Name: 自由に昆虫を歩くの脳における細胞外ワイヤーテトロード録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学ぶ自由歩行ゴキブリの脳における細胞外テトロード録音法。神経活動と行動を同期させて昆虫の脳機能を解明し、神経科学の基礎研究に応用可能な手法を習得できます。

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著者は、提案をニックKathmanに感謝し、原稿の準備に役立ちます。この技術は助成FA9550-10-1から0054までとRERの助成金番号IOS-1120305の下で国立科学財団の下でAFOSRでサポートされている作業と連携して開発されました。

1。四極ワイヤーの作製<ol><li>約1.1メートルの長さの非常に薄いニクロム線（12μmの直径、PACコーティング）を引き出します。両端にテープタグを添付してください。両端はベンチトップの近くに同じ高さになるように横ネジ棒の上にワイヤーを掛ける。 </li><li> 4、合計2以上の端部を作り、第2のワイヤのためのステップ1.1を繰り返し、次の第一ワイヤ（間に約1cm）に配置します。 </li><li>テープタグと一緒に4端を固執し、電動回転巻取装置にタグを添付してください。この装置は、安価なDCモータから作製することができる。 </li><li> 2分（60回転）のために一方向に四極を風や30秒間逆方向におくつろぎください。 </li><li>一緒にワイヤーを融合さヒートガンを使用してください。銃で電線に触れないでください。各パスには約10秒を取って、上下に渡し、交互方向からの3を使用してください。 </li><li>トップと傷線の下部をカットします。 4本のワイヤがねじれているdは一端で互いに融合し、他で区切る。 </li><li>支持管を追加します。ポリエチレン管（：0.28ミリメートル、外で0.61ミリメートル、内径）の30cmの長さに切る。それがよじれないように、支持管に非常にゆっくりと慎重に四極管を通します。 </li><li>融合された端部が他方の側を表示されたら、ガイドチューブの両端のワイヤの等しい長さがあるように、それを介して引っ張る。 </li><li>ピンセットで各ワイヤの別々の終わりをつかむ。ガスバーナーの炎のベースを使用して、慎重に各ワイヤの最後の2または3ミリメートルの外断熱材を燃やす。それが点灯するまで、ワイヤを加熱するのが、カールしていません。 </li><li>録音デバイスに合った男女ICソケットアダプタで四極管を接続します。ピンセットで、アダプタの異なるソケットに各ワイヤのdeinsulated終止符を打つ。小さな真鍮のピンとソケットに電線を安定させる。細かい点はんだごてを使用し、溶融した半田でソケットを埋める。接触しないように注意してくださいはんだごてで壊れやすい線。 </li><li>各ワイヤのインピーダンスと配線の各ペアの間のインピーダンスを確認してください。 <ol><li>生理食塩水の容器の中に融合させ、ねじれた端を置き、抵抗計に生理食塩水から銅線導体を接続してください。 </li><li>ワイヤの入ったソケットピンにメーターのもう一方の端を接続します。各ワイヤのインピーダンスを3MΩ未満である必要があります。 </li><li>上記の値が達成されていない場合は、はんだ接続を再試行。 </li><li> 、生理食塩水から電線を取り除くには、水でのヒントをすすぎ、それぞれのペアリングのためのインターワイヤーインピーダンスをテスト（N = 6）。相互インピーダンスは5MΩ以上である必要があります。 </li><li>上記の値が達成されていない場合は、融合された最後にチップオフの少量をスライスして再テストします。 </li><li>線のすべてのためのインピーダンスの両方の要件を満たしていない任意のワイヤ·セットを廃棄します。 </li></ol></li><li>四極管を固定します。 <ol><li>小さな長方形の紙箱sligを折るソケットアダプタよりhtly大きい。 </li><li>下部のオス側をボックスにアダプタを移す。アダプターの残りの部分はボックス内にある間にオス側のすべてのピンがボックスの外側になるようにボックスを貫通している。 </li><li>外側の箱の角をテープで固定します。ワイヤーの任意の個々の鎖を安定化するために箱の内側に両面粘着テープの小片を使用してください。それは箱を出るとき、ワイヤが溶融しなければならない。 </li><li>高速のセット2液型エポキシを混合し、アダプターとすべてのワイヤを固定するために箱に注ぐ。 </li><li>歯科用ワックスとのエリアのサイドにガイドチューブの近端を取り付けますが、チューブが四極管の両端で自由に通って引っ張ることができるようにオープンにしてください。 </li></ol></li><li>四極管を研ぐ。 <ol><li>各実験の前に、鋭いメスの刃ではなく、ハサミで四極管の先端をカットします。