Name: のための内皮細胞チューブ形成アッセイ体外血管新生に関する研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぼう、内皮細胞を用いたチューブ形成アッセイによる血管新生の定量的解析法。蛍光顕微鏡でネットワークを可視化し、専用プログラムで定量化する迅速な手法です。

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この研究は、米国立衛生研究所の国立癌研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされており、NCIによってUA5CA152907を付与した。

血管新生の可能性をテストするために調節された媒体の1集<ol><li>ネイティブまたは低血清培地中での血管新生または抗血管新生の可能性について試験されるべき一次または不死化細胞を増殖し、馴化培地を収集します。 <ol><li>あるいは、使用がすぐに馴化培地、または等分し、数ヶ月間-80℃で保存した。ネガティブコントロールとしてnonconditioned天然又は低血清培地を使用し、ポジティブコントロールとしての非馴化完全な増殖培地（10％のFBS、または適切な濃度）を使用します。あるいは、血管新生の潜在的な刺激物質をテストするために、関心のある特定のタンパク質の既知の濃度の成長因子を欠いているサプリメントチャコール処理メディアだけでは、成長因子を含まない培地と比較します。 </li></ol></li></ol>アッセイの前に内皮細胞の調製<ol><li>アッセイの2日前に、新しいT-75フラスコ内に通路3B-11細胞。細胞の継代数は重要です。細胞は第二と第六の通路の間にある場合、このアッセイは、最も効果的に機能します。アッセイは、内皮細胞は第二の前または第十経過した後に使用されている場合にはうまく機能しません。 </li><li> 10％FBS、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で24時間細胞を成長させる。 </li><li>以下のようにアッセイの1日前に、血清は3B-11細胞を飢え： <ol><li> 3B-11細胞から培地を吸引。 </li><li> DMEMの追加低減血清培地は、0.2％のFBS、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを補充した。 </li><li>さらに24時間細胞を成長させる。 </li></ol></li></ol>アッセイの前に試薬の調製注：BME濃度は、多くの依存性の高い変数である。濃度がそのためBMEメーカーが保証するために購入前に連絡する必要があり、10mg未満/ mlである場合にはBMEはうまく動作しません十分に集中し、多くの買収。 <ol><li>デフロストは、冷蔵庫に成長因子BMEを減少させた。時暖かいBMEが固化するので、使用前に風邪に保つ必要があります。 BMEは、数週間の冷蔵保存、あるいは等分し、-80℃で凍結することができる。 </li><li>成長因子低減BMEは、従来のBMEより好ましい。 BMEにおける血管新生因子の欠如は、簡単に条件培地からの要因が管形成に与える影響を観察するようになります。 </li><li>解凍メディアがテストされる。 </li></ol>アッセイの直前に、内皮細胞の4。準備<ol><li>ウォッシュDPBS中3B-11細胞。 <ol><li>蛍光または共焦点顕微鏡による可視化が所望される場合、3B-11細胞を洗浄する前に、2μg/ mlの最終濃度で培地中の内皮細胞へのカルセインAMを加える。アッセイの開始前に37℃および5％CO 2の暗所でカルセイン標識された細胞を配置する。在庫カルセインを溶解DMSOおよびカルセインAMは、一度DMSOの最終濃度が0.1％を超えるべきではない培地で希釈する。細胞（上記のステップ4.1）から30〜45分間洗浄カルセインAMの後、実験は以下の通りに進みます。 </li></ol></li><li> T-75フラスコ1 mlトリプシン-EDTAを加えることによって細胞をトリプシン処理。 </li><li>トリプシン処理が完了した後、DMEM中の10ミリリットルの最終体積に細胞を再懸濁することにより、10％のFBS、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンをトリプシンを中和する。 </li><li> 100μmのセルストレーナーで濾過して細胞が塊を除去した。 </li><li> DMEM中7.5×10 6細胞/ ml、10％FBS、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンの最終濃度で細胞を再懸濁細胞を数える。 </li></ol> 5。管形成アッセイ<ol><li> BMEはプレムしないようにプレートをロードする前に、24ウェルプレート、冷蔵庫内または20〜30分間、氷上で1ミリリットルのヒントを配置aturely固化する。 </li><li>ピペットで24ウェルプレートの各ウェルに減少成長因子BMEを250μl。小出ししながら、最終的な停止にピペットを押下しないことにより、泡を作成しないようにしてください。十分なBMEがうまくの中心メニスカスの形のまま​​であるように注意してください。マトリックスが薄すぎると、細胞は単層を形成する。 </li><li> BMEを固めるために30分間37℃で24ウェルプレートをインキュベートし、5％CO 2。 </li><li> BMEが設定されると、再懸濁3B-11細胞（約75,000細胞）10μlの馴化培地の約300μlのミックス。 <ol><li>馴化培地および使用内皮細胞型に応じて播種した細胞の数のボリュームを調整し、活性を証明するために馴化培地の連続希釈液をテストする。比較セルが異なる条件下で増殖させた場合は、メディアを調整するために使用された細胞の数に馴化培地容積を正規化。 </li></ol></li><li>チューブウィルlは2-4時間以内に形成され始める。馴化培地中の血管新生因子の濃度に依存して、ピーク管形成は、3〜12時間の間に発生し、アッセイのタイミングを最適化する必要がある。代わりに、不死化細胞の一次内皮細胞を扱う場合は、初期管形成は、数時間遅れで表示してもよい。 <ol><li>チューブは、多くの場合、18時間以内に悪化し始め、内皮細胞はアポトーシスを受ける。 </li></ol></li><li>ピーク管形成の際には、ウェルから慎重に吸引メディアはBME上の管ネットワークの中断を避けるため。 <ol><li> 1ミリリットルのDPBS、その後吸引して、各ウェルを洗浄する。 <ol><li>即時の可視化のために、細胞は、4.1.1のように、カルセインAMで染色した場合には、デジタルカメラ、または蛍光/共焦点顕微鏡に取り付けられた倒立顕微鏡を用いて各ウェルの画像管網に1ミリリットル新鮮なDPBSを追加します。 </li><li>後で視覚化のためのチューブネットワークを修正し、それぞれに4％パラホルムアルデヒドを追加するにはウェルを吸引し、室温で15分間インキュベートする。 <ol><li>パラホルムアルデヒドを取り外し、DPBSで二回洗浄し、各ウェルに1mLの新鮮なDPBSを追加します。 </li><li>前少数の管のような固定を顕微鏡イメージは、この手順の間に破損する可能性があります。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>チューブネットワークの6。定量<ol><li>調査者の好みに応じていくつかの異なる方法でチューブネットワークを定量化し、いくつかのコンピュータプログラムは、以下のパラメータを測定する能力を有する。管の数;ループ/メッシュ数;ブランチサイト/ノード数;チューブの長さ。 </li><li>そのようなチューブネットワークの定量化のための血管新生アナライザーのプラグイン16と画像jとして代表的なコンピュータプログラムを使用してください。 </li></ol>

