細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

この手順の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して植物組織の機械的特性をマッピングすることです。まず、スライド板のエッチング領域に低融点のアロスの液滴をピペッティングしてスライドガラスを調製し、薄いアロス膜を形成します。2番目のステップは、サンプルを解剖してマウントすることです。

茎から花のつぼみを取り除き、マリスの茎を茎から切り離し、すぐにガラスの薄いアグロスフィルムに切り取ったミーステムを埋め込みます。次にスライドさせ、マリスステムがアロスフィルムに埋め込まれたときに生じた亀裂を埋めるために、十分に溶けたマウンティングアグロスを追加します。最後のステップは、データ収集用の原子間力顕微鏡をセットアップすることです。

最終的に、細胞壁の見かけのヤング率のデータ分析と測定により、細胞内分解能および組織領域全体にわたる細胞壁の特性の機械的マップが生成されます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、細胞壁の機械的特性を細胞内分解能と組織全領域で同時に測定できることです。サンプルを包埋するためのAros培地は、0.7%の低融点から調製され、arosは水中の10%マンニトールに含まれています。

ドリルチップなどの強力な金属器具を使用して、顕微鏡ガラスの中央にある0.5×0.5cmの領域をエッチングします。スライドさせると、アグロスの接着が容易になり、アグロス媒体がスライドに付着または固定されるように、表面が粗くなります。スライドガラスのエッチング領域に約20マイクロリットルの埋め込みアグロス媒体のピペダ液滴。

これにより、アグロの薄膜が生成されます。スライドガラスを湿った箱に保管し、Agros培地がシロイヌナズナのサンプルを固めるのを待ちます。Anaは、分裂組織サンプルを調製するための原子間力顕微鏡法に使用されます。

花のつぼみを極細ピンセットで引き下げて、茎から1つずつ取り除きます。P one stage primorとして知られる後遺症を示さない芽まで、すべての花のつぼみを取り除くことが重要です。カミソリの刃またはピンセットの先端を使用して、分裂組織を茎から切り離します。

カットは、原子間力顕微鏡またはFMで測定する分裂組織表面の領域と平行である必要があります。得られた頂点は、実験中に崩れないように、300ミクロンから600ミクロンの高さである必要があります。すぐに頂点を前に準備したaros媒体の薄膜に押し込みます。スライドガラスまたはアロス上の位置を選択し、分裂組織がスライドガラスに直接接触し、アロスから突き出るように静かに押します。

アグロスは圧力を加えると骨折するため、マリステムは亀裂の中に立っています。マリットステムをステムからのカットに続く数秒以内にアロスに配置することが重要です。これにより、MAステムの乾燥を防ぎます。

この方法で複数のMAステムをバッチイメージング用に調製することができますが、それらは同じ高さで、互いに500ミクロン未満に配置されている場合に限ります。スライド上で、準備したmaステムを湿った箱に入れたまま、さらにサンプルを解剖します。次のステップに進む前に、濾紙を使用して、分裂組織と花のつぼみの境界にある余分な水分をやさしく取り除きます。

これは、溶けたアグロスが毛細管現象によってサンプルに氾濫するのを防ぐためです。後で十分に溶けた取り付けアグロスで20マイクロリットルのピペットで以前に作成された亀裂を埋め、各分裂組織を囲むために、アロスは、除去された花のつぼみまたは原形ジムの傷跡のレベルに達する必要があります。これを達成するためには、亀裂の両端にアグロスを追加する必要がある場合があります。

アグロスを追加すると、すぐに亀裂に溢れます。ピペットを使用して、溶けた取り付けアグロの一部を吸引し、meステムがスライドの最高点になるようにします。これにより、meステムが固定され、根やハイポコドルのイメージング中に動けなくなります。

アグロスの薄膜を解剖する必要はありません。準備したスライドガラス上で、マイクロピンセットを使用して、ガラスのエッチングの真上またはガラスラメラに沿って溝を作り、この溝に根元またはハイポコドルを配置し、保持長に沿ってガラスと接触していることを確認します。meステムサンプルで示したのと同じ方法で、サンプルの周囲に溶融したマウンティングアグロスを追加します。

