Name: DNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶ DNA架橋ポリアクリルアミドハイドゲルの調製法。細胞培養後に単鎖DNAを添加してゲル硬さを動的に制御し、細胞機能への基質硬さの影響を研究する。組織工学や再生医療への応用が期待される。

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作者は感謝したいと思います：博士フランク·江、デビッド·リン博士バーナードYurke博士ウダイChippadaをDNAゲル技術の開発に貢献するために、博士ノレルHadzimichalis、スミット·シャー、キンバリーピーターマン、ロバートArterこの原稿の彼らのコメントや編集をするため;脊髄研究に関するニュージャージー委員会（助成＃07A-019-SCR1、NAL）とニュージャージー神経科学研究所（MLP）を含む資金調達源; 図3を転載する許可を図2と図4およびバイオマテリアルを転載する許可のための組織工学のパブリッシャー、パートA。

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

細胞接着は、それらの細胞機能に対する動的な組織の剛性の役割を研究するための理想的なモデルとなる前と後の軟化または硬くするDNAゲルの能力。すべての3つの設計では、機械的および生物学的研究に使用されている。しかし、すべての3つのデザインは、架橋の長さはDNAゲル弾性（ 表2）影響を与えないことを示す、さまざまな架橋の割合で同様弾力性を持っている。これとは対照的に、アクリルアミド濃度は、弾力性に影響を与えます。これらの設計は、ゲル破裂傾向ので、架橋反応速度が異なっていてもよい、またはゲルの傾向がメディアやバッファに溶解するために、架橋長さの増加と共に減少する。しかし、DNAのゲル上の動態情報は限られているが、私たちは、架橋のさらに30％が二日、50％のDNAのゲルへのL2配信11の後に発生を知っていますか。それにもかかわらず、ゲルの軟化や補強から広大と収縮力の発生は、それぞれ、避けられないと切り離すことができません18,21。より多くのエネルギーがssDNAの18の三スタンド間で結合を形成する必要があるため50→100％ゲルは、わずか約0.0...

