Name: アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定緑膿菌ミニ himar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ mini-himar1マリナートランスポゾンを用いた緑膿菌のアルギン酸塩産生関連新規遺伝子の同定法。高密度挿入突然変異体ライブラリーの作成と遺伝子機能解析により、バイオフィルム形成と病原性に関わる調節機構を解明する。

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この作品は、生物医学研究の卓越性のためのウェストバージニア州のアイデアネットワークにアメリカ航空宇宙局ウェストバージニアスペースグラントコンソーシアム（NASA WVSGC）、嚢胞性線維症財団（CFF-YU11G0）およびNIH P20RR016477とP20GM103434によってサポートされていました。我々は、この作品について技術的な支援のためにVonya M·アイジンガーに感謝します。

1。細菌株の準備と二親共役<ol><li> E.接種 37℃で一晩振盪インキュベーター中ゲンタマイシンと場所の15μg/ mlのを補ったルリアブロス（LB）5ml中大腸菌 SM10/λpir/pFAC </li><li> Pを接種緑膿菌の菌株のLB 5ml中PAO1、そして42℃で一晩振とう培養器内の場所</li><li> OD一晩培養の600を測定し、PAO1とEの等量を混ぜる最終容量は1〜1.4ミリリットルの間であることを大腸菌 PFACは、。 </li><li> 5分間6000×gで遠心分離混合物。 </li><li>一方、結合のためにLBプレートを乾燥さ：10〜15分間、37℃のインキュベーター内で開いたプレートを残す。 </li><li>細胞混合物からの上清50μlが、すべてを削除します。 </li><li> 1コンパクト滴の乾燥をLBプレートに上清とピペットの残り50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>慎重に（IMPOを乾燥させるためにドラフト内でプレートを置きRTANT注：プレート上に広げ、細胞が、これは大幅に）結合の効率が低下しないようにしてください。 </li><li>液滴が乾燥した後、LBプレートを反転し、4〜6時間37℃でインキュベートする。 </li><li>細胞混合物をインキュベートしている間、ゲンタマイシン300μgの/ mlの大（150外径×15ミリメートル）PIAプレートを準備します。使用前に、15〜20分間、37℃のインキュベーター内に置くことにより、任意の残留水分を除去。 </li><li>細胞混合物のインキュベーションが完了した後、無菌の接種ループを用いて細胞を採取し、1mlのLB、ボルテックス、又はピペットを含有する微小遠心管中で、十分に混合する。 </li><li> 300μg/ mlのゲンタマイシンを含む大きなPIAプレートに細胞を均一に広げる。 （重要：この手順では、それは別々のプレートに細胞混合物の増加ボリュームを追加することをお勧めし（ 例えばプレート1：10μL、プレート2：50μL、プレート3：100μL、プレート4：500μL、 など ） 。 </li><li> 37℃で一晩インキュベートする。℃、 </li></ol> 2。ムコイドコロニーの検出と分離<ol><li>インキュベーターからプレートを取り外し、粘液状のコロニーについて検討する。 </li><li>小皿PIAとゲンタマイシン300μgの/ mlの（100外径×10ミリメートル）での分離のために、単一の粘液状コロニーと連勝を隔離する。 </li><li> 37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>前の晩培養物にステップ2.2を繰り返します。 </li><li>繰り返します粘液性分離株の安定性を決定するために、2.2から2.4までさらに2回繰り返します。 </li><li>最終的な分離株の工程の後に、単一の粘液状コロニーをLBの4.5ミリリットルを接種し、37℃で一晩シェーカーでインキュベート</li><li>次の日、それぞれの粘液性変異体のラベル3マイクロチューブ。 </li><li>ゲノムDNA抽出およびトランスポゾン挿入部位を同定するための2管（プロトコル3を参照）に一晩培養の2 1.25ミリリットルずつを準備します。 </li><li>さらに、appropriatに1ミリリットル一晩培養をピペッティングすることにより、各粘液性変異体をアーカイブ10パーセントスキムミルクを等量含むイーリーで標識されたクライオバイアル。 -86℃での​​ストア</li></ol> 3。 gDNAを制限消化および連結<ol><li>任意の好適な方法（ 例えば 、フェノール-クロロホルム、スピンカラムなど ） を使用して、粘液性変異株からのgDNAを抽出します。 </li><li> gDNAの濃度を決定するため、制限エンドヌクレアーゼSalIで2μgの1μlの総ダイジェスト、ウシ血清アルブミンをSalI酵素緩衝液（100mMのNaCl、50mMのトリス-HCl、10mMのMgCl 25μlの0.5μlの、1mMのジチオスレイトール（DTT）、室温でのpH 7.9）および50μlの全容量を達成するためのdH 2 Oの適切な体積。 </li><li> 37℃で一晩DNAを消化（重要：制限酵素の効率に応じて、一晩ダイジェストに追加1μLを加え、1〜2時間、37℃でインキュベートする必要があるかもしれないこれは一晩消化するために追加されます。） </li><li> DIGEを浄化任意の好適な方法（ 例えば 、アガロースゲル精製、スピンカラム）とバッファの25μlの溶出を使用してSTEDのDNA。 </li><li> 、〜10月20日NG /μLの好ましい濃度で精製したDNAの11μLを混合して消化されたDNAを連結ライゲーションバッファー（330 mMトリス - 酢酸pH7.5の、660 mMの酢酸カリウム、100 mM酢酸マグネシウム、5 mMと1.5μL DTT）、100 mMのATPと1μlのDNAリガーゼ1.5μL。 </li><li>室温で15分間混合物をインキュベートし、次いで70℃で15分間インキュベートすることによって酵素を不活性化（注：長いを室温で混合物をインキュベートすると、ライゲーションの成功を増加させることができる）。 </li></ol> 4。逆PCR（のiPCR）と配列解析<ol><li>以下のフォワードおよびリバースプライマーおよび熱サイクル条件を使用してライゲーション産物でのiPCRを実行します。 フォワードプライマー（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA - リバースプライマー（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA サーモサイコンディtions： 1。 1分間94℃に。 2。 1分間94℃に。 3。 2分間58℃に。 4。 2分間72℃に。 5。 8分間72℃に。 6。 10℃のホールド。 繰り返します34サイクルの2-4を繰り返します。 （注：増幅iPCRの製品は4℃で保存することができます） </li><li>成功のiPCR増幅を確認するために、アガロースゲル電気泳動を行う。 </li><li> Gm3OUTとGm5OUTプライマーを用いてのiPCR製品にシーケンシングを実行します。挿入部位とhimar1の向きが外にマッピングされます。 </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
<li>Franklin, M. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+analysis+and+cellular+localization+of+the+AlgI%2C+AlgJ%2C+and+AlgF+proteins+required+for+O+acetylation+of+alginate+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).</li>
<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
<li>Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis%3A+role+of+mucC+in+the+regulation+of+alginate+production+and+stress+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity.</a> Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).</li>
<li>Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+locus+determining+the+mucoid+status+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+AlgU+shows+sequence+similarities+with+a+Bacillus+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor.</a> J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+the+Crc+regulon+identifies+genus-wide+and+species-specific+targets+of+catabolite+repression+control+in+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria.</a> BMC Microbiol. 10, 300 (2010).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).</li>
<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

著者Hongwei D. YuはProgenesisテクノロジーズ、LLCの最高科学責任者および共同設立者です。

この方法は、これらの変化と他のシュードモナス種に使用することができることに留意することが重要である：P.インキュベートフルオレッセンスおよびP. 30℃でプチダ 、およびP. 42℃でのストチェリ ; P. stuzeriはゲンタマイシンの150μg/ mLのを追加したLBプレート上で培養しなければならない。ステップ1.11、Pにスタッツェリ細胞をLB500μlの代わりに、1ミリリットルに転送する必要があります。さらに、このプロトコルの2の重要なステップがあります。まず、受容株は、適切な温度で培養する必要があります。例えば、PAO1 15は、組換えの頻度を増加させるために42℃でインキュベートされるべきである。受容株が正しい温度で培養されていない場合場合は、変異体ライブラリーの効率が大幅に低下した。第二に、iPCRのは非常に再現性があるが、gDNAを、完全に円形の共有結合的に閉じられたDNAはDNA連結を介して行うことができることを確実にするために消化され...