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<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
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<li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

脈管形成は生理学的および病理学的プロセスの両方に関与している。血管新生に関与するメカニズムを研究することは、血管新生における主要な工程を再現アッセイの使用を必要とします。内皮細胞のチューブ形成アッセイは、他のアッセイに比べていくつかの利点を提供する。これは、アップを設定することが容易で比較的安価であり、時間内の細管を生成し、かつ定量化可能である。また、24または96ウェルプレートで完了することができ、したがって、血管新生を刺激または阻害する因子を同定するためにハイスループットスクリーニングのために使用することができる。私たちの実験のために3B-11マウス内皮細胞を使用したが、このアッセイは、HUVECおよびSVECを含む、ヒトまたはマウスの内皮細胞株、多様な行うことができる。 内皮細胞管形成アッセイを行うために、内皮細胞は、炎症または抗血管新生因子を含むし、減圧成長因子基底膜マトリックス上にメッキ馴化培地と混合される。 Endotheliらの細胞を1時間以内に自分自身を整列させるために開始し、内腔を有する細管を2時間以内に現れ始める。管形成は、位相差倒立顕微鏡を用いて可視化すること...

血管新生、既存血管からの新しい血管の発達は、1〜3治癒 、器官の成長、胚発生、創傷を含めた多様なプロセスに不可欠である。新組織に内皮細胞、供給酸素と栄養が並ん血管を開発し、造血細胞による免疫監視を促進し、老廃物2,4を削除します。血管新生は、胚および胎児の発生の間に極めて重要である。しかしながら、この方法は、創傷治癒、骨格の成 ​​長、妊娠や月経周期1-3時の回の中を除いて、成人に休眠残る。 最後の20年間、血管新生を制御する重要な分子機構が出現し始めている。血管新生は、インテグリン、ケモカイン、アンジオポエチン、酸素検知剤、接合部の分子と内因性阻害5を含むプロと抗血管新生シグナルでバランスが厳密に調節イベントです。 proangいったんそのような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、および上皮成長因子（EGF）などのイオ起源の信号は、内皮細胞は、内皮細胞が基底膜を分解するプロテアーゼを放出するレセプター活性化する。内皮細胞はその後増殖し、遊走、6,7日あたり数ミリメートルの速度で芽を形成する。 血管新生は、癌、乾癬、糖尿病性網膜症、関節炎、喘息、自己免疫疾患、感染症、およびアテローム性動脈硬化症8-10を含むさまざまな病的状態と関連している。による各種疾患における血管新生の重要性は、このプロセスは、より良い治療法の設計に重要である調節遺伝子および経路を理解する。 管形成アッセイは、血管形成に関与する遺伝子または経路を決定するための迅速かつ定量的な方法である。まず1988年に記載され、このアッセイの基礎をなす原則は、内皮細胞が分裂し、血管新生シグナルに応答11-13に急速に移行する能力を保持するということである。さらに、内皮細胞は分化し、基底膜抽出物（BME）のマトリックス上で培養管様構造を形成するように誘導される。これらの管は、接合部複合体により連結内皮細胞に囲まれた内腔を含んでいる。管形成はほとんどのチューブ量及び血管新生の刺激の種類に応じて2〜6時間以内に、このアッセイにおいて形成で迅速に起こる。 内皮細胞のいくつかのタイプの初代細胞および不死化細胞株14,15の両方を含むこのアッセイのために使用することができる。この記事に使用される細胞株は、マウス3B-11であったが、同じ方法論は、HUVEC（ヒト）細胞のようなSVEC4-10（マウス）のような他の内皮細胞株または初代内皮細胞と適用することができる。細胞株が使用されるかに依存し、内皮CEのかどうかLLSは、形質転換または非転換され、最適化は、適切な管形成に必要な理想的な時間を同定するために実施される必要がある。

<table><tbody><tr><td>Costar 24-well tissue culture-treated plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gibco pen strep</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr></tbody></table>

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

血管新生は、正常な組織発達および創傷治癒に不可欠なプロセスであるが、病理学的状態の多様な関連付けられている。このプロトコルを使用して、血管形成は、高速、定量化可能な方法でインビトロで測定することができる。一次または不死化内皮細胞馴化培地と混合し、基底膜マトリックス上に播種される。内皮細胞は、馴化培地中に見出さ血管新生信号に応答して、毛細血管様構造を形成する。管形成は、内皮細胞は、1時間とルーメンを含む細管を2時間以内に出始め以内に自分自身を整列し始めてすぐに発生します。チューブは、位相差倒立顕微鏡を用いて可視化することができ、または細胞が、蛍光または共焦点顕微鏡を介して可視化アッセイチューブに先立っカルセインAMで処理することができる。ブランチサイト/ノードの数は、/メッシュをループし、または形成された管の数または長さを容易にvitrでの測定値として定量化することができるO血管新生。要約すると、このアッセイは、迅速な再現可能な、そして定量的に血管形成の促進または阻害に関与する遺伝子および経路を同定することができる。