静的および動的な基板は、細胞機能に対する組織弾性または剛性の効果を研究するために開発された生体材料の二つのカテゴリーである。静的基板は、それらが製造された後、および/または細胞がプレーティングされれば、それらの物理的特性を変更することはできません。ポリアクリルアミド（PA）ゲルはメカノ調査5,17ために合成した第1の2次元、静的な基質であった。 PAゲルは、調製が容易で、安価で、多用途であり、弾性率​​の広い範囲で製造できる。これらの技術的利点は、PAが一般的に適用される基板をゲル化することが、静的な基質は、細胞外マトリックス（ECM）の動的な性質を示すものではないし、インビボで細胞環境を取り囲む。例えば、ECMは、傷害、開発、または疾患の結果としての剛性の変化を受ける。ダイナミック基板は、したがって、メカノ研究における組織模倣基質モデルとして好まれる<sup&gt; 22,24,25。 多数の合成は、天然の、二次元、三次元の、静的および動的な生体材料は、組織1,3,6,16,23,26剛性を模倣するために開発されている。いくつかの動的な基板は、それらの機械的特性2,4,7,8,12,15,16を変更するために、熱、紫外線、電流、イオン、pH変化が必要ですが、これらの刺激は、ヒドロゲルのバイオアプリケーションを制限することができます。 DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲル（DNAゲル）は、動的二次元弾性基質である。 DNAの架橋は、メディアへの一本鎖DNA（ssDNA）の添加によってDNAゲルの剛性の時間的、空間的、可逆変調のために許可または9-11,13,14,18,21バッファ 。刺激は弾力性の調節のために適用され、上記の動的なゲルとは異なり、DNAゲルは、弾力性の変化のために適用された一本鎖DNAの拡散に依存している。したがって、細胞を増殖さ上部ゲル表面は、レートoをので、変調された第1の領域であるF弾性変調はゲルの厚さに依存している。 DNAゲルは、しかしながら、ビス-アクリルアミド架橋はDNA（ 図1）からなる架橋で置き換えられ、それらはポリアクリルアミド骨格を有するという点で、それらのPAゲル対応物に類似している。二つのssDNA（SA1とSA2）は、ゲルのDNA架橋を補うために、架橋剤ストランド（L2）とハイブリダイズ。 SA1とSA2は、両方のPAネットワークへの効果的な取り込みのために、5 &#39;端にアクリダイト修正が含まれている明確な配列を有する。ゲル、SA1およびSA2の調製のために個別にPA主鎖に重合されると、その後、重合されたSA1およびSA2を一緒に混合する。 L2、架橋剤は、SA1およびSA2混合物に添加される。 L2の塩基配列は、両方SA1およびSA2配列に相補的であり、L2は、DNA架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズする。初期、DNAゲルの弾性は、L2濃度および架橋（ 表1の両方によって決定される</strong&gt;と2）。 SA1およびSA2は、（100％ゲルと呼ぶ）L2 100質量％架橋されているため、L2、SA1およびSA2の等しい化学量論量を含むDNAゲルは、硬いゲルである。 DNA架橋の低い割合でのL2結果のより低い濃度であり、したがって、よりソフトなDNAゲル。 （50％ゲルと呼ぶ）50％架橋された程度の低いゲルは9-11構築されている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> 図1：DNAゲル架橋およびuncrosslinking概略図9-11,13,14,18,21手順1：SA1（赤）とSA2（青）を個別にポリアクリルアミドバックボーン（黒）に重合される。重合後、SA1およびSA2重合溶液が一緒に混合される。ステップ2：L2（緑）を添加し、ゲルの架橋を形成するSA1プラスSA2とハイブリダイズされる。ステップ3：R2がtとハイブリダイズ彼は、L2の足掛かり。ステップ4：R2の足掛かりハイブリダイゼーションは、SA1とSA2からL2の解凍を推進。 PAゲルとは異なり、DNAゲルは、合成後に硬くかつ柔らかくすることができます。そのため、DNAのゲル上で増殖した細胞は、動剛性の変化に供することができる。細胞接着性ゲルを補強するために、L2は、架橋の割合を増加させるために低いパーセンテージのゲルの培養培地に添加することができる。細胞接着性ゲルを柔らかくするために、L2は、架橋10,13,21の割合を減少させるために除去することができる。 L2は、L2は、SA1およびSA2（ 表1）からuncrosslinkできるように、3 &#39;端に付加的な足掛かり配列を有する。 L2の除去は、R2と呼ばれる反転鎖のハイブリダイゼーションによって達成される。 R2はL2の全長に相補的であり、L2の足掛かりを最初にハイブリダイズする。足掛かりハイブリダイゼーションは架橋を排除し、ゲル剛性を減少させSA1とSA2からL2の解凍を推進する。 本報告ではとビデオは、段階的な手順は、DNAゲルを補強し、軟化させるの調製のために設けられている。 100％および80％ゲル製剤が記載されているが、このプロトコルは、他の初期および最終の架橋割合のDNAゲルを作成するために調整することができる。一般に、100％および80％ゲルを用意し、ガラスカバースリップ上に固定化、官能化、および細胞を播種。 L2は、80％ゲルの培地に添加され、R2は、100％のゲル、メッキの48時間後の培地に添加する。メディアへのR2の添加が80％架橋、100％ゲルを柔らかくし、一方メディアにL2の添加は、架橋された100％、80％ゲルを硬くする。剛化ゲルを80→100％ゲル軟化ゲルとして指定されているテキストで100→80％のゲルとして指定されている。制御または静的ゲル、ssDNAのためにTsとか​​ら成るかのように、100％および80％ゲルの別のセットに配信される。弾性変調次の二日間の最小限の後、細胞を処理し、分析することができる。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNAクロスリンク </td><td rowspan="2"> 塩基の数 </td><td> シーケンス（ 足掛かり ） </td><td rowspan="2"> 修飾 </td><td rowspan="2"> 融解温度（T mは 、°C） </td><td rowspan="2"> コメント </td></tr><tr><td> 5 &#39;→3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> デザイン1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>10 bpの足掛かりシーケンスが含まれています。 </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTGタグCGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2はL2に相補的である</td></tr><tr><td rowspan="4"> デザイン2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 46.​​9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> 12 bpの配列の足掛かりは含まれています。 </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2はL2に相補的である</td></tr><tr><td rowspan="3"> 療nは3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCTタグGGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;アクリダイト</td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td>足掛かりは含まれていません。 </td></tr><tr><td rowspan="2"> コントロール </td><td rowspan="2">コントロール</td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA（ など ）や</td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT（ その他 ） </td></tr></tbody></table>セルラーと機械の研究をd、いくつか利用している。のssDNA 9-11,13,14,18,21表1に塩基配列ifferent架橋設計は、静的および動的機械的特性の範囲を有するDNAゲルを生成する。架橋設計において変調パラメータは、塩基配列と、配列の長さまたは架橋の長さである。太字やイタリック体のフォントは、SA1とL2との間にそれぞれSA2とL2の間の塩基対形成を示している。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> デザイン </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> アクリルアミド濃度（％） </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1プラスL2にハイブリダイズSA2（％架橋） </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;強い&gt;弾力性（キロパスカル、平均±SEM） </td><td> 6.6±0.6 </td><td> 17.1±0.8 </td><td> 29.8±2.5 </td><td> 5.85±0.62 </td><td> 12.67±1.33 </td><td> 22.88±2.77 </td><td> 25.2±0.5 </td><td> 10.4±0.6 </td></tr></tbody></table> DNAゲルの表2ヤング率（E）9-11,13,14,18,21。アクリルアミド濃度、架橋の割合、および架橋の長さはDNAゲルに変調することができる。設計1,2、及び3は、それぞれ、20,28、および40 bpの架橋長さを有する。すべてのデザインのための100％のゲルは、ゲル弾性に影響を与えない架橋長さを示す類似の弾性率を持っている。しかし、アクリルアミド濃度のばらつきはDNAゲルの弾性を変化させる。