アルギン酸塩を過剰にする日和見、グラム陰性病原体緑膿菌の能力は、バイオフィルムを確立する能力において主要な因子である。アルギン酸塩の過剰産生は、多くの場合、mucoidyと呼ばれる表現型である。嚢胞性線維症（CF）に罹患した個体の痰からムコイドのコロニーの単離は、慢性感染の指標であり、直接的に患者の健康1における全体的な減少と関連している。現在、それは理解されるP.におけるアルギン酸塩の調節および生産緑膿菌は、主に2つのオペロンで行われます。全体のアルギン酸塩ポリマーの合成と輸出を担当している（ 藻類 - ALG8 - alg44 - algK - 代数 - algG - algX - algL - algI - algJ - - algF algD）最初は、12の遺伝子が含まれているアルギン酸生合成オペロン、である外environmeにペリプラズムNT 2-5。二オペロンは遺伝子のクラスター代替シグマ因子algU / Tで始まり、 ムカ、mucB、およびMUCDと続いている。 mucAB-Dはアルギン酸塩の生産6-8の負の調節因子として分類されている間AlgU / Tは、正の調節因子である。さらに、異化代謝産物抑制制御、キナーゼ活性（KinB）と内タンパク質分解によってそのようなAlgB、AlgQ、AlgR、およびRpoNだけでなく、転写後および翻訳後修飾のような転写調節因子も、アルギン酸塩に関与することが示されているレギュレーション9月14日 。 PFACとして知られているミニhimar1トランスポゾンベクターは、もともとハーバード大学医学部15博士Mekalanos &#39;研究室で作成されました。 PFACプラスミドは2 27 BPSの逆方向反復と中央のゲンタマイシン耐性カセット（aacC1：534 BP）に挟まれた転移因子で構成され、hyperactをコードする遺伝子IVEはマリナートランスポザーゼ 16、および遺伝子をコードするβ-ラクタマーゼ（BLA）（ 図1）。 DQ366300 13：PFACの転移因子についての配列情報は、GenBankアクセッション番号で入手できます。 PFACにおいて、インバースPCRを用いて染色体挿入部位の同定のために使用されるaacC1遺伝子の背後にある複数のクローニング部位（MCS）が存在する。ミニhimar1トランスポゾンを使用する場合の1つの主要な利点は、特定の宿主因子を移調（誘発）のために必要ありませんです。また、Pのゲノムで発見TAジヌクレオチド挿入部位の高い存在があります緑膿菌 。それぞれのゲノムを、例えば、TAジヌクレオチド挿入部位はPAO1に94404と100229回発生（6264404 BPS、GenBankアクセッション番号NC_002516.2）とPA14（ジェンバンクアクセス番号NC_008463 6537648 BPS）。なぜなら、ゲノム中のTAジヌクレオチドの豊富さ、ミニhimar1 </em&gt;トランスポゾンは、毒性遺伝子の分析および高度に調節される遺伝子に特に適している高密度のランダム突然変異誘発を引き起こすことができる。理論的には、ミニhimar1トランスポゾンは、Pのゲノム内の任意の非必須遺伝子に挿入することができます緑膿菌 。これはPAO1ゲノムにおけるオープンリーディングフレームあたり約18のTA挿入部位を提供しています。 ここでは、P.中mucoidyの新規制御因子を特定するために、ミニhimar1トランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述緑膿菌 。具体的には、我々はbiparentally Eからミニhimar1トランスポゾンを含むPFACベクトル共役非ムコイド栄養PAO1株に大腸菌 SM10/λpir。トランスポゾンは、ゲノムに組み込まれた後、レシピエント株は、 大腸菌の増殖を阻害するトリクロサンを含有する、シュードモナス分離寒天（PIA）上で培養する大腸菌 。このように、の変異体のライブラリー<em&gt; P.緑膿菌は、ゲンタマイシンおよびムコイド表現型の存在を補充したPIAプレート上の増殖により選択することができる。真のトランスポゾン媒介統合変異対ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリン感受性表現型を持つことになります、注意してください。本研究では、PAO1の約8万挿入変異体は、4つの別々の動詞によって単離した。次に、ムコイド分離株についてスクリーニングし、制限酵素消化、ライゲーション、逆PCRにより挿入部位を決定した。私たちは、ゲノム当たりの挿入の数を確認するためのプローブとしてゲンタマイシン耐性カセットを用いてサザンブロット解析を行った。我々は、このプロトコルを使用してコンジュゲート当たりの得た変異体の90％以上がゲノム中にhimar1の単一コピーを持っていたし、ゲンタマイシン耐性およびカルベニシリンに敏感な表現型を示していると判断。 32粘液性分離株の合計が同定された、そのうちの22は、Pの異なる遺伝子座にマップされた緑膿菌 PAO1染色体。挿入このレートは、アルギン酸塩過剰生産のいくつかの新規制御因子を特定するために十分なカバレッジを提供します。

