培養細胞における細胞内および細胞外アスコルビン酸の定量のための迅速かつ特異的マイクロプレートアッセイ

次の実験の全体的な目標は、培養細胞または単離細胞の細胞内または細胞外のアスコルビン酸レベルを決定することです。これは、細胞抽出物または全細胞をスコアオキシダーゼとインキュベートして、後続のステップでスコアBAを選択的に枯渇させることによって達成されます。第1の方法では、細胞抽出物をシアン化物とインキュベートしてアスコルビン酸依存性でシアン化フェロを生成し、抽出物中のアスコルビン酸の量を直接表します。

次に、細胞抽出物中に形成されるシアン化フェロの量は、フェリス鉄を形成するためにフェロシアン化フェロシアン化フェロを添加して定量的に酸化することによって決定され、分光測光的に定量化できる発色性鉄2シダS複合体を生成する。第2の方法では、すべての細胞を鉄の2つのキレート剤であるシダSおよびクエン酸第二鉄と直接インキュベートします。結果は、検出可能な細胞外鉄錯体の定量的および特異的な減少に基づいて、細胞内または細胞外のアスコルビン酸レベルの違いを示しています。

スペクトロを計量的に。HBLCベースの検出のようにすでに実施されている方法に対する現在の技術の主な利点は、この非常に特異的なマイクロプレートアッセイを非常に迅速に実施でき、この手順を開始する前に、すべてのサンプルと標準を連続的にではなく並行して処理できることです。K 5 62懸濁細胞を培養し、細胞抽出物を含むスコアBAで作成します。

これに続いて、氷冷PBSに10ミリモルアスコルビン酸の原液を調製します。次に、ゼロから20マイクロモルまでの一連のアスコルビン酸標準を慎重に準備します。各標準から4つの100マイクロリットルアリコートを慎重に取り出し、ウェルの水平シーケンスに追加します。

PBSのウェルあたり25マイクロリットルまたはミリリットルあたり45.5単位を含む96ウェルの平底板。PBS中のLアスコルビン酸オキシダーゼまたはAOのストック溶液は、96ウェルプレートをホイルとオービタルで覆います。550 RPMで室温で5分間混合します。

終了したら、PBS中の50マイクロリットルの3.5ミリモルのフェリスシアン化カリウムをすべてのウェルに加え、以前と同じ条件を使用して96ウェルプレートを軌道混合した後、最終的なフェリスシアン化物濃度を1ミリモルにします。すぐに50%酢酸と30%トリクロロ酢酸を含む新しく構築された溶液の25マイクロリットルを追加します。次に、調製したばかりのファラオシアン化物測定溶液100マイクロリットルを各ウェル軌道に加えます。

プレートを暗所で550 RPMで室温で30分間混合します。次に、593ナノメートルでのウェルの吸光度値を読み取ります。アッセイを開始します。

まず、選択したウェルで細胞外アスコルビン酸を酸化し、ペアになったウェルに120単位/ミリリットルのAOまたはHBSDを50マイクロリットルを三重に添加して、最終的なAO濃度をミリリットルあたり10単位にします。このラベルに従って、ペアのウェルはマイナスAOとプラスAOになります。37°Cで5分間穏やかな軌道混合でプレートを混合した後、すべてのウェルに50マイクロリットルの2.4ミリモルのFerne Sを加えて、最終的なシダの濃度を200マイクロモルにし、上記のようにプレートを37°Cで5分間混合します。

次に、新たに調製した120マイクロモルのクエン酸第二鉄を50マイクロリットルすべてのウェルに加えて、それぞれ10マイクロモルの鉄と50マイクロモルのクエン酸塩の最終的な鉄とクエン酸塩の濃度を与えます。アスコルビン酸FLXアッセイの最後によく混合します。各ウェルから上にある培地を急速に吸引し、24ウェルプレートで適切に標識されたウェルに添加します。

これに続いて、上清の3マイクロリットルアリコートを96ウェルプレートに加えて、細胞外アスコルビン酸を測定します。マイクロプレート分光光度計で593ナノメートルのウェルの吸光度値を読み取ります。最後に、細胞外アスコルビン酸の量を、示されているミリグラムタンパク質あたりのmアスコルビン酸として計算します。