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (アイオワ州コーラルビル) idtdna.com</td><td></td><td>ssDNA をボルテックスしないでください。バイアルおよび/またはピペット溶液を穏やかに反転させて混合します。</td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウム</td><td></td><td></td>を含むPBS <td>任意のブランド。</td></tr><tr><td>100x Tris-EDTAバッファー(TEバッファー)</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントロイアス) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTAバッファー(TBEバッファー)</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントロイアス)</td><td>93290</td><td>TBEは生殖毒素です。</td></tr><tr><td>40%アクリルアミド溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルベニア州ピッツバーグ)</td><td>BP14021</td><td>アクリルアミドは毒素です。</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントロイアス)</td><td>A3678TE</td><td>バッファーに2%溶液を調製します。APSは毒素であり、刺激物です。</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントロイアス)</td><td>T9281</td><td>TEバッファーに20%溶液を調製します。TEMEDは可燃性で、腐食性があり、毒素です。</td></tr><tr><td>直径12mmの丸型カバーグラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルベニア州ピッツバーグ) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>ノーランド光学接着剤 72</td><td>ノーランド製品(ニュージャージー州クランベリー) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td></td><td></td><td>任意のブランド。</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td></td><td></td><td>どんなブランドでも。</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChemまたはサーモフィッシャー、(イリノイ州ロックランド) proteochem.com または thermofisher.com</td><td>C111または22589</td><td>使用直前に水に0.315 mg/ml溶液を調製します。37°で溶解します。Cとフィルター滅菌。フィルター内で未溶解のsulfo-SANPAHが観察されるのは正常です。スルホSANPAHは光に敏感であるため、溶液は紫外線にさらされるまで光から保護する必要があります。</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン(PDL)</td><td>シグマ-アルドリッチ(ミズーリ州セントロイアス)</td><td>P6407</td><td>水に0.2mg / ml溶液を調製し、滅菌をろ過します。</td></tr><tr><td>Collagen Type I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>0.2 N 酢酸に 0.2 mg/ml 溶液を調製します。溶液は、重合を避けるために常に冷たく保つ必要があります。酢酸は可燃性で、毒性があり、腐食性があります。</td></tr><tr><td>22 x 60カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルベニア州ピッツバーグ)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>容積式ピペット</td><td>ギルソン社(ウィスコンシン州ミドルタウン) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルバニア州ピッツバーグ)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>UV光源</td><td></td><td></td><td>ゲルをUV光にできるだけ近づけて配置します。紫外線は、皮膚や目の怪我を引き起こす可能性があります。</td></tr><tr><td>温度計</td><td></td><td></td><td>どんなブランドでも。</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>GTS-Welco(ニュージャージー州フレミントン) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

dna架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルの調製

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

メカノは、細胞の形態と機能を向ける内の物理的な手がかりの重要な役割に対処する新たな科学的な領域です。組織の剛性は、疾患、発達、および傷害に調節するため、例えば、細胞機能に対する組織の弾性の影響は、メカノ研究の主要な領域である。細胞がプレーティングされると剛性を変えることができない静的な組織模倣物質、または物質は、主に細胞の機能上の組織の剛性の影響を調査するために使用される。静的試験から収集した情報は貴重であるが、これらの研究は、 生体内での細胞の微小環境の動的な性質を示すものではありません。より良い細胞機能に対する動的剛性の影響に対処するために、DNA架橋ポリアクリルアミドヒドロゲルシステム（DNAゲル）を開発した。他の動的基質とは異なり、DNAゲルは、減少または刺激することなく、製造後に剛性が増加する能力を持っている。 DNAゲルは、DNAのcrosslから成りポリアクリルアミドバックボーンに重合されるインク。追加および一本鎖DNAの送達を介して架橋を除去することは、時間、空間、およびゲル弾性の可逆的制御を可能にする。私たちは、DNAゲルの弾力性の動的調節が線維芽細胞と神経細胞の挙動に影響を与えることがこれまでの報告に示されている。本報告書やビデオでは、準備のDNAゲル上でDNAゲルの架橋メカニズムと、ステップ·バイ·ステップの手順を説明する模式図を提供する。