これは、次の工程のためにクリーンなフラットエッジを提供しながら粉砕し、ワイヤ端部の先細防止する。 <oL&gt; <li>小さな回転工具は、四極管を磨くといくつかの先端の絶縁を削除する（これらは1プラットフォーム上で組み合わせることができます）培地と細かいグリットサンディングディスクで垂直に取り付け使用してください。鉗子との終わり近くにバンドルを保持する。サンディングディスクに対して45°の角度にワイヤーセットの端を傾け、静かに培地上にそれぞれ約1〜2秒程度の速度で回転するディスクに触れてから、罰金グリッツ。軸方向にバンドル90°毎回回転、この3回繰り返します。そうでなければ、ワイヤの分離が発生する可能性があり、サンディングディスクのスピンの向きが離れてワイヤ端の浅い角度からのものであることが重要です。 </li><li>望ましい結果は、各ワイヤの末端から除去絶縁少量の尖った先端にストレートエッジからバンドル端を変換します。四極管をメッキする前に、解剖顕微鏡を使用してポイントを確認してください。任意のほつれが先端で発生した場合は、再切断およびrepolish。 </li><li>もしsubsequ時のインピーダンス·テスト耳鼻咽喉科めっき工程が極めて低いインターワイヤー値（MΩ4未満）を示し、研磨工程中に除去すぎる材料を示す。四極を再編集し、repolish。 </li></ol></li><li>四極管プレート。飽和硫酸銅溶液（85 mlの水、5ミリリットルの硫酸、50グラムの硫酸銅）に四極管の先端を置く。プレート刺激アイソレータで2.5μAの電流で各ワイヤ。 、1秒間電流を注入1秒間休止し、このプロセス4Xを繰り返します。 </li><li>各ワイヤとワイヤの各ペアのinterimpedanceのインピーダンスを確認してください。各ワイヤのインピーダンスは0.5〜1MΩ間インピーダンスは4MΩを超えるべきであるべきである。 </li><li>マルチチャンネル記録方式のヘッドステージ上にマウントアダプター。 </li><li>マイクロマニピュレータに曲がった虫ピンを取り付けます。歯科用ワックスと虫ピンに四極の先端を取り付け</li></ol></li></ol> 2。動物の準備<ol><li>麻酔をかける氷とゴキブリ。 </li><li>ゴキブリは移動を停止した後に、昆虫にまたがる大規模なサドルピンと平らなコルク表面に対して垂直にゴキブリを抑えるが、その身体の一部に浸透しない。 </li><li>プラスチック容器に移す準備をし、血流や体の動きを最小限に抑えるために、動物の周囲に氷を置く。 </li><li>頭をサポートし、それを安定させるために頭の周りに歯科用ワックスを配置するために、首のプラスチックカラーを配置します。 </li><li>かみそりの刃で単眼の間に小さなウィンドウをカットし、頭部からキューティクルを削除します。 </li><li>脳が露出するようにピンセットで結合組織や脂肪を取り除きます。 </li><li>脳組織をカバーするために頭部カプセルにいくつかのゴキブリ生理食塩水を入れます。 </li><li>脳をdesheathするには、静かに脳の上にシースをつかむと、電線に移植領域に離れてシースを引き裂くために、別の細かい鉗子を使用するように細かい鉗子を使用しています。 </li><li>脳のウィットに頭部カプセル前方に小さな穴を開けH虫ピン。参照/接地電極として機能するように穴に銅線を絶縁し3より大きい直径（56ミクロン）の三つ編みを挿入します。 </li><li>マイクロマニピュレータに脳表面に四極管の先端を下げて、関心のある脳領域の近くに配置します。 </li><li>慎重に四極管に薄いアセテートシートの2つの小片頭部カプセルの穴よりもわずかに大きい（2ミリメートル×1 mm）で、前部と後部に配置します。 </li><li>記録システムの電源をオンにします。 </li><li>ゆっくり記録品質に応じて、脳の表面の下に四極管150〜250程度を下げる。 </li><li>記録システムの電源をオフにします。 </li><li> （ 図1A）、それに触れることなく、可能な四極に近いアセテートのシートの2枚を移動します。 </li><li>小さなへらを加熱したり、皮下注射針を平らにし、ヘラの先端の液体ワックスが存在するように歯科用ワックスに入れて。丁寧にからアセテートのシートの各部分の遠端に触れる液体ワックスは、各片に流入し、ヘッドキューティクルの間の隙間をシールすることができるように、へらで四極。 </li><li>ステップ2.16を繰り返します。アセテートシート上に毎回液体ワックスを少量をドロップします。遠く四極管から処理を開始し、それに向かって徐々に移動します。最終的には四極管は、歯科用ワックスによって固定されます。空洞内に、脳にホットワックスが出るのを避けるため。 </li><li>ワックスで参照/接地電極を固定する2.16と2.17の工程と同じ方法を使用します。 </li><li>そこから四極管を解放するためにマイクロマニピュレーターに四極を添付し、ワックスを加熱する。 </li><li>ループストレインリリーフ（ 図1B）を提供するために、頭の上に歯科用ワックスに四極。 </li><li>歯科用ワックス（ 図1C）とストレインリリーフループをカバーしています。 </li><li>慎重に制約を削除し、ペトリ皿に準備を転送します。大型サドルピンと準備背側を拘束する。 </li><li>添付するグルーガンを使って前胸背板に棒。これは腹部の上前胸背板から延びている木の棒である。 </li><li>歯科用ワックスとロッドの後端に四極管の先端に取り付けます。 </li><li>歯科用ワックスとロッドの前端に四極と参照/接地電極を固定。 </li><li>できるだけ多くのチューブのソケット端から四極管を引くが、動物が、チューブ（ 図1D）の外に四極の一部が破損する恐れがあり可能性を排除するために、それを引っ張るません。 </li><li>すべての制約を削除します。歯科用ワックスとの四極管類を参照/接地電極を取り付けます。 </li><li>任意の実験の前に氷の麻酔から回復するための動物のために、少なくとも60分待ってください。 </li></ol> 3。実験手順<ol><li>記録システムおよびシリアルポートケーブルにUSBを使用して、LEDライトの両方を搭載したPCを接続します。 </li><li>神経の録音を開始します。 </li><li>高速度カメラを用いた実験を登るためのハチクイモドキ画像取得パッケージ16または120 FPSを用いた実験を歩くために、毎秒20フレームでビデオ録画を開始します。 </li><li>実験を登るための高アリーナ、長い実験または58センチ歩いて40センチ×40センチメートルのプレキシガラスの分野にゴキブリを置いて幅5cm、5センチメートル。ウォーキングアリーナはヘッドステージが配置されている上にアリーナの中央、右壁の中央から伸びる透明バリアを持っています。バリアは、カメラビューがヘッドステージによってブロックされた領域の中を歩いてから動物を防止するために使用される。クライミングアリーナは、アクリル系ブロック（1.2センチメートルまたは1.8センチの高さ、および幅5cmのいずれか）またはセンターに匹敵高さに位置し、棚を持っています。 </li><li>カスタマイズされたMATLABコマンドを使用してPCからTTLパルスを生成します。 （S =シリアル（ &#39;COM4&#39;）;のfopen（S）; s.RequestToSend =「オフ」/ s.RequestToSend = / &#39;に&#39;; fcloseを（S）、削除（S）;)。 TTLパルスは、時間が生成されます記録方式に固めるとオンまたはLEDライトをオフのどちらか。 </li><li>それは歩くの実験のために30秒以上移動を停止するまで、ゴキブリがアリーナを探索することができます。ゴキブリ実験を登るための棚を通じてブロック/シェルフまたはトンネル経由で登ることのどちらかを許可します。 </li><li>ビデオ録画を停止します。 </li><li>神経の録音を停止します。 </li><li> TTLパルスによって生成されたタイムスタンプを記録します。 </li><li>アリーナからゴキブリを取り出して、約3分待ちます。 </li><li>繰り返します、次の裁判のため3.2から3.10を繰り返します。 </li><li>一度すべての録音が完了している、ワイヤ先端（アノード）と、ワイヤ先端に脳内に銅を堆積するための基準電極（陰極）のいずれかを使用して5μADC電流の5秒を渡す。 </li></ol> 4。オフライン分析<ol><li> LED光が切り替わるフレームの記録方式により記録されたタイムスタンプを連結することにより、映像および神経データを同期させるその瞬間。 </li><li>マークワイヤ先端の位置。 12μmの連続切片17で銅を沈殿させ、観察するティムズの強化手順を使用してください。著名な堆積物は3-8隣接するセクション（区域の背腹面の長さの約18から48までパーセントは、我々から録音）（ 図2）に表示する必要がある。 </li><li>単一ニューロンの活動に具体的な電気的刺激を関連付ける。他で詳細10,14,18にレイアウトされた手順をソートスパイクに従ってください。初期、自動化されたクラスタリングを生成するプログラムKlustaKwik（バージョン1.5、著者K.ハリス、ラトガース大学）を使用します。プログラムMClust（バージョン3.5、著者のAD赤みがかっら 、ミネソタ大学）さらなる改良および分析のため（ 図3）にインポートします。 </li><li>ゴキブリの動きを追跡。歩行実験のために、各フレームのVIDの質量のゴキブリの（可視）の中心位置と、その本体の向きを抽出するとMATLAB 19のための関連FixErrorsツールボックス、カリフォルニア工科大学の複数のフライトラッカー（http://ctrax.sourceforge.net/バージョン0.1.5.6）を使用して、EOの録音。実験を登るために、運動分析ソフトウェアパッケージを使用して、ビデオの各フレーム内のブロックと、ゴキブリの頭と前胸背板の位置を抽出する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