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas isolation agar</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Large Plates (150 O.D. x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ振とうインキュベーター</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィ</td>ック <td>イノーバ 4080</td><td>200 rpm</td></tr><tr><td>キャビネット インキュベーター</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>卓上型マイクロ遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度計</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>または好ましい方法/ベンダー</td></tr><tr><td>経由Diposable Inoculation Loops</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Cryogenic Vials</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 ml Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy血液と組織 (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>または推奨メソッド/ベンダー</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>または推奨メソッド/ベンダー</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>または推奨メソッド/</td></tr><tr><td>ベンダーFastLink II DNAライゲーションキット</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, restriction endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE アガロース</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 極低温バイアル</td><td>コーニング</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

緑膿菌は、汎用性の高い代謝機能を持つグラム陰性、環境細菌である。P.緑膿菌は、嚢胞性線維症（CF）患者における慢性肺感染症を確立日和見病原菌である。またmucoidyとして知られているアルギン酸と呼ばれる莢膜多糖の過剰産生は、抗生物質、化学療法および宿主防御に浮遊細胞よりも抵抗性がある粘液状のバイオフィルムの形成を促進する。また、粘液性の表現型への非ムコイドからの変換は、CFにおける慢性感染の発症のための臨床マーカーである。 P.によるアルギン酸塩過剰生産緑膿菌は重く細胞エネルギーを課税吸エルゴン過程である。したがって、アルギン酸塩生産はPに高度に規制されている緑膿菌 。より良いアルギン酸調節を理解するために、我々は、新規なアルギン酸塩レギュレータの同定のためのミニhimar1トランスポゾン突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述原型PAO1株におけるS。手順は、2つの基本ステップで構成されています。まず、ホストEからミニhimar1トランスポゾン（PFAC）に転送受信者P.に大腸菌 SM10/λpirゲンタマイシンを補充したシュードモナス分離寒天プレート上で選択した高密度の挿入変異体ライブラリーを作成するための共役二親を介して緑膿菌 PAO1。第二に、我々は、スクリーニングおよびゲンタマイシンカセットおよびDNA配列決定から外向きDNAプライマーを用いた逆PCRを介して挿入部位をマッピングするムコイドのコロニーを単離した。 （AlgTは、22を σ）は、野生型ムカマスターアルギン酸レギュレータAlgU抗シグマ因子ムカをコードするPAO1株で、このプロトコルを使用して、我々は2つの新規アルギン酸レギュレータを特定し、mucE（PA4033）とkinB（PA5484） 。このハイスループット突然変異誘発プロトコルは、結腸の変化を引き起こす他の病原性関連遺伝子の同定のために修飾することができるNY形態。

