コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

本実験の全体的な目的は、プロテオーム解析のためにヒトおよびマウスの脳組織からタンパク質を抽出することです。これは、2次元電気泳動法に適応した同一のタンパク質抽出を行うため、共通のライシスバッファーを用いることで達成されます。次に、質量分析による同定に向けて、2次元蛍光差等電点電気泳動を用いてタンパク質を分離します。

続いて、翻訳後修飾を同定するために、免疫ブロッティングを伴うミニチュア2Dゲル電気泳動を行います。その結果から、タンパク質の全体的な発現状態を確認できます。等電点および分子量の違いに基づき、すべてのリガメント化および触媒産物における宿主の翻訳変化を提示します。

2D dashと2D monoloを組み合わせることで、発現変化に関する情報を同時に得ることができ、ニューロプロテオミクス分野における重要な疑問への回答に寄与します。産物の翻訳後修飾および異化作用について。まず、脳組織を回収し、ホモジナイズすることから始めます。ヒト脳組織の場合、抽出バッファーを用いて組織を10%重量対容量（w/v）で調製します。

ガラスピペッターを用いて組織をホモジナイズします。ただし、げっ歯類組織の場合はテフロンホモジナイザーを使用してホモジネートを分解させてください。60 hertzで0.5秒間のパルスを30回繰り返して超音波処理を行います。次に、BSAを標準物質としたBradford assayによりタンパク質濃度を定量します。

次に、クロロホルム・メタノール沈殿に使用する溶液を氷バケットに準備します。11 cmのIPGストリップには約125 µg、18 cmのIPGストリップには約1.25 mgを回収するように計画してください。溶液が4 °Cに達したら、沈殿操作をすべて氷上で行います。

まず、3容量のメタノールを加え、次に1容量のクロロホルムを加えます。この混合液を振り混ぜます。次に、3容量の冷水を加えます。

この混合物を1分間ボルテックスし、サンプルチューブを4°Cで12,000 Gsにて30分間遠心分離します。上清を吸引して廃棄します。次に、3倍量のメタノールを加え、同様にボルテックスおよびスピンダウンしてタンパク質を回収します。

2D DIGEを行う前に、回収したタンパク質ペレットを窒素ガス下で乾燥させます。タンパク質を2.5 mg/mLの2Dバッファーで再懸濁します。その後、使用するまで前述の手順に従ってサンプルをソニケーションします。

本ステップの開始前およびタンパク質沈殿後に、これらを-80°Cで保存してください。Bradford法により、再度タンパク質濃度を決定する必要があります。手順は、先に示したpsy dye標識前の手順と同様です。

タンパク質サンプルの品質を検証するため、SDS-PAGEを実施します。15 µgのタンパク質をLDSで希釈し、恒温槽またはヒートブロックを用いて37 °Cで加熱します。その後、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、クマシーブルー溶液で1時間以上ゲルを染色します。

その後、ゲルを7% acetic acidおよび10% ethanol溶液中で一晩静置します。タンパク質サンプルの品質が確認できたら、翌日にSD標識の手順を開始します。まず、ライセートのpHを測定します。pHは塩基性から中性である必要があります。

後続の反応における最適pHは8.6です。次に、各タンパク質サンプルについて色素結合反応の準備を行います。50 µgの試料に400 pmolのS3色素を、また別の50 µgの試料に400 pmolのS5色素を混合します。

これを4連（quadruplex）で実施し、1サンプルあたり計8回のDカップリング反応を行います。各テストサンプルに対し、疾患脳などのコントロール由来のタンパク質を用いて、相補的なDIカップリング反応セットを作成します。その後、各反応ペアに対して、400 picomolesのCY twoと、計250 microgramsの全タンパク質を均等に含ませた内部コントロール反応を設置します。

SAIラベル化は、すべての反応混合物を4 °Cの暗所で1時間インキュベートすることで行います。インキュベーション後、3種類の異なるシアニン反応の各セットを150 µLずつまとめ、200 µLの2Dバッファーを加えます。その後、2D電気泳動の手順に進みます。