昆虫の脳のCCまたは他の地域での以前の電気生理学的研究は行動の中央制御への洞察を提供してくれているが、それらのほとんどが抑制調剤9,11またはつながれたもの10,14のどちらかで行った。その結果、動物の感覚的な体験や生理状態は、自然の中でのものとは大きく異なる可能性があります。さらに、動物が実行できる行動のタスクは、そのような状況の下で一つの平面に制限されています。ここでは、自由に行動するゴキブリのC-Cから録音する方法を提示した。うまくいけば、我々はあなたが自由に自分の研究室で昆虫を振る舞うに電気生理学的記録をキャプチャする必要があります。すべての必要な情報を提供している。我々は（Neuralynx、MClust、WinAnalzye、およびCtrax）を使用するシステムのための手順を紹介しますが、再符号化電極が注入されると、セットアップが容易に他のシステムに適合させることができる記録。＆＃160; 私たちは、27の準備を行った、とゴキブリがワイヤーセットを損傷しているため、まだの...

この記事では、昆虫は、それが好転する可能性のオブジェクトとアリーナとお得な情報を歩くの下 ​​にトンネルや障害物を乗り越えるようにゴキブリの中心複合体（CC）、Blaberusのdiscoidalis、内のニューロンから記録するための正常なシステムが記載されている。ワイヤはまた、その結果としての行動変化と周囲の神経網の活動を呼び起こすための刺激装置に接続することができます。 過去10年間にわたり、かなりの注意が昆虫の行動を制御する際に、様々な脳領域が果たす役割に向けられてきた。この焦点の多くは、集合的に、中央複合体（CC）と呼ばれる正中脳neuropils向けられてきた。進展が行動に、CCの役割について疑問をターゲットに技術の広い品種の結果としてなされたものである。これらの技術は、behaviと相まって、主にショウジョウバエの神経遺伝的操作、、の範囲にCCと行動の関連パラメータに、そのアクティビティを関連付けるための試みの中に神経活動をモニターする電気生理学的手法に経口分析1-3。 電気生理学的手法は、多くの場合、マルチチャネル·プローブ10,11と、個々の識別されたニューロン4-9と細胞外記録からの細胞内記録が含まれています。これら2つの技術が無料でご利用いただけます。鋭い電極またはホールセルパッチを有する細胞内記録は、識別されたニューロンに非常に詳細なデータを提供するが、一度に1つまたは2つの細胞に限定され、制限された又は全く動きを必要とし、比較的短時間にわたって維持することができる。細胞外記録は簡単に拘束を必要としない、設定することができ、かつ時間維持することができます。マルチチャンネルtetrodesおよびクラスタ切断して、神経細胞のかなり大きな集団が同時に9,12分析することができます。しばらく全細胞PATCHが正常につながれた昆虫13で使用されてきた、我々は、彼らが前進への障壁に対処するように、私たちは自由に昆虫を振る舞うにおける長時間の脳内の神経活動を記録することができるように技術の必要もあると感じています。 昆虫が移動し、最大バウンス上下として記録する必要は、細胞外記録方法に向かって私たちを押した。我々は商業的に入手可能な16チャンネルのシリコンプローブ11で拘束の準備で良いの成功記録を持っていた、しかし、大きくてもゴキブリの小さいサイズは、プローブは、本体の電源を搭載しなければならないことを意味します。つまり、プローブ歯の繊細さと相まって、無料のウォーキングの準備のためにそれらが不適切た。 2以前のプロジェクトでは、我々は同じような記録特性を達成するために四極を形成する細線の束を使用しますが、より堅牢な配置で。これら四極管の束は、私たちはつながゴキブリから録音することができスピード14を歩いて、ロッド10との触角の接触から生じる行動を回すの変化に、CCユニットの活動を関連付けるdは。 これらの繋留の準備がされているとあり続けるだろうとして有用であると、彼らはいくつかの制限を提示しております。まず、虫が実行できる行動は一つの平面に制限されています。それは我々が容易に歩行速度や回転の変化を呼び起こす可能性があるが、登山やトンネルのアクションは、少なくとも一般的なテザーの配置と、不可能であった。第二に、私たちの繋留の製剤は、「オープンループ」である。つまり、彼らはシステムに通常の移動に関連するフィードバックを許可していない、です。ゴキブリは私たちのテザーにオンしたがって、その視覚世界は、それに応じて変化しなかった。なお、この種のフィードバックを導入するために、閉ループテザーシステムを構築することができる。しかしながら、それらは、シミュレートされた視聴環境のプログラミングやハードウェアの複雑さによって制限される。 