図1に示すように、ミニhimar1マリナートランスポゾンベクターは、PFACは、TAの挿入部位は、そのσ70依存性プロモーターとマルチクローニングサイト（MCS）と、aacC1ゲンタマイシン耐性カセットに隣接した2 27 bpの逆方向反復が含まれています。さらに、PFACベクトルは、高活性himar1トランスポザーゼ 、β-ラクタマーゼ（BLA）、およびTRA転送オペロンをコードする遺伝子が含まれています。 TAの挿入部位は、P.のゲノムへの効率的な統合を可能に緑膿菌菌株 。粘液性変異体を同定し、選択する際の精度は、アルギン酸塩の調節に関与する遺伝子座を決定する際の全体的な成功のために重要である。ムコイドおよび非ムコイド単離物の例は、 図1に示されている。 より正確に粘液性変異体を同定するために、完成した動詞は、複数の大規模なプレート（150ミリメートル）上にプレーす...

ここでは、画面に高密度の挿入変異体ライブラリーを生成するためのミニhimar1マリナートランスポゾンによる突然変異誘発を使用して、プロトコルを記述し隔離し、原型緑膿菌 PAO1株における新規アルギン酸レギュレータを識別します。

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

この手順の全般的な目的は、mini-Himar1トランスポゾンを介した変異導入を用い、Pseudomonas aerogenにおけるエキソ多糖アルギン酸の産生に関連する新規遺伝子を特定することです。これはまず、PACプラスミドを保持するドナー株E. coli Lambdapirと、レシピエント細胞であるPseudomonas aerogen PAO1の2種類の独立した overnight培養を行い、次いでE. coli LambdapirとPseudomonas aerogenを共培養させることでPACプラスミドを接合させることにより達成されます。PAO1およびトランスポゾン接合体はPseudomonas分離アガーで選別され、その後、斑点状のコロニーが特定され、PIAプレート上で分離されます。最終的に、Pseudomonas aeruginosa PAO1ゲノム内の挿入部位におけるmini-Tn5トランスポゾンの位置と向きが特定されます。最終的に、mini-Tn5トランスポゾン介在性変異導入を用いることで、Pseudomonas aeruginosaにおけるアルギネート産生に関連する遺伝子の特定と特性解析が行われます。この手法は、微生物学および細菌遺伝学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、異なる細胞機能の調節に関与する遺伝子座の特定などが挙げられ、本手順はwithersを用いて実施されることを示します。私の研究室の大学院生による、mini-Tn5 MarinerトランスポゾンベクターpFACは、マルチクローニングサイトの上流にSigma 70依存性プロモーターを持つGentamycin耐性カセットを挟む、TA挿入部位を備えた227 bpの逆反復配列を含んでいます。また、pFACベクターには、活性の高いTn5トランスポザー、ベータラクタマーゼ、およびTRA転送オペロンをコードする遺伝子が含まれています。TA挿入部位により、pseudomonas aerogen株のゲノムへの効率的な組み込みが可能になります。OID変異体を正確に同定し選択することは、アルギン酸調節に関与する遺伝子座を決定する全体の成功にとって極めて重要です。細菌株を調製するには、まずe coli SM 10 Lambda peer P facを、15 µg/mLのGentamycinを添加した5 mLのlbに接種し、同日に37 °Cの振盪インキュベーターで一晩培養します。P. aeruginosa strain PAO1を5 mLのLB培地に接種し、42 °Cの振盪インキュベーターで一晩培養します。翌日、一晩培養した培養液のOD 600を測定し、PAO1とE. coli P facを等量ずつ混合し、最終容量が1 mLから1.4 mLの間になるようにします。この混合液を6,000 ×gで5分間遠心分離します。その間に、接合用のLBプレートを37 °Cのインキュベーター内に10〜15分間開いた状態で放置し、乾燥させます。細胞混合液から上清を50 µLまで除き、その後、再懸濁します。細胞ペレットを回収した残りの50 µLの上清に懸濁させ、乾燥させたLBプレート上にピペットで分注します。1つのコンパクトな液滴状にし、プレートを慎重にドラフトチャンバー内に置いて乾燥させます。細胞がプレート上に広がらないように注意してください。これにより、接合効率が著しく低下します。