マウス3B-11内皮細胞は、固化した成長因子低減BME上に播種した - このアッセイにおいて、生成物マトリゲルを使用した - そして経時的に追跡。 図1に示すように、いずれのマウスのケラチノサイトまたは線維芽細胞によって分泌される血管新生因子は、経時管形成を誘導することができる。内皮細胞は、遊走し、メッキの1〜2時間以内に、小さな枝を形成し始める。最大管形成は、以前にケラチノサイトから得た条件培地を使用して4-6時間で到達した。 24時間では、いくつかの枝が残ったが、細胞の多くは、アポトーシスとなり、管が切断するようになった。 細胞数は、管形成に大きな影響（ 図2）を有している。細胞の数が不十分で、マトリックス上に播種した場合、いくつかの管が形成し、ネットワークは最小限に抑えられます。より多くの細胞を播種するように、チューブネットワークがより広範になる。しかし、濃度が高すぎるでは、細胞が凝集または形成し始める単層を、治療群間の差は、マスクとなる。 3B-11...

管形成アッセイは、 インビトロ血管新生を測定するための高速、定量可能な方法である。内皮細胞は、馴化培地と混合し、基底膜抽出物でメッキされる。管形成は容易に定量時間と新たに形成された細管内で発生する。

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

この手順の全体的な目的は、迅速かつ定量的なin vitro法を用いて、血管新生に関与する遺伝子またはパスウェイを特定することです。まず、アッセイの前日に、初代または不死化内皮細胞を血清飢餓状態にします。次に、内皮細胞をカルシンと共に30分間インキュベートし、続いてPBSで細胞を洗浄します。次に、血管内皮細胞をトリプシン処理し、凝集塊を除去するためにフィルターを通した後、細胞数をカウントします。最終ステップとして、血管新生因子を含む可能性のあるコンディション培地と血管内皮細胞を混合し、凝固させた基底膜抽出物の上に分注します。最終的に、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて管状ネットワークを可視化し、専用のコンピュータープログラムを用いて定量化します。血管新生をアッセイする他の手法と比較して、本手法の主な利点は、セットアップが容易で比較的安価であり、数時間以内に管腔構造が形成されること、および本手法を用いて定量化が可能であることです。エリカ・ブルウィンクルは、アメリカン大学生物学科の大学院生です。適切な培地を用いて、アッセイ開始の2日前に3B11細胞を新しいフラスコに継代してください。最良の結果を得るには、継代回数が2回から6回の細胞を使用してください。次に、添加剤を加えたdmm中で細胞を24時間培養します。細胞の準備が整ったら、血清飢餓状態にします。培地を低血清培地に交換し、血清飢餓状態の細胞をさらに24時間培養します。最良の結果を得るためには、BMEストック溶液の濃度が10 mg/mLであることをメーカーに確認することが重要です。還元増殖因子BMEを冷蔵庫内で解凍します。BMEは温まると凝固するため、使用前は低温で保持します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による観察に必要となる培地を解凍し、カルセインAMを最終濃度2 µg/mLになるように培地へ添加します。カルセインAMでラベル化した細胞を、暗所で約30～45分間静置します。この後、培地を除去し、3B11細胞をDPBSで洗浄します。次に、1 mLのトリプシンEDTAを添加して細胞をトリプシン処理します。トリプシン処理が完了した後、細胞を最終容量 10 milliliters になるように再懸濁します。サプリメント添加dmmを用いて、100 micrometer のセルストレーナーでろ過し、細胞から凝集塊を除去します。細胞数をカウントした後、チューブ形成アッセイを開始するために、適切な最終濃度に再懸濁し、冷却します。24ウェルプレートと1mLチップを、分注の20〜30分前に準備しておきます。これにより、分注開始時にBMEが早すぎるタイミングで凝固するのを防ぎます。還元増殖因子含有BME 250 µLを、24ウェルプレートの各ウェルにピペットで分注します。ピペットを第2ストップまで押し込まないようにし、気泡の混入を避けてください。ピペッティングを行い、ウェルに分注した後、ウェルの中央に十分な量のBMEが残っているか確認してください。メニスカスが形成された際、マトリックスが薄すぎると、細胞が単層にしか形成されません。次に、プレートを30分間インキュベートし、BMEを凝固させます。