NeverthelesS、我々はそれが競技場トラック内を自由に歩いて、それは、その自然環境の中で同じようにオブジェクトを検出しましたように我々は動物から記録することにより、当社の既存つなが記録方式を改良できると感じました。 脳活動を記録するための15の無線システムが理想的であろうが、現在のシステムは、記録チャネルの数、データ収集、バッテリ寿命および重量の時間的制限がある。我々は、それゆえ、自由準備を移動させる際に使用するために私達のつなが記録システムを適応させることを試みることにしました。良好な無線システムが利用可能になるように、この技術は、容易にこのような装置に適合させることができる。この資料に記載されているシステムは、軽量で非常にうまく機能し、ゴキブリの行動にほとんど悪影響を有すると思われる。安価な高速度カメラおよびクラスタ切断ソフトウェアでは、個々の脳のニューロンにおける活動は運動に関連させることができる。ここでは、た準備を説明四極ワイヤーや昆虫の脳内に注入だけでなく、電気的活動や運動のための記録技術のATIONとどのようにそれらのデータは、その後の分析のために一緒にすることができます。

<table><tbody><tr><td>ニクロム線&nbsp;</td><td>Sandvikの暖房の技術</td><td>Kanthal RO-800</td><td>四極</td></tr>管のための使用 <tr><td>生物医学のポリエチレンの管</td><td>A-Mシステム</td><td>800700</td><td>四極管の管</td></tr><tr><td>のための使用 Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>マルチユニット記録のための使用</td></tr><tr><td>Cheetah 32</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>多重ユニット記録のための使用</td></tr><tr><td>高速度カメラ</td><td>Basler</td><td>A602f</td><td>のためのビデオ録画のための使用歩行実験</td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>カシオ</td><td>EX-FC150</td><td>登山実験用動画撮影用</td></tr><tr><td>WINanalyze</td><td>Winanalyze</td><td>version 1.4 3D</td><td>動画トラッキング用&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB R2012b</td><td>TTLパルス生成およびオフラインデータ解析に使用</td></tr></tbody></table>

自由に昆虫を歩くの脳における細胞外ワイヤーテトロード録音

Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

昆虫モータ制御における脳活動の役割の関心の高まりは、我々は昆虫が自然な行動を実行しながら、神経活動をモニターすることができることが必要です。我々は以前つながゴキブリは歩行速度を回したか、変更されている間、私たちは、同時に複数のニューロンからの活動を記録するために許可されたゴキブリの脳の中心複合体に四極電線を移植するための技術を開発しました。大きな進歩が、テザリングの製剤は、限定された行動へのアクセスを提供し、多くの場合、自由に動物を移動させる際に発生するフィードバック·プロセスを欠いている。我々は今、彼らは競技場の中を歩くと、登山やトンネリングを回しての障壁に対処するように、私たちは自由に動くゴキブリの中心複合体から録音することができ、その技術の修正版を提示します。高速ビデオおよびクラスタ切断と相まって、我々は今、自由に行動する昆虫の動きの様々なパラメータに脳の活動を関連付けることができます。

我々は、歩行実験のための27の製剤中のCCから50単位の神経活動を記録した。それらの製剤（23単位）の15、クライミング実験も実施した。個々のユニット（ 例えばユニット1-2の準備1、ユニット2を示す）の準備とユニット番号に従って名前が付けられています。 1登山裁判の映像のスナップショットを図4に示す。ビデオ全体は、補足ビデオ1で提供されています（音は部1-2からのものである）。記録は右扇状体（FB）で行った。それはブロックが発生したため、ブロック（ 図4A-C）を評価するために、そのアンテナを使用した場合にゴキブリが歩いて停止しました。その後、ゴキブリは（ 図4F-I）は、ブロックの先頭に向かって足を振っ前に、体基板角（ 図4D-E）を変更し、その体の前を調達し、その上に登った。番目のスピードと高さEゴキブリだけでなく、最初から現在のフレームに2つのソートユニ...

