Name: 細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた植物組織の細胞壁弾性特性マッピング法。メソスケールで成長と形態形成に関連する機械的変化を記録し、細胞壁のヤング率を測定して組織全体の力学マップを生成する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、多くの有用な議論のためにイヴCouderに特別な感謝を与える。私たちは、カンチレバーと議論のキャリブレーションのためのアテフAsnaciosに感謝します。我々は重要な読書のためにリサ·ウィリス、エリオットマイヤーウィッツ、そしてオリバーHamantに感謝します。この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムグラントRGP0062/2005-Cによって部分的に資金を供給された。通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュは&#39;&#39;&#39;&#39; Growpec、&#39;&#39;と&#39;&#39; Mechastemを投影する。

1。試料載用ガラススライドを準備<ol><li>アガロースメディアを埋め込む準備：10％マンニトール（水中）での0.7％低融点アガロースを。 </li><li>強力な金属器具（ 例えばドリル先端、ライム）を使用して、顕微鏡スライドガラスの中央にある0.5×0.5センチメートルの領域をエッチングする。またはその代わりに、アラルダイト接着剤を使用してスライドガラスにガラスラメラ（約20×200ミクロン）の小片を接着します。注：これはスライドにアガロースメディアスティックまたは修正のことを確認するためにアガロースの付着を容易にするために、表面を粗くする。このスライドは、再利用することができます。 </li><li>スライドガラスのエッチングされた領域の上にアガロースメディアを埋め込む約20μlの液滴を配置します。これは、アガロースの薄膜を提供します。 </li><li>湿度の高いボックス内のガラススライドを保存し、アガロースメディアが固化するのを待ちます。 </li></ol> 2。分裂組織のサンプルを解剖し、取付<ol><li>共焦点想像力のための顕微解剖分裂組織NG：超微細ピンセットでそれらを引いて、茎から花芽を一つずつ削除してください。それは、がく片（ すなわち 、P1の原基14）を示さない芽までのすべての花芽を除去することが重要である。 </li><li>かみそりの刃やピンセットの先端を使って、離れて茎から分裂組織をカット。カットはAFMを用いて測定される分裂組織表面の領域に平行であるべきである。得られた頂点は300ミクロンとAFMチップの下に収まるように高さ600μmの間であるべきである。 </li><li>ステップ1.1.4で調製したアガロースメディアのフィルムに頂点を押し込みます。ガラススライド/アガロース上の位置を選択し、分裂組織は、スライドガラスに接触して、直接的であり、アガロースから突出するようなゆっくりと押し込みます。これは、茎からのカットに従って数秒以内にアガロース中分裂組織を配置することが重要である。注：これは、分裂組織からの乾燥を防止するためである。この段階では、分裂組織は、CRACに立ってされますアガロースは、圧力を加えると破断のでkである。 </li><li>彼らは同じ高さのものであり、スライドに互いに500μm未満に位置していることを条件に、バッチ画像化のために、いくつかの分裂組織をこのように準備します。さらにサンプルを解剖しながら、湿度の高いボックスで作成分裂組織を維持する。 注：キャリブレーションからの変化を制限します。各条件の理想的に2サンプルを調製し、無作為に測定することができる。これまでの測定（ストレス誘発性応答）上のバッチ·イメージングの無影響はありません。これは、寒天および/または取り付け、溶液中のストレスシグナル伝達分子の希釈のおかげである可能性があります。代わりにストレス応答に関係なく、用意されたサンプルの量に同じです。 </li><li>次のステップに移る前に、分裂組織及び花芽の境界が乾燥していることを確認してください。そうでない場合、穏やかに濾紙を用いて余分な水分を除去する。これは溶け、次のステージに防ぐ必要がありますアガロース毛管力によるサンプルをフラッディングします。 </li><li> 20μlのピペットを用いて、ステップ1.2.3で作成した亀裂を埋めるために、アガロース取り付け溶融十分を追加します。各分裂組織を取り囲むように。アガロースは、削除された花芽（原基）の瘢痕のレベルに達する必要があります。これを達成するためには、亀裂の各端部にアガロースを添加する必要があり得る。 </li><li>アガロースを添加する場合、それはすぐにクラック内にフラッディングし;ピペットを用いて、溶融分裂組織がスライド上の最高点であることを保証するために、アガロースマウントの一部を吸う。それは撮像中に移動できないようにするためには、成長点が修正されています。 </li></ol> 3。取付ルートまたは胚軸サンプル<ol><li>根と胚軸の場合は、何解剖は必要ありません。準備されたスライドガラス上のアガロースの薄膜では、直接ガラスエッチングの上やガラスラメラに沿っていずれかの溝を作る。それが接触していることを保証する、この溝のルートや胚軸を置きその全長に沿ってガラス。 </li><li>次のステップに進む前に、サンプルがその表面に乾燥していることを確認してください。そうでない場合は、ゆっくりと、ろ紙を用いて水の過剰を取り除く。 </li><li>追加ステップ1.2.6のように、試料周辺のアガロース取り付け溶融。 </li></ol> 4。原子間力顕微鏡の準備と感度校正（JPK Nanowizard AFM用） <ol><li> AFMにカンチレバーをマウントします。カンチレバーは丸い形の圧子を装着しなければならない。半径のx、y、zの分解能と正確な測定をアーカイブすることができた時の押し込み深さを決定する。 <ol><li>表皮の表面にメソスケールの測定を行うために、半径50nmの丸い圧子を使用します。メソスケールの測定値を取るために、0.5μmの半径ラウンド圧子を使用します。 （2-3セル間）マイクロスケールの測定値を取るために、2.5μmの半径ラウンド圧子を使用しています。 </li></ol></li><li>カンチレバーの先端にレーザーを配置します。中央にレーザーの位置を合わせますミラーを用いキャプターの。 </li><li>原子間力顕微鏡の下にきれいなガラスを配置します。 注：以下は、カンチレバーの変形に原子間力顕微鏡の受容体上のレーザー位置の信号を変換するように設定して、カンチレバーのバネ定数を評価することによって、力に翻訳することです。 </li><li> 1 Vの目標力」セットポイント」とアプローチ</li><li> 「力分光法」を選択します。 2 Vまで最大「相対セットポイント」を設定することで、インデントを行い、40ミクロ​​ン/秒に「スピードを引き出す」、および5μmで「Z長」。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「フィット範囲を選択」ボタンを使用して感度に合わせて前進曲線の直線部分を選択します。 「相対セットポイント」は、「メートル」に「ボルト」から変換する必要があります。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、ELを評価するために、「ばね定数」を選択熱揺らぎを利用しカンチレバーのasticity。カンチレバーのスペクトル密度プロットを取得するために押して「ファイル名を指定して実行」。最も低い周波数で共振ピークを見つける。 「フィット範囲を選択」ボタンを使用して、それに合う。 注1：熱変動のチューニングの詳細については、Cook ら 15を読む 注2：これは、（既知の剛性を有する材料または）基準カンチレバーを用いてカンチレバーの弾力性を評価するために直接法を用いることが好ましい。ここで使用する1は親切にアテフAsnacios 16から寄贈された。 </li><li>カンチレバー先端の下で10％マンニトール溶液200μlを加える。ミラーを用いた捕獲の中央にレーザーを再調整。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「不明」ボタンをクリックしてください。：感度を再調整繰り返します2.5に至るまで2.3を繰り返します。 </li></ol> 5データ収集：見かけのヤング率地図作成<ol&gt; <li>原子間力顕微鏡の下に取り付けられた試料を置き、試料上に10％のマンニトール溶液500μl滴を追加します。マンニトール溶液は数分以内に細胞をplasmolyzes。 </li><li> 20 NNの目標力（「設定値」）とのアプローチ（「セットポイント」は3 V以上にはなりません） </li><li> 200 NNの「相対的なセットポイント」とインデントは、40ミクロ​​ン/秒の「速度を引き出す」、および5μmの「Z長」。 </li><li>カンチレバーマウントまたは1ミクロン/ 5以下のため0.5μmのカンチレバーを搭載し200nmで、100ナノメートルのインデントを得るためには、「相対的なセットポイント」を調整してください。 </li><li> ;分裂組織に、解像度64×64の（「ピクセル」）と70ミクロンX 70ミクロン：「強制マッピング」モードでは、スキャンする地域を選択胚軸と根のため、64×64の解像度を持つ100ミクロン×100ミクロン。 </li><li>を押して、実験を起動するためにスキャンします。出力を保存します。 </李&gt; </ol> 6データ解析：見かけのヤング率の計算<ol><li>データ解析ソフトウェアにデータファイルを開きます。 </li><li>単一のマップのすべての曲線に同じ分析を適用するために、「バッチ処理」を選択します。 </li><li>その押し込み深さを抽出する &quot;カンチレバーの曲げのための高さを修正する」を選択します。 </li><li>力はインデントの面積に比例すると仮定します &quot;ヤングフィット関数」を選択します。インデントの形状が放物線であることを前提とする放物線する「先端形状」を設定します。 </li><li>先端の半径を示している。 </li><li>それは、 &quot;拡張&quot;曲線よりも地形の影響を受けにくいため、優先的に分析するため、「後退」曲線を選択します。プローブの重要な固着が中に存在する場合は、「後退、「固着の影響を受けない「延長」曲線を使用しています。 </li><li>セット0.5ポアソン比。出力を分析し、保存を押します。 </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

