化されたヤコブはインポーチン依存的に核に移行し、リン酸化された状態が15αinternexin中間径フィラメント（ 図1）との会合により、長期間にわたって保存することができる。ヤコブのリン酸化状態は、活動依存性遺伝子および細胞生存の発現に重要である。興味深いことに、シナプス外NMDARをの活性化にも核にヤコブを駆動しますが、この場合、ヤコブはSer180でリン酸化されていないし、その核内蓄積がCREBを誘導する5,10を 「遮断」。上記の結果は、protocoにより得た私たちの最近の研究で確立LS（参照Karpova ら 10モデルの詳細については）。 <p class="jove_c...

私たちは、海馬のCA1領域とスライスのtetanizedエリアからの核に富む画分のその後の単離における長期増強の誘導のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは、学習および記憶の細胞モデルにおいて活性に依存する核タンパク質のインポートを決定するために用いることができる。

Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

この実験の全体的な目的は、神経接続と機能が十分に維持された急性海馬スライスを用い、タンパク質の活性依存的な核細胞質シャトリングを研究することである。この目的を達成するために、まず成年雄ラットの海馬を摘出し、第二段階として急性横断スライスを作製する。海馬スライスを記録チャンバーに移し、CA1の放射状層（stratum radiatum）において後期LTPを誘導する。次に、増強させたスライスと対照スライスを急冷凍結させ、刺激したCA1領域を解剖して核濃縮画分を分離し、その後の免疫ブロット分析に供する。ウェスタンブロッティング分析に基づく結果は、LTP誘導から30分後の増強スライスと対照スライスとの間で、核内リン酸化タンパク質レベルに差があることを示しています。一般的に、この手法に不慣れな方は2つの理由から苦労します。1つ目は組織サンプルの量が少ないことであり、2つ目は、核を放出させるための低張溶解バッファーによるサンプルの溶解に要する重要な時間枠があることです。海馬の生体試料調製およびCA1領域の単離には、迅速かつ非常に正確な解剖が必要であり、いくつかのコツがあるため、この手法の視覚的な実演が極めて重要となります。より容易に行うためには、海馬のCA1領域から核濃縮分画を調製するための、書面および視覚的な指示の両方に従う必要があります。手順のライシス（溶解）デモンストレーションは、pinon Postal Laboratoryによって行われます。彼女が、急性海馬ライシスの調製方法とLTPの誘導方法を実演します。当研究室のBerra g学生によるC one領域の解剖後、核と破壊物の単離方法を説明します。まず、ラットの脳を摘出し、あらかじめ炭酸ガス飽和させた氷冷ガッセ溶液に浸します。次に、小脳と内側前頭前皮質の一部を取り除きます。正中矢状断により皮質半球を分離します。その後、各半球の背側縁に沿って50〜70度の角度で切断します。次に、各半球を内側面に合わせて置き、切断した面をビブラトームのスライス台に接着します。その後、プラットフォームを、あらかじめカーボゲン飽和させた氷冷ガゼ溶液で覆います。バイブラトームを用いて、海馬形成、歯状回、および内嗅皮質を含む350 µmのスライスを、前方から後方に向かって切り出します。その後、スライスをU字型の浸漬型インキュベーターに移し、カーボゲン飽和CSFを用いて32 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。次に、海馬スライスを顕微鏡下に設置した浸漬型記録チャンバーへ移します。32 °Cで、炭酸ガス含有A CSFを6 mL/minで30分以上灌流させます。30分後、ガラスキャピラリー電極にCSFを満たします。刺激用にCA1領域のSchafer collateral fibersにマイクロ電極を配置し、もう一方の電極をフィールドEPSP記録用にCA1のstratum radiatumに、300 µmの間隔を空けて配置します。次に、Schafer collateral fibersに3〜4 Vの位相的矩形電流パルスを印加し、フィールドEPSPを誘発させます。入出力関係を測定して最大刺激テストを行い、最大フィールドEPSP勾配値の40%を刺激強度として定義します。次に、実験全体を通して1分ごとにテスト刺激に対する反応を測定し、少なくとも15分間ベースラインを記録します。後期LTPを誘導するために、高頻度刺激を加え、caone領域の誘発フィールドEPSPを増大させます。テタヌス刺激の2分前に5 µMのby COEをA CSFに投与し、最後のテタヌス刺激の直後に洗浄します。録画を停止します。後期LTP誘導後2分または30分が経過した時点で、電極を取り外し、スライスをドライアイス上に配置したあらかじめ冷却したメタルプラットフォームに迅速に移動させます。その後、各スライスを1.5 milliliterのエッペンドルフチューブに回収し、-80 °Cで保存します。このステップでは、-80 °Cで凍結保存した切片を取り出し、氷上で保持します。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む、冷やした新鮮なTBSバッファーを0.5 mLチューブに加えます。実体顕微鏡に移す前に、2～3分間インキュベートします。次に、1本の針でスライスを固定し、もう1本の針でCA1領域を切り出すことで、海馬のCA1 stratum parama dole領域を解剖します。その後、1グループあたり5枚のスライスから切り出したCA1領域を、50 µLの溶解バッファーを入れた新しい1 mLチューブに回収します。次に、200 µLピペットを用いて注意深くピペッティングを行い、回収した組織を均質化します。細胞を膨潤させるため、ライセートを氷上で5〜7分間インキュベートします。その後、ライセートを2 µL取り、顕微鏡スライドに滴下します。明視野顕微鏡下で、細胞の膨潤を確認します。核は適切に膨潤した、丸く完全な構造として観察されます。ここで、均質化画分として、20 µLのサンプルを新しい1.5 mLチューブに回収します。そこに、変性剤を含む4 XSDSサンプルバッファーを8 µL加えます。次に、残りのライセートを1100 RCFで1分間遠心分離します。1分後、上清を慎重に回収し、新しいチューブに移します。続いて、4倍濃度のサンプルバッファーを20 µL加えます。次に、ペレットを60 µLの低張緩衝液で再懸濁し、20 µLの4xサンプルバッファーを加えます。この分画を核濃縮分画と呼びます。ホモジネート、細胞質分画、および核濃縮分画を-20 °Cまたは-80 °Cで保存します。本手順における後のイムノブロッティングに向けて、サンプルを解凍し、95 °Cで5分間加熱します。その後、AM mito blackテストまたはBCAテストでタンパク質濃度を測定し、ホモジネート、細胞質および核濃縮画分から等量のタンパク質サンプルをロードします。SDS-PAGEゲルにおいて、コントロール群とLTPスライス群のサンプルを同一のゲルに配置することで、ウェスタンブロットで直接比較できるようにします。この図は、細胞質および核のマーカーを用いて検出した、ca1ライセートのホモジネート、細胞質および核濃縮画分のイムノブロットを示しています。これは、teinの誘導から2分後および30分後のホモジネートにおけるPJS 180レベルの免疫ブロット解析であり、またこちらは核濃縮画分におけるPJS 180レベルの免疫ブロット解析です。誘導後2分および30分においても、全CA 1タンパク質ホモジネートおよび誘導2分後の核濃縮画分におけるリン酸化Jacobレベルは不変でした。しかし、LTP誘導から30分後には、p Jacob, S 180の免疫反応性に有意な増加が認められました。この手順を行う際は、適切な量の低張溶出バッファーを使用することを忘れずに行ってください。また、サンプルの溶解に要する重要な時間を標準化する必要があります。特に、この方法を海馬以外のラットまたはマウスの脳組織サンプルから核分画を単離するために適用する場合、本手順に続き、OTPの誘導後に核へ移行した候補タンパク質や、キナーゼまたはホスファターゼの活性型などのシグナル分子に対する抗体を用いた相補的な免疫染色などの手法を併用することが、結果の検証に有用です。さらなる疑問を解消するために、薬理学的治療を行うことができます。例えば、シナプス核タンパク質メッセンジャーの転位にどのようなシグナル伝達カスケードが関与しているか、あるいはそれらがどのように核機能に影響を与えるかなどが挙げられます。加えて、海馬が関与する疾患におけるシナプス核メッセンジャータンパク質の役割を研究することも可能です。例えば、アルツハイマー病などです。