我々は以前、私たちはつながれたゴキブリの個々のユニットでの活動を監視することを可能にするゴキブリの脳の中心複合体に四極電線を移植するための技術を開発しました。ここでは、私たちが自由に虫を移動させる際に、脳の活動を記録することを可能にする技術の修正版を提示します。

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

本手順の全体的な目的は、脳内の複雑な神経活動を記録し、それを自由に動き回る昆虫のビデオ記録された行動と同期させることです。これは、まず極細線を用い、先端の研磨、テスト、コーティング、およびポリエチレンチューブ内での位置標記と固定を行うことで、柔軟な記録用テトロ（tetro）を作製することによって達成されます。第二のステップでは、記録用テトロを脳内に挿入し、アセテートとワックスで固定し、ヘッドにストレインリリーフループを取り付けます。次に、運動行動のビデオ録画とともに神経活動を記録します。LEDとアンプへの同期パルスを用いて、ビデオと記録を同期させてください。最後のステップとして、直流電流を用いて銅を析出させ、Tims法を用いて染色を強化し、記録部位を可視化します。最終的に、高密度マルチユニット細胞外ソーティング技術によって神経ユニットが特定され、同時に記録された行動ビデオの解析により、神経活動と行動の微細な相関関係を明らかにすることができます。この手法の主な利点は、昆虫が複雑な行動を行っている間に、既存の手順を用いて脳から高密度の細胞外神経活動を記録できることです。これにより、脳内のどこにTet電極が位置していたかを特定することができ、これらすべてを比較的低コストで実現することが可能です。この手法は、特定の脳領域における神経活動のタイミングと強度を、自由行動下にある動物の行動と相関させることで、神経病理学における重要な疑問への回答を得るのに役立ちます。本手法は感覚運動制御に関する知見を提供しますが、学習、定位、あるいはナビゲーションなど、昆虫の自由行動を必要とするあらゆる行動にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな者は苦労することになります。なぜなら、記録用の電極は固定が困難であり、記録のためにそれらを配置し安定させるには、非常に精密な微小外科的手法が必要となるためです。本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。Teroの作製および植込手順は、非常に小さく脆弱な材料を用いて行われ、さらに脳組織を損傷させないよう細心の注意を払う必要があるため、習得が困難です。Tet Roadワイヤーを準備するには、2本の引き伸ばしたromワイヤーを電動回転巻線装置にセットします。テロを60 rpmで2分間一方向に巻き、次に逆方向に30秒間巻き戻します。次に、ヒートガンを使用してワイヤー同士を融着させますが、その際、ガンがワイヤーに触れないように注意してください。方向を交互に変えながら、1回につき約10秒かけて、上下に3回パスさせます。次に、30 centimeterの長さのポリエチレンチューブで作製した支持チューブを追加します。テトラを支持チューブの中にゆっくりと通し、折れ曲がらないように注意してください。融合端がチューブの反対側から現れたら、ガイドチューブの両端でワイヤーの長さが等しくなるように引き出します。次に、ガスバーナーの炎の根元を用い、ピンセットで各電線の反対側の端をつかみます。各電線の先端2〜3mmの絶縁被覆を注意深く焼き切ります。電線が赤くなるまで加熱しますが、曲がらないように注意してください。次に、ピンセットを使用して、テロ（tero）を記録装置に適合するオス・メスICソケットアダプターに接続します。各電線の絶縁を剥いた端を、アダプターの異なるソケットに挿入します。電線を固定するために真鍮ピンを追加します。次に、極細のハンダごてを使用して、ソケットに溶けたハンダを満たします。続いて、付属のテキストプロトコルに従い、インピーダンスメーターを用いて電気的な接続が適切であるかを確認します。未使用の別のアダプターを用いて、底に穴が開いた小さな紙型を作成します。メールピンを作成するには、ワーキングアダプターをボックスに入れ、メール側を底にし、ピンがボックスから突き出した状態にします。テキストプロトコルに従ってボックスをテープで固定した後、2液性エポキシ樹脂を素早く混合し、ボックスに注ぎ入れます。アダプターとすべてのワイヤーを固定するため、ガイドチューブの手前側をデンタルワックスでボックスの片側に貼り付けますが、ワイヤーテロを両端から自由に引き出せるよう、チューブの開口部はそのままにしておきます。エポキシが硬化し、アッセンブリ全体が乾燥した後、次のステップでテロを研磨します。