植物では、変化する機械的特性は、成長や形態形成を演出に大きな役割を果たしている。これまでに存在し、植物の成長を制御する遺伝的および化学的なネットワークの解明に大きな進歩であったが、これらのネットワークはに貢献し、機械的性質の変化によってどのような影響を受けるかについての我々の知識は、初歩的でもあります。このメソッドは、このギャップを埋めるために私たちを有効にする必要があり、そしてそれは、植物の成長や形態形成のあらゆる側面を研究する科学者への強い関心があるはずです。我々は今、課題や制限法の、そして今後の展望をまとめた。 プロトコルの中で最も困難なステップは、サンプル調製である。サンプルでは、​​しっかりとアガロースでガラススライドに固定されている必要がありますが、このアガロースは、測定すべきであるサンプルの任意の領域をカバーしてはならない。微妙に乾燥を防止しするように、組織の損傷を防止するようにさらに準備が（数分以内）に十分迅速に完了されなければならない：創傷ndは干ばつ、セル壁18の機械的特性の不可逆的変化をもたらすと予測される。別の挑戦的な工程は、適切なAF...

植物における成長は、各々を取り囲む硬質細胞壁の協調膨張および生物のあらゆる細胞によって達成される。証拠が蓄積することは、植物が局所的にこの膨張を制御すること、細胞壁の化学的性質の改変によるものであることを示している。膨張は、細胞の高い膨圧によって引き起こされる、セル壁に株によって主に駆動されると考えられている;膨圧この歪み応答は、細胞壁1の機械的特性によって支配される。少しは、これらの機械的特性が知られており、それらは開発中にどのように変化するか。さらには、これらの小さな機械的特性を制御する方法で明らかにし、この組織を横切って調整されるようにして細胞壁の化学的性質を変化させるために貢献するかどうかは知られている。我々は、開発中に、植物細胞壁中の化学的および機械的変化との間の接続を理解することであり、これらの微視的な相互作用は、プラントを管理する場合には、最終的にどのようにの巨視的成長、細胞または組織スケールでの臓器の開発における細胞壁の機械的特性を監視することができる方法が必要とされる。 原子間力顕微鏡（AFM）マイクロメートルまたはナノメートルの組織の圧迫又はくぼみに基づいてここで説明する方法は、正確に細胞下解像度で同時に臓器の開発に組織の全領域にわたって細胞壁の機械的特性を測定するために開発された。伸びは、ミリメートルスケール2-4における全組織の平均的な機械的特性を測定することができるだけであり、例えばにおける初期事象を測定するには大きすぎる規模：他の方法が低すぎたり高すぎる解像度のいずれかを有する器官形成; microindenterは、ナノメートルスケールでの細胞内の分解能で測定を行うことができますが、単離した細胞ではない細胞または器官5-7のグループの測定に限定されている。 AFMで、必要とするdは、組織、細胞、および細胞下解像度は8-10達成することができる。最近、いくつかのプロトコルはまた、11、12を用いることができる植物組織の力学を測定するために特別に開発されてきた。 私たちは、見かけのヤング率13の測定により組織の弾力性を評価する方法をここに紹介します。 ヤング率は、一般に材料の剛性を説明するために使用される。微小変形中に材料を変形させるのに必要な力は、くぼみの面積に比例する。ヤング率は、この係数である。連続均質な材料の場合には同一の係数に関係なくインデントの種類（サイズと形状）の測定されますが、測定の速度で変化します。植物組織の複雑な構造の場合、我々はこれまで力判定を可能にする変形に比例することを観察した我々は「見かけヤング &quot;という名前を比例係数。植物中の連続メディアからこれとは対照的に、この見かけヤング率は、インデントの大きさに敏感である。それは、純粋な細胞壁の若いモジュラスに対応していない。それは最高の組織の細胞壁の足場の弾力性を説明しています。