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウス海馬の脳スライスにおける興奮性シナプス電流のマイクロRNA媒介阻害を示しています。CA3ニューロンには、蛍光レポーターを発現するためのコンストラクト、光活性化膜チャネル、および電位依存性カルシウムチャネルの発現をダウンレギュレートするマイクロRNAを保有する組換えウイルスベクターが感染しました。スライスを記録チャンバーに入れ、CA1ニューロンを記録ピペットでパッチすると、光パルスを使用して光活性化チャネルを刺激し、イオンの流入と活動電位の生成をもたらしました。CA3ニューロンに電位依存性カルシウムチャネルがないと、神経伝達物質の放出が阻害され、シナプスに結合したCA1ニューロンの興奮性シナプス後電流が阻害されます。...

マイクロRNAを介したマウス海馬切片における興奮性シナプス後電流の阻害

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。...

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

このビデオ記事は、げっ歯類の急性海馬切片を使用したCA1錐体ニューロンのシナプスタグ付け、捕捉、交差タグ付けなど、長期的な可塑性とそれに関連するプロセスを研究するための実験的手順について説明しています。...

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。...

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

電気けいれん発作 (ECS) 重度のうつ病に対する電気けいれん療法の実験動物モデルであります。ECS はグローバル、シナプス形成、シナプス可塑性につながる海馬の活動を刺激します。ここでは、ラットの ECS 誘導、シナプス蛋白質のてんかん発作による変化を調べることになったの細胞レベル下の分別の方法について述べる.

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

ここで説明したプロトコルを記述する蛍光分析、biocytin 回復と海馬 ca 2 介在神経細胞内の電気生理学的記録in vitro...

Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

学ぶ 海馬スライスからのCA1核エンリッチ画分単離法を用いた長期増強誘導と活性依存的核タンパク質輸送の研究。この手法は学習と記憶の分子メカニズム解明に貢献します。

Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離

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