のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

この手順の全体的な目的は、迅速かつ定量的なin vitro法を用いて、血管新生に関与する遺伝子またはパスウェイを特定することです。まず、アッセイの前日に、初代または不死化内皮細胞を血清飢餓状態にします。次に、内皮細胞をカルシンと共に30分間インキュベートし、続いてPBSで細胞を洗浄します。

次に、血管内皮細胞をトリプシン処理し、凝集塊を除去するためにフィルターを通した後、細胞数をカウントします。最終ステップとして、血管新生因子を含む可能性のあるコンディション培地と血管内皮細胞を混合し、凝固させた基底膜抽出物の上に分注します。最終的に、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて管状ネットワークを可視化し、専用のコンピュータープログラムを用いて定量化します。

血管新生をアッセイする他の手法と比較して、本手法の主な利点は、セットアップが容易で比較的安価であり、数時間以内に管腔構造が形成されること、および本手法を用いて定量化が可能であることです。エリカ・ブルウィンクルは、アメリカン大学生物学科の大学院生です。適切な培地を用いて、アッセイ開始の2日前に3B11細胞を新しいフラスコに継代してください。最良の結果を得るには、継代回数が2回から6回の細胞を使用してください。

次に、添加剤を加えたdmm中で細胞を24時間培養します。細胞の準備が整ったら、血清飢餓状態にします。培地を低血清培地に交換し、血清飢餓状態の細胞をさらに24時間培養します。

最良の結果を得るためには、BMEストック溶液の濃度が10 mg/mLであることをメーカーに確認することが重要です。還元増殖因子BMEを冷蔵庫内で解凍します。BMEは温まると凝固するため、使用前は低温で保持します。

次に、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による観察に必要となる培地を解凍し、カルセインAMを最終濃度2 µg/mLになるように培地へ添加します。カルセインAMでラベル化した細胞を、暗所で約30～45分間静置します。この後、培地を除去し、3B11細胞をDPBSで洗浄します。次に、1 mLのトリプシンEDTAを添加して細胞をトリプシン処理します。トリプシン処理が完了した後、

細胞を最終容量 10 milliliters になるように再懸濁します。サプリメント添加dmmを用いて、100 micrometer のセルストレーナーでろ過し、細胞から凝集塊を除去します。細胞数をカウントした後、チューブ形成アッセイを開始するために、適切な最終濃度に再懸濁し、冷却します。

24ウェルプレートと1mLチップを、分注の20〜30分前に準備しておきます。これにより、分注開始時にBMEが早すぎるタイミングで凝固するのを防ぎます。還元増殖因子含有BME 250 µLを、24ウェルプレートの各ウェルにピペットで分注します。ピペットを第2ストップまで押し込まないようにし、気泡の混入を避けてください。

ピペッティングを行い、ウェルに分注した後、ウェルの中央に十分な量のBMEが残っているか確認してください。メニスカスが形成された際、マトリックスが薄すぎると、細胞が単層にしか形成されません。次に、プレートを30分間インキュベートし、BMEを凝固させます。

BMEが凝固した後、約300 µLの条件化培地と10 µLの再懸濁したthree B 11細胞を混合し、その細胞懸濁液をプレートのウェルに分注します。プレートをインキュベーターに入れた後、2〜4時間以内にチューブの形成が始まります。条件化培地中の血管新生因子の濃度により、チューブ形成のピークは3〜12時間の間に現れることがあります。アッセイのタイミングは、個々の研究条件に合わせて最適化する必要があります。

チューブは多くの場合18時間以内に劣化し始め、チューブ形成のピーク時に血管内皮細胞がアポトーシスを起こします。チューブネットワークを破壊しないよう、ウェルから培地を慎重に吸引してください。次に、直ちに可視化を行うため、各ウェルを1 mLのDPBSで洗浄します。

各ウェルに1 mLの新鮮なDPBSを加え、共焦点顕微鏡で管腔ネットワークを撮影し、後の可視化のために管腔ネットワークを固定します。吸引後の各ウェルに4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを除去した後、DPBSで2回洗浄し、さらに各ウェルに1 mLの新鮮なDPBSを加えます。これらの画像は、マウスの角化細胞または線維芽細胞のいずれから分泌された血管新生因子が、管腔形成を誘導できることを示しています。

時間の経過とともに、内皮細胞は移動し、播種から1〜2時間で小さな分枝を形成し始めます。管腔形成は4〜6時間で最大に達しました。24時間までには一部の分枝は残っていましたが、多くの細胞がアポトーシスを起こし、管腔の断裂が始まりました。

細胞数は管腔形成に多大な影響を及ぼします。播種した細胞数が不十分な場合は、形成される管腔が少なくネットワークも最小限となりますが、播種数を増やすにつれて、管腔ネットワークはより広範になります。しかし、濃度が高すぎると、細胞が凝集したり単層を形成したりし始め、処置群間の差が不明瞭になります。十分な管腔形成を確実にするため、細胞は少なくとも2代的に継代させておく必要があります。

B 11の3つの増殖速度は非常に速いため、25%の細胞を継代すれば、翌日にはフラスコ内でコンフルエントになります。ここでは、Image Jの血管新生プラグインを使用して、カルシネオAM染色したチューブネットワークの全ノード数、メッシュ内のチューブ数、およびネットワーク上の融合点を検出します。さらに、このプログラムを使用して、ノード、チューブ、またはメッシュを個別に検出し、定量化することが可能です。

このビデオを視聴することで、一般的な落とし穴を避けながら、迅速かつ信頼性の高い方法でin vitro血管新生アッセイを実施する方法について、十分に理解できるはずです。