BMEが凝固した後、約300 µLの条件化培地と10 µLの再懸濁したthree B 11細胞を混合し、その細胞懸濁液をプレートのウェルに分注します。プレートをインキュベーターに入れた後、2〜4時間以内にチューブの形成が始まります。条件化培地中の血管新生因子の濃度により、チューブ形成のピークは3〜12時間の間に現れることがあります。アッセイのタイミングは、個々の研究条件に合わせて最適化する必要があります。チューブは多くの場合18時間以内に劣化し始め、チューブ形成のピーク時に血管内皮細胞がアポトーシスを起こします。チューブネットワークを破壊しないよう、ウェルから培地を慎重に吸引してください。次に、直ちに可視化を行うため、各ウェルを1 mLのDPBSで洗浄します。各ウェルに1 mLの新鮮なDPBSを加え、共焦点顕微鏡で管腔ネットワークを撮影し、後の可視化のために管腔ネットワークを固定します。吸引後の各ウェルに4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを除去した後、DPBSで2回洗浄し、さらに各ウェルに1 mLの新鮮なDPBSを加えます。これらの画像は、マウスの角化細胞または線維芽細胞のいずれから分泌された血管新生因子が、管腔形成を誘導できることを示しています。時間の経過とともに、内皮細胞は移動し、播種から1〜2時間で小さな分枝を形成し始めます。管腔形成は4〜6時間で最大に達しました。24時間までには一部の分枝は残っていましたが、多くの細胞がアポトーシスを起こし、管腔の断裂が始まりました。細胞数は管腔形成に多大な影響を及ぼします。播種した細胞数が不十分な場合は、形成される管腔が少なくネットワークも最小限となりますが、播種数を増やすにつれて、管腔ネットワークはより広範になります。しかし、濃度が高すぎると、細胞が凝集したり単層を形成したりし始め、処置群間の差が不明瞭になります。十分な管腔形成を確実にするため、細胞は少なくとも2代的に継代させておく必要があります。B 11の3つの増殖速度は非常に速いため、25%の細胞を継代すれば、翌日にはフラスコ内でコンフルエントになります。ここでは、Image Jの血管新生プラグインを使用して、カルシネオAM染色したチューブネットワークの全ノード数、メッシュ内のチューブ数、およびネットワーク上の融合点を検出します。さらに、このプログラムを使用して、ノード、チューブ、またはメッシュを個別に検出し、定量化することが可能です。このビデオを視聴することで、一般的な落とし穴を避けながら、迅速かつ信頼性の高い方法でin vitro血管新生アッセイを実施する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。...

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

ここでは、ゲル化基マトリックス上のチューブ形成アッセイを用いて、ルタ・グラボレンズの水抽出物が血管ネットワーク形成に及ぼす影響を評価する。...

血管新生に対する天然物の影響を評価するHUVECチューブ形成アッセイ

この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。...

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

ここで提示されるゼブラフィッシュおよび管形成アッセイにおけるその際の全実装RNAハイブリダイゼーション分析のためのプロトコルは、血管形成におけるエンドグリンの役割を研究する患者由来の誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞におけるアッセイである。...

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

本プロトコルは、栄養膜細胞などの細胞が細胞外基底膜マトリックスの層上に毛細血管様構造に組織化する古典的な in vitro...

分化マーカー発現解析のための血管新生チューブ形成アッセイからの栄養膜細胞回収

学ぼう、内皮細胞を用いたチューブ形成アッセイによる血管新生の定量的解析法。蛍光顕微鏡でネットワークを可視化し、専用プログラムで定量化する迅速な手法です。

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

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