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>すべての3世代は、同じプレファーメンテーションで作業を行うことができます。</td></tr><tr><td>AFMステージ</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>低トポグラフィー(11 &micro;フォーススキャン領域の最低点と最高点の間のm)。</td></tr><tr><td>AFM光学系</td><td>JPK</td><td>トップビュー光学系</td><td>サンプルを位置決めするために非常に重要です。長距離双眼鏡や顕微鏡に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M125</td><td>どんなタイプの実体顕微鏡でも大丈夫です。</td></tr><tr><td>150nmマウントカンチレバー</td><td>ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス</td><td>R150-NCL-10</td><td>表皮の表面の細胞壁のみを測定するために使用します。</td></tr><tr><td>1 &マイクロ;m マウントカンチレバー</td><td>ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>表皮の表面に直交する細胞壁の力学を測定する。</td></tr><tr><td>チップレスカンチレバー</td><td>ナノセンサー Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 ヌーシャテル、スイス</td><td>TL-NCH-20</td><td>組織の局所力学を測定するには (2-3 セル幅) 5 & micro;mはカンチレバーを取り付けました。5 & micro;mホウケイ酸ビーズからチップレスカンチレバーまで。</td></tr><tr><td>5 &マイクロ;m シリコン マイクロスフェア</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, France</td><td></td><td>Araldite ビーズをチップレスカンチレバーに固定します。</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィックフェアローン、ニュージャージー州 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176;C ゲル化温度</td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Stainless Steel No. 5 Tweezers</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

細胞壁の弾性特性のafmベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

我々は、JPK AFMのために、原子間力顕微鏡（AFM）マイクロ/ナノくぼみを用いて植物組織の表面の機械的特性を測定するために、最近開発された方法を記載している。具体的には、このプロトコルでは、我々は花の分裂組織、胚軸および根×100ミクロンまで100μmの地域間で細胞内の解像度で細胞壁の見かけのヤング率を測定します。これは、サンプルの慎重な準備、マイクロ圧子とインデントの深さを正確に選択する必要があります。唯一の細胞壁の特性を考慮して、測定は、細胞を原形質分離を起こさせる、従って、細胞膨圧の寄与を除去するために、マンニトールの高濃度溶液中で行われる。 他の現存の技術とは対照的に、別の圧子の押し込み深さとを用いて、この方法は、マルチスケール同時測定を可能にする<em&gt;細胞下解像度で組織を含む細胞の数百横切って、すなわち。これは、空間的時間的に増殖および分化と相関することが、これらの変更を可能にする、開発中に、細胞壁の機械的特性で起こる変化を特徴付けることが可能であることを意味する。これは協調顕微鏡的細胞変化が巨視的形態形成のイベントをもたらすかを理解するために重要なステップを表します。 しかし、いくつかの制限が残っているこの方法はかなり小さな試料（直径100ミクロン程度）にして、外部の組織にのみ使用することができます。方法は、組織地形の影響を受けやすいです。それは、組織の複雑な機械的特性のみ特定の側面を測定します。技術が急速に開発されており、これらの制限のほとんどは、近い将来に解決される可能性がある。