JP PKナノウィザード。このデモンストレーションではFMを使用しています。この手順を開始するには、丸い形のインデンチャーを備えたカンチレバーをAFMに取り付けます。半径は、X、Y、Zの解像度と、正確な測定をアーカイブできるインデントの深さを決定します。

表皮表面でメソからナノスケールの測定を行うには、半径50ナノメートルの丸い年季奉公を使用します。メソスケール測定を行うには、半径0.5ミクロンの丸い年季奉公を使用し、2〜3個のセルでマイクロスケール測定を行うには、半径2.5ミクロンの丸型年季奉公を使用して、レーザーをカンチレバーの先端に配置します。ミラーを使用して、レーザーをキャプターの中央に合わせます。

A FMアプローチの下にきれいなガラスを置き、目標を1ボルトに設定し、分光法を選択します。インデントを実行するには、最大相対設定値を 2 ボルトに、伸長速度を毎秒 40 ミクロンに、Z 長を 5 ミクロンに設定します。キャリブレーションマネージャーメニューから、感度に適合するフォワードカーブの線形部分を選択します。

Select Fit Rangeボタンを使用して、相対的な設定値を200マイクロリットルの10%マニトール溶液でvolからmに変換する必要があります。カンチレバーの先端の下で、ミラーを使用してレーザーをキャプターの中央に再調整し、リスペクサを動かして、キャリブレーションマネージャーメニューから感度を再調整します。不明なボタンをクリックし、4つの分光法を選択し、前に示したようにインデントを実行します。

この手順を開始するには、Select fit rangeボタンを使用して感度に適合するように前方曲線の線形部分を選択し、マウントされたサンプルをA FMの下に配置して、サンプルに500マイクロリットルの10%マニトール溶液の液滴を追加します。マニトール溶液は、数分以内に細胞をプラズマ化し、200ナノニュートンの相対設定値でへこみ、毎秒40ミクロンの速度と5ミクロンのZ長さを延長する20ナノニュートンの目標でアプローチします。200ナノメートルのマウントされたカンチレバーの場合は100ナノメートル、1ミクロンの場合は0.5ミクロンのインデントを得るために、相対的な設定値を調整します。

5ミクロンのマウントカンチレバーフォースマッピングモード。ハイポコスの場合は70 x 70ミクロン、64 x 64の解像度でマーステムをスキャンする領域、64 x 64の解像度で100 x 100ミクロンの根をスキャンする領域を選択します。scan を押して実験を開始し、出力を保存します。

まず、データ解析ソフトウェアでデータファイルを開きます。次に、バッチ処理を選択します。1 つのマップのすべての曲線に同じ解析を適用する。

カンチレバーの曲げの高さを補正して、押し込み深さを抽出します。ヤング率フィット関数を選択します。これは、力がくぼみの領域に比例すると仮定します。

先端の形状を放物線に設定して、くぼみの形状が放物線であると仮定します。先端の半径を示します。次に、解析のリトラクト曲線を選択します。

リトラクト カーブは、トポグラフィーの影響を受けにくいため、xtend カーブよりも優先されます。ポソ比を 0.5 に設定します。最後に、を押して分析し、出力を保存します。

花の火星の茎、老いも若きも、ハイポコドル、根のMAの茎の典型的なA FMの若いモジュラーマップは、すべての実験でここに示されています。年季奉公は半球形ですが、その半径が異なるため、さまざまな空間分解能を実現できます。これらのマップは、半径50ナノメートル、深さ50ナノメートルのくぼみを持つメソからナノスケールの年季奉公の典型的な結果を示しています。

心電計は、低胴体表皮細胞の表面細胞壁におけるマイクロスケールの不均一性を明らかにします。また、花の分裂組織、ハイポコドル、および根の半径500ナノメートルの深さのくぼみを持つ半径500ナノメートルのメソスケール年季奉公の典型的な結果も示されています。半径2.5ミクロン、深さ500ナノメートルのくぼみを持つマイクロスケールの年季奉公用のこの心電計は、目に見える成長に先立つ臓器開始時の組織の軟化を明らかにしました。

ただし、サンプルの高さの範囲がA FMの最大Z範囲を超えたため、このスキャンは中止されました。不適切な固定による実験中のサンプルの動きは、ここに示すようにスキャンがぼやける可能性があります。アグロスで覆われている領域も、この例に示すように適切に測定することはできません。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行すれば1時間で完了できます。