まず、各サンプルおよびポジティブコントロールについて、タンパク質スポットを切り出すための分取用ゲルのための未標識タンパク質溶液を調製します。300〜350 µgの未標識タンパク質を2Dバッファーに分注し、IPGストリップに接触させて再水和させます。次に、IPGストリップをロードし、標識および未標識タンパク質を再水和させます。

次に、各ウェルをIPG反応ストリップで覆います。続いてミネラルオイルを重ね、25 °C以下で一晩、タンパク質溶液を用いてストリップをパッシブ再水和させます。翌日、IPGストリップの等電点電気泳動を行います。

その後、オイルを除去し、IPGストリップを-20°Cで保存して平衡化させます。平衡化バッファーに15分間浸漬します。次いで、ストリップをDTTを含まない平衡化バッファー中の4.7%IDOアセトアミドに転移させ、ストリップを浸します。

大型2Dゲルシステムを使用し、ラベル化タンパク質用に、低蛍光ガラスプレートを用いて1サンプルあたり4枚の12% SDS-PAGEゲルを作製します。また、非ラベル化タンパク質のそれぞれについて、厚さ1.5 mmの標準ガラスプレートを用いて1枚の12% SDS-PAGEゲルを作製します。これらが調製用ゲルとなります。

ゲルが冷却されたら、ストリップをゲルの上部に移し、冷却後に0.5% Arosをストリップに被せます。その後、4°Cで2.5ワットにて一晩電気泳動を行い、翌日に分析します。多くの2D反応は、分取用ゲルのためのタンパク質試料を用いて実施可能です。100 µg以下の試料を200 µLの2Dバッファーに分注します。

次に、サンプル混合物を激しくボルテックスし、短時間遠心分離します。サンプルを11 cmのIPGストリップにロードし、ミネラルオイルで覆った状態で一晩パッシブ再水和させます。翌日、等電点電気泳動を行います。

次に、ストリップを3つの平衡化バッファーが入った槽に順に移動させ、各槽で15分間処理します。その後、ストリップを2D SDS-PAGEゲルに展開します。各ストリップを、適切な分子量を持つプレキャストゲルの上に重ねます。

目的タンパク質のためにポリアクリルアミドゲルを用います。その後、ゲルをNITROCELLULOSE PVDF膜に転写し、本プロトコルの展開において抗体を用いて解析します。3種類の異なるライシスを行います。

バッファーの検討を行った。まず、生化学および分子生物学で一般的に使用されるバッファーであるTris SDSについて検討した。

Tris SDSは、別途テストしたUTSバッファーと比較して分解能が低かった。3つ目のバッファーについては、テストサンプルの調製が不可能であったため除外した。次に、ヒトおよびマウスの脳プロテオームを解析した。

ヒトの対照群皮質サンプルとAD（アルツハイマー病）皮質サンプルを比較した。また、AD様タウ病理を有するマウスの脳タンパク質についても、ヒトサンプルから同様に検討した。各Dについて、SCI 2、S SI 3、およびsci 5を独立して解析した。高いスポット分解能により、アライメントが容易に行えた。

定性的なミニ2D解析を用いて翻訳後修飾を調査したところ、脂肪組織におけるα-シヌクレインの配糖化プロファイルは正常でしたが、アスタリスクで示されるダイマーとしても検出されました。矢印はα-シヌクレインが検出された箇所を示しています。また、ミニ2Dによりユビキチン化アミロイド前駆体タンパク質も観察されました。

孤発性ADと家族性ADの比較を行いました。家族性ADでは、8 kDaのオリゴマーが検出されたため、アミロイドβ 1-42およびISOバリアンスの濃度が低下していました。このビデオを視聴することで、タンパク質発現修飾の測定による複雑なサンプルの比較を行い、プロテオームを解析する方法について十分に理解できるはずです。