まず、鋭利なメスでテロの先端を切断することから始めてください。次に、中目および細目の研磨ディスクを垂直に取り付けた小型ロータリーツールを使用して、teroを研磨します。ロータリーツールを中速に設定し、束の端に近い部分を持って保持します。ピンセットを用いて、ワイヤーがセットされている端を研磨ディスクに対して45度の角度に傾けます。サンディングディスクの回転方向が、ワイヤー端の浅い角度とは逆方向であることを確認することが極めて重要です。そうでない場合、ワイヤーが分離する可能性があります。ワイヤー束を中目のサンディングディスクに1～2秒間軽く接触させ、次に細目のサンディングディスクにさらに1～2秒間接触させます。この操作をさらに3回繰り返します。その際、束を毎回軸方向に90度ずつ回転させてください。完了後、解剖顕微鏡を用いて、束の先端が尖っており、各ワイヤの先端から少量の絶縁材が除去されていること、およびほつれがないことを確認します。その後、個々のワイヤ間、および各ワイヤと接地プレート間のインピーダンスを再度確認してください。先端を飽和硫酸銅溶液に浸し、最初の電線に2.5 µAの電流でメッキを施します。刺激アイソレーターを使用して、電流を1秒間注入してください。1秒間休止し、この工程を3回繰り返します。同様に、残りの3本の電極線をプレートに固定します。再度インピーダンスを確認した後、マルチチャンネル記録システムのヘッドステージにアダプターを取り付けます。テキストのプロトコルに従ってゴキブリを麻酔し、固定した後、曲げた昆虫ピンをマイクロマニピュレーターに取り付け、テロワイヤーの端を歯科用ワックスで昆虫ピンに固定します。カニューレを切除した後、カミソリでO細胞の眼の間に小さな窓を開けます。ピンセットを使用して結締組織と脂肪を除去し、脳を露出させます。その後、頭 capsule 内にゴキブリ用生理食塩水を注入して脳組織を覆い、脳の鞘を除去します。精密ピンセットを用いて脳上の鞘をそっと掴み、別の精密ピンセットで電極が留置されている部位の鞘を切り裂きます。次に、昆虫ピンを使用して、脳の前方の頭殻に小さな穴を開けます。そこに、直径56 micronの絶縁銅線を3本編んだものを挿入します。参照接地電極として使用するため、マイクロマニピュレーターを用いてテトロの先端を脳表面まで下げ、脳の関心領域の近くに配置します。テトロの前後に、頭蓋骨の穴よりもわずかに大きい2×1 mmの薄いアセテートシートの小片を2枚、注意深く配置します。記録品質をモニタリングしながら、tetrodeを脳表面から150〜250 µmまでゆっくりと下げます。中〜大サイズの自発的な細胞外スパイクを確認し、関心領域であることおよび全般的な神経組織の生存能を判断します。tetrodeの位置に満足したら、2枚のアセテートシートを、tetrodeに触れない範囲で可能な限り近づけます。電線を切断しないよう、解剖および植込の際は細心の注意を払うことが非常に重要です。皮下注射針の先端を叩いて平らにして作った小型のスパチュラを使用し、アルコールランプでスパチュラを加熱します。次に、スパチュラの先端に液状のワックスが付着するように、歯科用ワックスにスパチュラを浸します。液体ワックスを、teroから最も遠いアセテートシートの端に慎重に触れさせ、アセテートシートと頭部角質層の隙間を液体ワックスで密閉します。スパチュラを加熱し続け、少量の液体ワックスをアセテートシートに滴下することを繰り返します。徐々にtero方向へ移動し、最終的に少量の歯科用ワックスでteroを固定します。熱いワックスが空洞内や脳に入らないように注意してください。次に、同様の方法で参照電極をワックスで固定します。これで、teroをマイクロマニピュレーターに固定しているワックスを加熱し、teroをそこから切り離します。次に、テロを頭部のワックス内でループさせ、ストレインリリーフ（張力緩和）を設け、そのループをワックスで覆います。この時点で、拘束具を慎重に取り外し、氷上に置いたペトリ皿に試料を移します。大きなサドルピンを用いて、試料を背面が上になるように固定します。グルーガンを使用して、前胸背板から腹部まで伸びるように木の棒を取り付けます。次に、テロチューブの先端を歯科用ワックスでロッドの後端に固定します。続いて、テロと参照電極を歯科用ワックスでロッドの前端に固定します。その後、チューブのソケット端からテロを可能な限り引き出しますが、強く引っ張らないようにしてください。動物がテロ（tero）の露出部分を損傷させる可能性を排除するため、ワックスを用いてアダプターに固定します。すべての拘束具を取り除いた後、歯科用ワックスを使用して参照電極をテロのチューブに装着します。