図1において、我々は花の分裂組織（ 図1Aおよび1B）、老いも若きも胚軸（ 図1C-F）、および根分裂組織（ 図1G及び1H）の代表的なヤングモジュラスマップを提示する。全ての実験において圧子は、半球状であるが、異なる空間解像度が達成できるように、その半径が異なり1Cおよび1Dは、メソスケール-ナノスケールのくぼみ（50 nmの深さ）を有するメソスケール-ナノスケール圧子（50 nmの半径）の典型的な結果を示す。 cartographsは胚軸の表皮細胞の表面細胞壁中のマイクロスケールの不均一性を明らかに図1A、1E、および1Gは花の分裂組織、胚軸、根のためのメソスケールのくぼみ（500 nmの深さ）とメソスケール圧子（500 nmの半径）の典型的な結果を示している。;...

原子間力顕微鏡(AFM)を使用して植物組織の機械的特性をマッピングする方法を記述します。私たちは、広視野メソスケールで植物の発生過程で細胞壁に起こる力学的変化をいかに記録し、これらの変化を成長や形態形成と相関させるかに焦点を当てています。

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

本手順の全体的な目的は、原子間力顕微鏡を用いて植物組織の機械的特性をマッピングすることです。まず、スライドのエッチング領域に低融点arosを1滴ピペッティングし、薄いarosフィルムを形成させることでガラススライドを準備します。次のステップは、サンプルの切断および固定です。茎から花芽を取り除き、マリス茎を切り離します。切り出したマリス茎を、ガラス上の薄いAgrosフィルムに直ちに埋め込みます。次に、マリス茎をAgrosフィルムに埋め込んだ際に生じた隙間を埋めるのに十分な量の溶融マウンティングAgrosを加えます。最後のステップは、データ収集のために原子間力顕微鏡をセットアップすることです。最終的に、データ解析および細胞壁の見かけのヤング率の測定により、細胞下解像度での詳細な特性と組織全体の領域における特性を同時に示した、細胞壁特性のメカニカルマップが作成されます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、細胞下解像度での測定と組織全体の領域における測定を同時に行い、細胞壁の機械的特性を評価できる点にあります。試料埋没用のAros培地は、10%マンニトール水溶液中の0.7%低融点Arosを用いて調製します。ドリルチップなどの強固な金属器具を用いて、顕微鏡用スライドガラスの中央に0.5 by 0.5 centimeterの領域をエッチングします。これにより表面を粗化させ、アガロース培地がスライドに付着または固定されやすくします。エッチングした領域に、約20 microlitersの埋め込み用アガロース培地をピペットで滴下します。これにより、Agrosの薄膜が形成されます。ガラススライドを湿潤箱に保管し、Agros培地が凝固するまで待ち、Arabidopsisのサンプルを採取します。メリステムサンプルの作製には、原子間力顕微鏡（AFM）が使用されます。超極細ピンセットで下方向に引っぱり、花芽を茎から一つずつ取り除きます。P1ステージの原基（primord）として知られる、後続の構造を示さない芽まで、すべての花芽を取り除くことが重要です。カミソリの刃またはピンセットの先を使用して、茎から分裂組織を切り離します。切断は、原子間力顕微鏡（AFM）またはFMで測定する分裂組織表面の領域に対して平行に行います。得られた頂端部の高さは、実験中に崩れないよう300 µmから600 µmの間になるようにしてください。切断後すぐに、あらかじめ準備しておいたアロス（aros）培地の薄膜に頂端部を押し込みます。ガラススライドまたはアロス上の位置を選択し、分裂組織がガラススライドに直接接触し、かつアロスから突出するように、ゆっくりと押し込んでください。圧力をかけるとアグロスが割れるため、マリ茎が亀裂の中に直立した状態になります。茎から切り離した後、数秒以内にマリ茎をアロス内に配置することが極めて重要です。これにより、MA茎の乾燥を防ぐことができます。この方法で複数のMA茎を準備してバッチイメージングを行うことができます。ただし、それらが同じ高さであり、互いの距離が500 µm未満である必要があります。スライド上の準備済みMA茎は、さらにサンプルを解剖している間、加湿ボックスに入れて保持してください。次のステップに進む前に、フィルターペーパーを使用して、分裂組織と花芽の境界にある余分な水分をそっと取り除いてください。これは、毛細管現象によって溶けたアガロースが試料に浸入することを防ぐためです。その後、20 µL ピペットを用いて、先に作成した裂け目を埋め、各分裂組織を囲むのに十分な量の溶けた封入用アガロースを加えます。アガロースは、除去した花芽または原基の痕跡の高さまで到達させる必要があります。これを達成するために、裂け目の両端にアガロースを追加する必要がある場合があります。アグロスを加えると、すぐに隙間に流れ込みます。ピペットを使用して溶けた封入用アグロスの一部を吸引し、ME茎がスライド上の最高点になるように調整します。これによりME茎が固定され、根や下胚軸のイメージング中に動かなくなります。アガロスの薄膜では、解剖を行う必要はありません。