ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

この手順の全体的な目標は、ファックスによるヒト組織からの前立腺がん幹細胞の単離を説明することです。これは、最初に手術標本から採取した前立腺がん組織を処理することによって達成されます。第2ステップでは、組織切片から細胞懸濁液を生成し、細胞を蛍光抗体で標識します。

最後のステップでは、前立腺がん幹細胞が事実によって分類されます。最終的に、単離された細胞の分子的および機能的属性は、異種移植および遺伝子発現プロファイリングによって特徴付けることができます。この方法は、ヒトサンプルからのがん幹細胞の分子的および機能的特性評価を容易にすることにより、前立腺がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手順を実演するのは、医学博士課程の学生であるサミュエル・ビダル、修士課程の学生であるエイデン・クイン、およびjaniaです。研究室からの研究Aは、臨床診断に必要のないがんサンプルから余分なバルク組織を採取し、15ミリリットルの培地を含む50ミリリットルの円錐形チューブにすることから始まります。切除後24時間以内に処理するために、チューブを摂氏4度で直ちに保管し、その後、滅菌メスと鉗子を備えたバイオセーフティキャビネットで作業します。

がん組織サンプル内の巨視的腫瘍結節から厚さ2〜4ミリメートルの水平組織切片を取得します。これらの切片を、メディアが入った新しい50ミリリットルのチューブに入れます。次に、一部を分離して10%ホルマリンに固定し、組織学的分析を行い、前立腺がん組織の存在を確認し、腫瘍組織から細胞懸濁液を生成します。

次に、2〜4ミリメートルの組織切片のそれぞれを、1ミリリットルの滅菌PBSを含む60×15ミリメートルの培養皿に移し、滅菌メスおよび鉗子を用いてサンプルを機械的に三回転させ、得られた細胞懸濁液を単一の滅菌50ミリリットルの円錐管にプールする。サンプル皿にさらにミリリットルのPBSを加え、各組織切片が完全に解離するまで、さらに3〜4回の反復を繰り返します。次に、5ミリリットルのピペットを使用して細胞溶液を混合します。

細胞溶液を最高速度で1分間ボルテックスし、得られた細胞スラリーを35マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、2本目の滅菌50ミリリットルの円錐管に入れます。ろ過した細胞を室温でGの450倍で10分間スピンダウンします。次に、ペレットを5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。

5分後、セルを再度スピンダウンします。Resusは、トライアンブルー排除によるカウントのために5%FBSを添加した少量のPBSに赤血球遊離ペレットを懸濁しています。生細胞の数を定量化した後、細胞を1ミリリットルあたり6細胞の懸濁液の10倍に希釈し、氷上に1時間以内で保存します。

前立腺がん幹細胞を単離するには、まず、図示されているように5本の15ミリリットルの円錐管を標識し、ソーティング中に造血細胞と内皮細胞を除外します。腫瘍組織切片から生成された細胞懸濁液を5本のチューブで分割し、適切な抗体と細胞を1〜250希釈で氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞をスピンダウンし、10%FBSを添加した滅菌PBSでペレットを洗浄します 洗浄後、ペレットをDPIの1ミリリットルあたり10マイクログラムでインキュベートし、最終溶液を35マイクロメートルのストレーナキャップで12 x 75ミリメートルのポリスチレンチューブにろ過します。

最初の 4 つのチューブを使用して、前方散乱側散乱 dpi、fite、pe のゲートを設定します。最後に、チューブ 5 を使用して、HLA クラス 1 陰性および HLA クラス 1 陽性の集団を、10%FBS を添加した 2 ミリリットルの RPMI を含む個々の無菌 15 ミリリットルの円錐チューブに収集します。次に、選別した細胞懸濁液をスピンダウンし、ペレットを200〜500マイクロリットルの培地に再懸濁して、トライアンブルー排除による生存細胞の定量化を行います。

実証されたプロトコルは、ヒトの手術標本からのHLAクラス1陰性前立腺がん幹細胞の単離を容易にします。これらの画像は、顕微鏡で処理して確認できる、肉眼的に見える肉眼的な腫瘍結節を示しています。実証されたように、生存細胞は、HLAクラス1の陰性前立腺癌幹細胞の頻度を染色する陰性dapi染色によって単離され、次いで決定することができる。

HLAクラス1陰性前立腺がん幹細胞の数は患者によって異なりますが、一般的には、この手順に従う全生存人口の0.5〜8%を占めます。遺伝子発現プロファイリングや異種移植などの他の方法を使用して、化学療法抵抗性や疾患の進行に寄与するメカニズムをより詳細に特徴付けることができます。