本発明者らの研究に先立って、細胞 - ECM相互作用は、静的に準拠生体材料上または不可逆一方向動的基板上に観察された。これらの基板は、正確な細胞の微小環境の動的な性質を反映していない。私たちの仕事は、動的な生体材料を軟化し、補強に細胞-ECM相互作用を研究するための、より生理的なモデルを提供することで、既存の技術上のパラダイムをシフトする。以前の研究では、これらのゲル上のさまざまな細胞形態及び表現型を調べることによって、細胞上のダイナミック基質の効果を分析した。一例では、動的なDNAのゲル上で線維芽細胞形態を評価することにより、線維芽細胞上の基板補強の効果を決定した。 L929細胞は、マウス由来の線維芽細胞株は、80％および100％ゲル（ 図3）11上にプレーティングした。二日めっき後、20％の追加L2溶液は、架橋された100％（80→100％、中央パネルにゲルを硬くするために、80％ゲルの培地に添加した）。 100％のゲルおよび80％のゲルの別のセット（それぞれ右および左のパネル）、静的なままに制御たssDNAを受けた。光学顕微鏡画像は二日間の媒体へのDNAの送達後に捕捉した。...

当研究室では、より良い細胞機能に組織の硬さを調節する効果を理解するためにDNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲル、動的なヒドロゲル系を開発しました。ここでは、これらのヒドロゲルを調製するための回路図、説明、およびプロトコルを提供する。

DNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルの調製

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

本手順の全体的な目的は、細胞を播種した後に、シングルストランドDNAを培養液中にピペッティングすることで剛性を高めたり弱めたりできる、DNA架橋ポリアクリルアミドハイドロゲルを作製することである。まず、凍結乾燥したSA one、SA two、L two、R twoおよびコントロールのシングルストランドDNAをバッファーで再懸濁させ、SA oneおよびSA two溶液を個別にポリアクリルアミド骨格へと重合させる。次に、SA oneおよびSA twoを重合させた溶液をL two溶液と混合し、DNAゲルを形成させる。次に、DNAゲルの溶液を光学用接着剤を用いてガラスカバースリップ上に固定します。最終ステップは、sul sampaおよびPDLで処理することによるゲルの機能化です。最終的に、DNAゲル上に細胞を播種し、R2L2またはコントロールの一本鎖DNAを添加することで、ゲルの弾性をそれぞれ軟化、硬化、または維持させ調節します。これらの実験結果から、下地の基質の動的な性質が細胞の挙動を制御することが示されました。CROやリンゴ、ボールハイドロゲルなどの他の手法と比較して、この技術を用いる利点は、DNAゲルは弾性を調節するためにUVなどの刺激を必要としないことです。その代わりに、DNAゲルは、一重鎖DNAであるL2またはR2がそれぞれゲル内を拡散することによって、硬化および軟化します。まず、凍結乾燥させたSA1一重鎖DNAを2000 gで15秒間遠心分離し、すべての一重鎖DNAがチューブの底に集まるようにします。遠心分離後、1 x Tris-EDTA（TE）バッファーを107 µLチューブに加え、3 mMのSA one溶液を調製します。SA one NTEバッファーを70 °Cで5分間、または一本鎖DNAペレットが完全に溶解するまで加熱します。続いて、40%アクリルアミドを45 µL、10 x Tris-borate-EDTA（TBE）バッファーを18 µL加え、遠心分離して混合を促進させることで、SA one重合溶液を調製します。P 200チップを装着し、窒素ガス源に接続して溶液に浸し、2〜3分間ゆっくりと窒素ガスを溶液に通します。次に、サンプルを2000 Gsで15秒間遠心分離し、溶液を集めます。完了後、ゲルの重合を開始させるため、4.5 µLの2%硫酸アンモニウム（APS）をサンプルに添加し、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。均一な重合のためにサンプルを遠心分離して溶液を集めた後、重合を触媒させるために4.5 µLの20%テトラエチルメチレンジアミン（TEMED）をサンプルに添加します。サンプルの混合と遠心分離が完了したら、窒素ガスで3〜5分間脱気し、重合を完了させ、未反応モノマーを最小限に抑えます。その後、室温で10分間インキュベートして重合を完了させ、SA 1重合溶液を得ます。同様の手順を凍結乾燥したSA 2一本鎖DNAでも繰り返し、108 µLのSA 2溶液に、アクリルアミド、TBE、APS、およびTE緩衝液をそれぞれ45 µL、18 µL、4 µL、0.5 µL、および4.5 µL加えます。L 2、R 2、およびコントロール溶液を調製するには、凍結乾燥した一本鎖DNAを遠心分離し、前述のように対応する凍結乾燥一本鎖DNAに規定量のTE緩衝液を加え、ゲル溶液として溶解するまで加熱します。SA 1およびSA 2の重合溶液を70 °Cで約1分間、溶液の粘度が低下するまで加熱します。SA 1重合溶液10 µL（または10部）に、SA 2重合溶液10 µL（または10部）を添加します。次に、SA 1とSA 2の重合溶液を、70 °Cで15秒間の加熱とピペットチップによる15秒間の攪拌を交互に繰り返し、合計1分間混ぜ合わせます。100%のゲルを形成するために、100%のL 2溶液を6 µLまたは6部加えて混合します。前述の方法でサンプルを混合した後、100%ゲルを60 mmのペトリ皿に分注し、最適なアニーリング温度で1時間加熱します。次に、ゲルを室温で4時間インキュベートし、DNAクロスリンクの再ハイブリダイゼーションを継続させます。室温で一晩インキュベートした後、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBSでゲルを覆い、ペトリ皿から残りのバッファーを除去して、ゲルをマイクロ遠心チューブに移します。この時点で、100%ゲルを70 °Cで約30秒間、またはゲルの粘性が低下するまで加熱します。ピペッティングを行う前に、ガラスカバースリップを70 °Cのヒートブロックに置き、1〜2分間加熱します。各カバースリップに光学用接着剤を1滴滴下します。次に、100%ゲルを20 µLずつ各カバースリップに加え、ゲルが融解して表面に広がるまで待ちます。ゲルを含む各ガラスをヒートブロックから取り出し、24ウェル組織培養ディッシュに配置します。ゲルに365ナノメートルのUV光を15分間照射します。最適な肛門温度で1時間加熱し、DNAクロスリンクを4時間再ハイブリダイズさせた後、PBSを加えます。その後、ゲルを4 °Cで一晩インキュベートします。インキュベート後、ピペットを用いて、ゲルを吸引しないように注意しながらウェルからバッファーを取り除きます。次に、各ゲルを覆うようにサルファサンプルを加えます。ゲルを365ナノメートルのUV光に15分間曝露させた後、sulfa sampaを除去します。前述のステップを繰り返した後、PBSでゲルを1回すすいで過剰なsulfa sampaを除去し、0.2 mg/mLのpoly de lycine約300 µLを用いて、4°Cで一晩インキュベートします。終了後、PBSで5分間2回洗浄して過剰なポリリシンを除去し、培地を加えます。培地で30分間インキュベートした後、細胞培養およびイメージングのための細胞播種直前に、直ちに培地を除去します。硬化ゲルの上で培養した線維芽細胞は、アスペクト比に変化は見られなかったが、100%ゲルの上で培養した線維芽細胞よりも投影面積が大きかった。一方、100%ゲルの上で培養した線維芽細胞は、80%ゲルの上で培養した線維芽細胞よりも投影面積が小さく、アスペクト比が大きかった。これらの結果は、線維芽細胞の挙動が微小環境の動的な性質に依存していることを示している。軟化ゲル上で育成したニューロンでは、一次樹状突起の数や軸索の長さに差は見られませんでしたが、50%ゲル上で育成したニューロンよりも一次樹状突起が短いことが示されました。線維芽細胞の研究と同様に、静的ゲル上の神経表現型は動的ゲル上の神経表現型とは異なっていました。50%ゲル上で育成したニューロンは、100%ゲル上で育成したニューロンよりも一次樹状突起の数が少なく、軸索が長い傾向にありました。この手順を行う際は、粘性の高いゲルのピペッティングを正確に行うことが極めて重要です。濃度の適切さはゲルの破裂を防ぐために不可欠であるため、正確にピペッティングするには数回の試行が必要になる場合があります。なお、本プロトコルの考察セクションにおいて、他のいくつかの代替案を提示しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

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