準備したガラススライド上で、マイクロピンセットを用いて、ガラスのエッチング箇所の上方またはガラスラメラの位置に沿って溝を作ります。根または下胚軸をこの溝に配置し、全長にわたってガラスに接触していることを確認してください。茎のサンプルで示した方法と同様に、サンプルの周囲に溶融した封入用アガロスを添加します。JP PKナノウィザードです。本デモンストレーションではAFMを使用します。この手順を開始するために、先端に球状のインデントを持つカンチレバーをAFMに取り付けます。この半径によって、X、Y、Z分解能および正確な測定が達成可能な押し込み深さが決定されます。表皮表面でメソスケールからナノスケールの測定を行うには、半径50 nanometerのラウンドインデンターを使用します。メソスケールの測定には半径0.5 micronのラウンドインデンターを、2〜3個の細胞にわたるマイクロスケールの測定には半径2.5 micronのラウンドインデンターを使用し、レーザーをカンチレバーの先端に配置します。ミラーを使用して、レーザーをキャプチャの中央に合わせます。クリーンなガラスを AFM アプローチの下に配置し、セットポイントのターゲットを 1 volt に設定して、分光法（spectroscopy）を選択します。最大相対セットポイントを 2 volts、伸展速度を 40 microns per second、Z 長を 5 microns に設定して、インデンテーションを行います。キャリブレーションマネージャーメニューから、フォワード曲線の線形部分を選択して感度をフィッティングさせます。「select fit range」ボタンを使用して、相対設定値をvolからmeterに変換します（10%マンニトール溶液 200 µLにおいて）。カンチレバーチップの下で、ミラーを用いてレーザーをキャプチャーの中央に再合わせし、リスペクターを移動させて「calibration manager」メニューから感度を再校正します。「unknown」ボタンをクリックし、「four spectroscopy」を選択し、前述の通りにインデンテーションを行います。この手順を開始するには、「select fit range」ボタンを使用して、感度をフィッティングさせるためのフォワードカーブの線形部分を選択します。マウントしたサンプルをAFMの下に配置し、サンプルの上に10%マンニトール溶液を500 µL滴下します。マンニトール溶液により、細胞は数分以内にプラズマ状態になります。ターゲットのセットポイントを20 nN、相対セットポイントを200 nN、接近速度を40 µm/s、Z長を5 µmに設定してアプローチします。200 nmのマウントされたカンチレバーの場合は100 nmの、1 µmの場合は0.5 µmの押し込み量を得られるよう、相対セットポイントを調整してください。5 µmのカンチレバーを装着し、フォースマッピングモードに設定します。スキャン領域を選択し、mar stemsは70 × 70 µm、解像度は64 × 64に設定します。hypo cosおよびrootsは100 × 100 µm、解像度は64 × 64に設定します。「scan」を押して実験を開始し、出力を保存してください。まず、データ解析ソフトウェアでデータファイルを開きます。次に、バッチ処理を選択します。これにより、単一マップ内のすべての曲線に同じ解析を適用できます。圧入深さを抽出するために、カンチレバーの撓みの高さを正しく選択してください。ヤング率のフィッティング関数を選択します。これにより、力は圧入面積に比例すると想定されます。圧入形状が放物線であると想定し、チップ形状をパラボリック（parabolic）に設定します。チップの半径を指定してください。次に、解析に使用するリトラクト曲線を選択します。リトラクト曲線は、トポグラフィーの影響を受けにくいため、エクステンド曲線よりも好まれます。poso比を0.5に設定してください。最後に、onを押して、出力を解析し、保存します。すべての実験における、Marsの花茎の若い個体および古い個体の下胚軸、および根のMAステムの典型的なAFMヤング率モジュラスマップをここに示します。インデンテーションは半球形ですが、異なる空間分解能を達成するために半径が異なります。これらのマップは、半径50 nanometer、深さ50 nanometerのインデンテーションを用いた、メゾスケールからナノスケールの典型的な結果を示しています。このカルディオグラフは、下胚軸表皮細胞の表面細胞壁におけるマイクロスケールの不均一性を明らかにしています。また、花原基、下胚軸、および根における、半径500 nm、深さ500 nmのメゾスケール圧痕の代表的な結果も示しています。半径2.5 µm、深さ500 nmのマイクロスケール圧痕を用いたこのカルディオグラフでは、可視的な成長に先立って、器官分化時に組織の軟化が起こることが明らかになりました。しかし、サンプルの高さの範囲がAFMの最大Z範囲を超えたため、このスキャンは中止されました。不適切な固定によって実験中にサンプルが移動すると、ここに示すようにスキャン結果がぼやけることがあります。また、この例で示されているように、アガーで覆われている領域は適切に測定することができません。習熟すれば、適切に実施することでこの手法は1時間で完了させることができます。