これは、アスコルビン酸標準品のセットの一般的な標準曲線であり、ウェルあたり0〜20マイクロモルまたは0〜2NMOアスコルビン酸です。96ウェルプレートのうち、ここには示されていませんが、直線性はウェルあたり最大8 NMOアスコルビン酸に維持され、これはサンプルのアスコルビン酸濃度が約80マイクロモルに相当します。このアッセイは、ウェルあたり0.25オールアスコルビン酸未満のアスコルビン酸レベルを正常に検出するために使用できます。

K 5 62細胞は、細胞外デヒドロLアスコルビン酸から細胞内アスコルビン酸を急速に蓄積しますが、アスコルビン酸は蓄積しません。この代表的な実験では、PBSで洗浄したK 5 62細胞を、アスコルビン酸デヒドロLアスコルビン酸デヒドロLアスコルビン酸と50マイクロモルの細胞Bアスコルビン酸と50マイクロモルのアスコルビン酸と5ミリモルシアン化物またはアスコルビン酸と50単位/ミリリットルAOのいずれかのPBSで37°Cで30分間インキュベートした。細胞内アスコルビン酸は、前述のように決定した。

K 5 62細胞によるデヒドロLアスコルビン酸の取り込みは、デヒドロLアスコルビン酸の取り込みにおける臀筋の関与を評価するために、促進的なグルコーストランスポーター臀筋媒介輸送によって発生します。この代表的な実験では、K 5 62細胞を、デヒドロLアスコルビン酸とインキュベートする前に、細胞Bまたはジヒドロ細胞Bの濃度を上げてインキュベートしました。細胞callin Bおよびジヒドロ細胞Bは両方ともマイクロモル濃度で運動過程を阻害するが、細胞callin Bだけを、単一の二重結合の存在によってジヒドロ細胞Bと異なり、低マイクロモル濃度で臀部依存性の輸送を阻害することに注意することが重要です。

したがって、デヒドロLとしては、アスコルビン酸の取り込みは、2.5マイクロモル未満のIC50では細胞Bにより阻害されたが、ジヒドロ細胞では阻害されなかった。Bデヒドロ。Lアスコルビン酸の取り込みは、おそらく臀筋を介した輸送によって発生します。.

あるいは、洗浄した細胞を、デヒドロLアスコルビン酸とのインキュベーション中に、輸送可能なが代謝不可能なグルコースアナログの3OメチルDグルコースまたは非グルート輸送可能なグルコースステレオ異性体Lグルコースの濃度の増加に曝露した。ここでも、細胞内アスコルビン酸蓄積の阻害は、グルート輸送可能なグルコース類似体の存在下でのみ起こるため、結果はデヒドロLアスコルビン酸の輸入にグルが関与していることを示しています。2番目のアッセイで。

培養細胞からのアスコルビン酸の排出速度を測定できます。細胞からのアスコルビン酸の放出は、アスコルビン酸が細胞による非トランスフェリン結合鉄の細胞内取り込みを調節するために重要であるように思われるため、この特定のアッセイは重要です。トランスフェリン結合性非鉄の取り込みは、ヘモクロマトーシスなどの鉄過剰症の病態生理学、ならびに哺乳類の脳における星状細胞ニューロンの鉄交換および恒常性に関連していると考えられています。

実際、主要な興奮性神経伝達物質Lグルタミン酸は、Lグルタミン酸、ガラスによる取り込み、そしておそらくGLT1とその後の細胞腫脹に依存して、推定VSOによるアスコルビン酸の放出を引き起こす方法で、星状細胞のアスコルビン酸の放出を引き起こします。類推すると、AスコアBをロードしたアストロサイトからのAスコアベイト放出は、興奮性アミノ酸Lアスパラギン酸によって刺激することができますが、非興奮性アミノ酸Lグルタミンによって刺激することはできません。この効果は、アスコルビン酸を負荷したマウス星状細胞の初代培養物からのアスパラギン酸およびグルタミンによるアスコルビン酸放出の刺激に対する用量応答曲線をここに示している。

この手法は、正しく実行すれば、わずか2時間で実行できます。