Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離

私たちは、海馬のCA1領域とスライスのtetanizedエリアからの核に富む画分のその後の単離における長期増強の誘導のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは、学習および記憶の細胞モデルにおいて活性に依存する核タンパク質のインポートを決定するために用いることができる。

この実験の全体的な目標は、ニューロンの接続性と機能がよく保存されている急性海馬スライスを使用して、タンパク質の活動依存性核細胞質シャトルを研究することですこの目標を達成するために、成体雄ラットの海馬を最初に単離し、急性横切片を第2のステップとして調製します。海馬スライスは記録チャンバーに移され、後期型のLTPがCA1層ラジアル原子に誘導されます。次に、増強スライスおよびコントロールスライスをスナップ凍結し、刺激されたca one領域を解剖して、さらなる免疫ブロット分析のために核濃縮画分を単離する。

ウェスタンブロッティング分析に基づく結果は、LTPの誘導から30分後に増強されたスライスとコントロールスライスの間で核リン酸化タンパク質レベルに差があることを示しています。一般的に、この方法に不慣れな人は、2つの理由で苦労します。第一に、組織サンプルの量が少ないこと、第二に、低張溶解バッファー中のサンプルの溶解のために繰り返される重要な時間枠、核の放出を可能にする 海馬の生活の準備とC領域の分離には迅速で非常に正確な解剖が必要であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要ですが、特定のトリックがあります。

それを容易にするためには、海馬のC領域から核富化画分を調製するための書面と視覚化された指示の両方に従う必要があります。Lysis Demonstration of procedure は pinon Postal Laboratory によって行われます。彼女は、急性海馬溶解を準備し、LTPを誘導する方法を示します。

Cの解剖後、ベラGを通じて1つの領域が、私たちの研究室の学生が核と破壊を分離する方法を教えてくれます。この手順は、ラットの脳を分離し、事前に炭酸化した氷冷視液に浸すことから始めます。次に、小脳と経腸皮質の一部を切除します。

皮質半球を中央矢状切開で分離します。その後、各半球の背側の端に沿って50〜70度の切り込みを入れます。次に、各半球をその内側の表面に置き、ビブラートのスライスプラットフォームに切りたての表面で各半球を接着します。

その後、プラットフォームを事前にカルボゲン化された氷冷視液で覆います。海馬形成の亜盆皮質と経腸皮質を含む350マイクロメートルのスライスをビブラムで前面から後側にカットします。その後、スライスをU字型の水中インキュベーターに移し、カルボゲンA CSFと摂氏32度で少なくとも2時間インキュベー

次に、海馬スライスを顕微鏡下に取り付けられた水中タイプの記録チャンバーに移します。スライスに炭酸A CSFを毎分6ミリリットルで32°Cで少なくとも30分間灌流した。30分後、ガラスキャピラリーマイクロ電極にCSFを充填します。

CA 1 シェーファー側副繊維にマイクロ電極を配置して刺激用、もう 1 つを ca 1 層準備完了原子に配置し、300 マイクロメートルの距離で記録するフィールド EPSP 用原子を配置します。次に、3〜4ボルトの位相矩形電流パルスをSchaferの担保ファイバーに供給することにより、フィールドEP SSPを呼び起こします。入力出力の関係を測定し、最大フィールドEPSPの傾き値の40%として刺激強度を定義することにより、最大刺激テストを実行します。

次に、実験全体を通して毎分テスト刺激に対する反応を測定することにより、ベースラインを少なくとも15分間記録します。後期LTPを誘導するには、高周波テインを適用して、約1つの領域で誘発磁場EPSPを増加させます。テチンの2分前にA CSFにCOEで5マイクロモルを塗布し、最後の破傷風の直後に洗い流します。

録音を停止します。その後、LTP誘導の2分後または30分後に電極を取り外し、ドライアイスの上に置いた予め冷却した金属プラットフォームにスライスを迅速に移します。次に、各スライスを1.5ミリリットルのエンドオルフチューブに集め、摂氏マイナス80度で保存します。

このステップでは、冷凍スライスをマイナス80°Cから取り出し、氷の上に保ちます。プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む0.5ミリリットルの新鮮な冷たいTBSバッファーをチューブに加えます。それらを2〜3分間インキュベートしてから、実体顕微鏡に移します。

次に、海馬のCA1つの層パラマドール領域を、スライスを一方の針で保持し、CAの一方の領域をもう一方の針で切断することにより、解剖します。その後、50マイクロリットルの溶解緩衝液を含む新しい1ポイントミリリットルチューブに、グループあたり5つのスライスから解剖した約1つの領域を収集します。次に、200マイクロリットルのピペットで慎重にピペッティングして、収集した組織を均質化します。

ライセートを氷上で5〜7分間インキュベートし、細胞が膨潤するまで待ちます。その後、2マイクロリットルのライセートを取り、顕微鏡スライドに落とします。細胞の腫脹を明視野顕微鏡で可視化します。

核は、適切な膨潤を伴う丸い無傷の構造として現れます。次に、ホモジネート画分として新鮮な1.5ミリリットルのチューブに20マイクロリットルのサンプルを収集します。8マイクロリットルの変性4つのXSDSサンプルバッファーを追加します。

次に、残りのライセートを1100 RCFで1分間遠心分離します。1分後、上から上清を慎重に収集し、新しいチューブに移します。続いて、20マイクロリットルの4×サンプルバッファーを添加します。

次に、ペレットを60マイクロリットルの低張緩衝液に再懸濁し、20マイクロリットルの4×サンプル緩衝液を追加します。この画分は、核富化画分と呼ばれます。ホモジネート、細胞質、核に富む画分は、摂氏マイナス20度または摂氏マイナス80度で保存します。

この手順での後の免疫ブロッティングでは、サンプルを解凍し、摂氏95度で5分間煮沸してから、ホモジネート、細胞質、および核濃縮画分から同量のタンパク質サンプルであるAM水戸ブラックテストまたはBCAテスト負荷でタンパク質濃度を測定します。SDSページでは、コントロールスライスとLTPスライスのゲルサンプルを同じゲルに配置し、ウェスタンブロットで直接比較する必要があります。この図は、細胞質マーカーおよび核マーカーでプローブされた1つの溶解物のホモジネート、細胞質および核濃縮画分の免疫ブロットを示しています。

これは、テイン誘導の2分後と30分後のホモジネート中のPJS 180レベルの免疫ブロット解析であり、核富化画分のPJS 180レベルの免疫血液解析です。化後2分と30分後、リン酸化ジェイコブレベルは、総CAで1つのタンパク質ホモジネートで、および化後2分で核富化画分で変化しなかった。しかし、LTPの誘導から30分後にp Jacob, S 180免疫反応性で有意な増加が見られました。

この手順を試みるときは、適切な量の低張溶解弁を使用することを忘れないでください。また、サンプルの溶解の重要な時間枠を標準化する必要があります。特に、この方法を海馬以外のラットまたはマウスの脳組織サンプルからの核および画分の単離に適用する場合、この手順に続いて、OTPの誘導後に核に輸入された候補タンパク質に対する抗体による補完免疫染色や、活性型のキナーゼやホスファターゼなどのシグナル伝達分子などの他の方法が、これらの結果の検証に役立ちます。

追加の質問に答えるために薬理学的治療を行うことができます。例えば、シナプス核タンパク質の遺伝子の転座にどのようなシグナル伝達カスケードが関与しているのか、あるいはそれらが核機能にどのように影響するのかなどです。さらに、海馬が関与する疾患におけるシナップ核メッセンジャータンパク質の役割を研究することができます。

たとえば、アルツハイマー病です。