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞外マトリックスの剛性が強く、接着細胞の複数の動作に影響を与えます。マトリックスの剛性は、組織全体に空間的に変化し、様々な疾患状態の修正を受ける。ここでは、原子間力顕微鏡のmicroindentationを使用して、通常と線維化マウスの肺組織における剛性の空間的な変動を特徴付けるための方法を開発する。...

原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

本論文では、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、microindentationにより、生きた細胞の機械的性質を特徴づけるためのプロトコルを示しています。...

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

結晶性セルロースは、植物の細胞壁の重要な構成要素です。しかし、細胞分解能での定量化は技術的に困難です。...

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。...

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。...

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

ここで提示されるConpokal技術のプロトコルは、共焦点と原子間力顕微鏡を単一の器械のプラットホームに結合する。コンポカルは、同じ細胞、同じ領域、近くの同時共焦点イメージングおよび生きた生物学的サンプルの機械的特性を提供する。...

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

原子間力顕微鏡インデンテーションプロトコルは、正常または制約された成長中(すなわち、水不足下)の組織または器官の特定の細胞の細胞壁の物理的特性の役割を解剖する可能性を提供する。...

生きた シロイヌナ ズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡

細胞壁バイオメカニクスの研究は、植物の成長と形態形成を理解するために不可欠です。原子間力顕微鏡を用いて、若い植物器官の内部組織における薄い一次細胞壁を調べるために、以下のプロトコルが提案されている。...

原子間力顕微鏡を用いた生きた植物器官の初代細胞壁の力学特性評価

原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。...

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

このプロトコルは、マウス肺組織の凍結切片を調製する方法、原子間力顕微鏡の力マップ実験を行う方法、およびデータを分析してネイティブマウス肺基底膜のヤング率を決定する方法を視覚化します。...

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

学ぶ原子間力顕微鏡を用いた植物組織の細胞壁弾性特性マッピング法。メソスケールで成長と形態形成に関連する機械的変化を記録し、細胞壁のヤング率を測定して組織全体の力学マップを生成する技術です。

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

さらに動画を探す