液滴が乾燥したら、LBプレートを反転させ、細胞混合物をインキュベートしている間に、37°Cで4〜6時間インキュベートします。300 µg/mLのゲンタマイシンを含む、Pseudomonas isolation agar（PIA）プレートを準備します。インキュベーション後、滅菌した接種ループを用いて、細胞のシングルドロップを1 mLのLB培地を含むマイクロ遠心チューブに回収します。ボルテックスまたはピペッティングで十分に混合した後、細胞を大きなPIAプレート上に均等に塗布します。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出し、OIDコロニーを確認します。単一のmoidコロニーを分離し、PIAおよび300 µg/mLのGentamycinを含む小型プレートで分離画線塗布を行います。翌日、再び単一のmoidコロニーを分離し、画線塗布を繰り返します。この単一コロニー分離をさらに2回繰り返し、初回分離後のmoid分離株の安定性を確認します。LB 4.5 mLにOIDコロニーを単一植菌し、シェーカーを用いて37 °Cで一晩培養します。翌日、各OID変異株用にマイクロ遠心チューブに3本のラベルを貼ります。ゲノムDNA抽出およびトランスポゾン挿入部位の同定のため、一晩培養した菌液を1.25 mLずつ2本分分注して準備します。さらに、1 mLのオーバーナイト培養液を、同量の10%脱脂粉乳を含む適切にラベル付けされたクライオバイアルに分注し、各OID変異体を保存します。－86 °Cで保存してください。MOID変異体からgDNAを抽出した後、任意の調製法を用いて濃度を決定した後、合計 2 µg のDNAを 1 µL の制限酵素 S1 と共に、全量 50 µL の反応液で 37 °C で一晩消化します。消化したDNAを任意の精製法で全量 25 µL に精製し、そのうち約 11 µL のDNAを用いてライゲーション反応液を調製し、室温で少なくとも 15 分間インキュベートします。その後、70 °C で 15 分間加熱して酵素を失活させ、以下のフォワードおよびリバースプライマーならびにサーマルサイクル条件を用いて、ライゲーション産物のIPCRを行います。その後、AROSゲルで増幅を確認し、最終的にGM three outおよびGM five outプライマーを用いて反応産物をシーケンシングします。この図にMOIDおよび非MOID分離株の例を示します。このビデオで実演したプロトコルに基づくと、アルギン酸の過剰産生により、各接合によって15から20枚の大プレートにわたる約20,000個の変異株バンクが作成されるはずです。モイドコロニーは無色または白色で、クリーミーまたは粘液状の外観である必要があります。変異導入およびDNA増幅が成功していれば、この図に示すように、適切なサイズの単一のアンプリコンが検出されるはずです。PAO oneではIPCRアンプリコンは検出されません。しかしながら、PA O one VE twoおよびPA O one VE 13において、それぞれ約1,400 bpおよび約1,000 bpの単一のアンプリコンが検出されました。これらのアンプリコンのサイズは、PA oh one VE twoにおけるPA 4 0 3 3のプロモーター領域へのHE R one marinerトランスポゾンの挿入、およびPA oh one VE 13 PA oh oneゲノムDNAにおけるPA 5 4 84内部への挿入に対応しています。制限酵素消化およびライゲーションを行ったゲノムDNAを陰性対照として使用できます。したがって、この手法を習得すれば、適切に実施することで3〜4日で完了させることができます。この手順を行う際は、バイパレンタル接合の前に、細菌株を適切な温度で培養することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

のために導入遺伝子を産生する能力...

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感染関連遺伝子発現を研究するための嚢胞性線維症凝集体バイオフィルムモデル

学ぶ mini-himar1マリナートランスポゾンを用いた緑膿菌のアルギン酸塩産生関連新規遺伝子の同定法。高密度挿入突然変異体ライブラリーの作成と遺伝子機能解析により、バイオフィルム形成と病原性に関わる調節機構を解明する。

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定

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