歩行実験のための行動実験を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、良好な神経記録およびビデオ録画を確立してください。登攀実験の場合は、ゴキブリにプレキシガラスのアリーナを探索させます。動物が乗り越えたり下をくぐり抜けたりするための棚状の障害物、または動物が登るためのプレキシガラス製ブロックを備えた、細長いアリーナを使用します。記録時には、カスタマイズしたMATLABコマンドを用いてコンピュータからTTLパルスを生成します。このTTLパルスは記録システムにタイムスタンプを生成し、刺激試行のためのLEDライトのオンまたはオフを切り替えます。1本の電極先端と参照電極間に5 µAの直流電流を5秒間流して脳内に銅を析出させ、実験準備が完了した後、記録電極間の電流パルス列を用いて行動を誘発させることができます。電極先端の位置を特定するため、1つのテロ束内の単一電極からの生電圧波形をここに示します。電極間で電圧波形が異なることに注意してください。MLUを用いて3つのユニットをソートしました。4つの電極のうち3つの電極で記録された波形エネルギーの3次元ビューをここにプロットします。各点は、最終的に割り当てられたクラスターごとに色分けされた単一の閾値イベントです。このスナップショットは、登攀試験のビデオからキャプチャしたものです。各フレームの上方には、正規化された速度、ゴキブリの高さ、およびソートされた2つのユニットの瞬時発火率が、最初のフレームから現在のフレームまで表示されています。0時は登攀の開始を示しており、表示上の目的から、発火率は0から1に、速度と高さは0から0.5に正規化されています。各フレームの下にあるマークは、現在のフレームから1秒以内における2つのソート済みユニットのスパイクを示しています。オレンジ色の線は各フレームがカバーする時間を、青色の長方形は現在のフレームの瞬時発火率の計算に使用されたカーネル幅の2倍を示しています。この記録は右扇形体で行われました。ユニット11の発火率は登攀中に上昇し、発火率の上昇は速度の上昇に先行しました。ユニット12は登攀前は静止していましたが、登攀の開始後に発火し始めました。アリーナ探索試験のこのスナップショットにおいて、赤色の楕円線は当該フレームにおけるゴキブリの形状を、赤色の破線は過去10フレームにおけるゴキブリの重心位置を示しています。ここでは、旋回速度および前進歩行速度、ならびにユニット21の瞬時発火率が表示されています。現在のフレームから前後4秒間におけるユニット21のスパイクが、フレームの下に示されています。前述と同様に、オレンジ色の線は各フレームがカバーする時間を、青色の長方形は、現在のフレームの瞬時発火率の算出に使用されたカーネル幅の2倍を示しています。この記録は中扇体で行われました。各フレームにおけるゴキブリの位置と体の向きは、テキストプロトコルに記載されているトラッキングソフトウェアを用いて抽出され、前進速度、方向速度、および瞬時発火率の算出に使用されました。ゴキブリが歩行を開始するとユニット21の発火率が上昇し、これは歩行速度と相関していました。多くの中心複合体ユニットにおいて、発火率の上昇は特定の移動状態に限定されていました。例えば、ユニット21は回転速度に関わらず前方への歩行に同調していました。ビデオに登場するゴキブリの軌跡をここに示します。大きな黒い点はゴキブリの開始点を示し、それぞれの小さな黒い点は各フレームにおけるゴキブリの位置を示しています。軌跡はユニット2の瞬間的な発火率を示すために色分けされており、青は低い発火率を、赤は高い発火率を示しています。ユニット21のこの発火率マップにおいて、X軸は回転速度を、Y軸は前進歩行速度を表しています。正の回転速度は右方向への回転を、負の回転速度は左方向への回転を示しています。電極の配置は、本文に記載されている組織学的処置後に確認される銅の沈着によって決定されます。あるいは、電極を蛍光染料でコーティングし、共焦点顕微鏡で位置を特定することも可能です。これは複雑な一連の手法であり、習得した後でも合計で数時間を要するため、工程をいくつかのサブセットに分け、複数のterosを製作およびテストすることを推奨します。これは、移植実験を開始する前に行うべき作業です。電極（tero）のワイヤー間および個別のインピーダンスが適切であるか事前にテストすること、および脳への埋め込みと閾値の固定を行う際には細心の注意を払うことが重要です。解析手順を簡略化するために、自動リアルタイムトラッキングなどの手法を組み込むことができます。このビデオを視聴することで、自由行動下の昆虫の複雑な行動と生理学的活性を同期させるための、電極の作製および埋め込み方法について十分に理解できるはずです。

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