Name: 細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶ糖ペプチドキャプチャー法による細胞表面膜タンパク質の濃縮とLC-MS解析。糖鎖酸化後の樹脂吸着とN-結合型糖ペプチドの遊離により、低存在量タンパク質の同定と定量が可能となる革新的なプロテオミクス技術です。

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この研究は、サイモンフレーザー大学のスタートアップ資金によって支えられてきた。

1。収穫膜<ol><li>細胞ペレット（〜10 8細胞）にプロテアーゼ阻害剤カクテル低張緩衝液（10mMトリス-HCl、10mMのKCl、1.5mMのMgCl 2、pH8.0）に加え、氷上で15-30分間インキュベートする。溶解注射針（5月10日パス）に試料を通すか、ダウンスホモジナイザー（15〜30ストローク）することにより、試料を均質化することにより、細胞。溶解の効率性をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を使用してください。 </li><li> 3000 GX 15分で溶解液の微分遠心分離によってミクロソーム画分を取得し、100,000 GX 2時間。最初の遠心分離は、核画分でペレットを取得し、上清のその後の遠心分離は、細胞膜ならびに膜結合オルガネラ8を含有するミクロソーム画分である第二のペレットを生成する。最終的な上清を細胞質画分である。さらにanalysために-80℃の冷凍庫にミクロソーム画分を保存以下に示すとおりである。 </li></ol> 2。、変性を溶かし、ダイジェスト膜タンパク質<ol><li>変性緩衝液（40mMトリス、10mMのEDTA、10mMのTCEP、0.5％Rapigest、pH8）中でミクロソーム画分を溶解し、次いで、10分間100℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>室温に加熱し、溶液を冷却し、8 Mの最終濃度に溶液に超高純度尿素粉末を添加し、30分間37℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 15mMの最終濃度まで試料にヨードアセトアミドストック溶液を追加し、サンプル中の遊離チオールをアルキル化するのに室温で30分間、暗所で溶液をインキュベートする。 10mMの最終濃度まで試料にDTTストック溶液を追加し、過剰のヨードアセトアミドをクエンチし、室温でさらに10分間溶液をインキュベートする。 </li><li> pH8の40mMトリス緩衝液で得られた溶液を10倍希釈し、続いてtrypsi 1:20の比率で試料にトリプシンを加える総蛋白のN。反応が完了したことを確認するために37℃のオーブンで一晩中消化反応を維持する。 </li><li> HClでpH1に試料溶液、また洗剤を分解条件、 すなわち Rapigestを酸性化することによって消化を終了します。 1時間37℃でRapigestを低下させ、遠心分離によって開発された降水量を削除します。 </li><li> C-18固相抽出（SPE）カートリッジにより、サンプルのペプチドが含まれており、スピードバックで得られた試​​料を乾燥上清を清掃してください。 </li><li>前および消化効率を確認するために、トリプシン消化後の試料のSDS-PAGE分析を実行する。 </li></ol> 3。糖ペプチドキャプチャ<ol><li>カップリングバッファー（100 mM酢酸ナトリウム、pH 5.5）中で洗浄さペプチドを溶解する。室温で、暗所で30分間10 mMの最終濃度でペプチド溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを追加します。これは、アルデヒドにグリカンシス - ジオール基を酸化する、ヒドラジド化学を介して樹脂に結合するためにグリカンを可能にする。室温で10分間、20mMの最終濃度およびpH 5で亜硫酸ナトリウムによって過度の過ヨウ素酸を消光する。 </li><li>樹脂に結合糖ペプチド1:4の比（溶液への樹脂）でのペプチド溶液にヒドラジド誘導体化樹脂をご紹介します。完全なカップリングのためのエンドツーエンドの回転に1〜2日間、37℃で反応をインキュベートする。 </li><li>以下の各1mlで二回、樹​​脂を洗浄することにより未結合ペプチドを除去：DI水、1.5 MのNaCl、メタノールおよび80％アセトニトリル。最後に、100mMのNH 4 HCO 3へのシステムのバッファを交換するためにpH8の100mMのNH 4 HCO 3 1mlで3回、樹脂を洗浄する。 <ol><li> （オプション）未結合のペプチドの分析のための上清および洗浄を収集します。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩のインキュベーションでのPNGアーゼFにより、樹脂からのN-グリコペプチドをリリースnはエンドツーエンドで回転。遠心分離し、80％のアセトニトリル洗浄によってリリースペプチドを収集します。 LC-MS分析のためのスピードバックで得られた溶液を乾燥させる。 </li></ol> 4。さらに分別（オプション） さらに、試料の複雑性を簡略化するために、得られたN-グリコペプチドを分画する。例えば10mmアンモニア蟻酸、20％アセトニトリルを用いてpHを3に乾燥したペプチドを再溶解し、ペプチドを分画する強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフィーを使用しています。得られた溶出液を乾燥し、次いで逆相LC-MS 8,17,18により得られたペプチド画分を分析する。 放出されたN-グリコペプチドの5。クリーニング（オプション） 懸念は、ペプチドの汚染の可能性のために上昇した場合、0.1％ギ酸に乾燥したペプチドを再溶解し、さらに、逆相LC-MS分析の前にペプチドをきれいにするMCX SPEカラムを使用しています。 <stronG&gt;注：データベース検索のパラメータを。 樹脂オフのN-グリコペプチドの選択的切断時には、PNGアーゼFは、アスパラギン酸とN-グリカンリンクアスパラギンに変換します。そのため、遊離されたN-グリコペプチドの0.9840ダマスシフトがあります。正確にこれらのペプチドを同定するために、この変更は、メチオニンのシステインおよび酸化カルバミドメチル化などの一般的な改変を加えた検索パラメータに追加する必要があります。

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<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、細胞表面タンパク質のプロファイリングのためのグリコペプチド捕獲戦略をご紹介します。この方法は、血液中、ならびに他の体液中または細胞培養培地中のもののような分泌タンパク質を研究するために適用することができる。 この方法の成功は、サンプルの完全消化に依存しています。従って、消化効率のSDS-PAGEの特徴付けは、特に、試料を初めて分析のために、必要である。完全な消化は、膜タンパク質のために挑戦することができ、唯一の膜画分を完全に可溶化した後に可能とすることができる。可溶化プロセスは、洗浄剤が導入されたときに開始され、尿素のインキュベーション後に終了する。曇りは、尿素を添加する前に、試料中の提示はなく尿素のインキュベーション後に消失するため場合、可溶化が十分である。膜画分が溶解するのが困難である場合、使用される界面活性剤の量を増加させる。膜が豊富な組織サンプル用脳および脂肪組織など、5％Rapigestを利用することができる。時には、降水量は前より頻繁にヒト血清サンプルで観察されるトリプシン消化にサンプルの希釈の際に表示されることがあります。この降水量の原因は、主に尿素と洗剤の...

細胞表面タンパク質は、細胞外環境と相互作用し、細胞の外側から内側への信号を中継する。従って、細胞外マトリックスタンパク質を含む、これらのタンパク質は、増殖、成長、移動、分化などから老化及び範囲細胞生物学及び生理学の全ての局面において重要な役割を果たす。表面タンパク質は、他の細胞、タンパク質および小分子3と相互作用することによって機能する。薬物の60％以上が細胞表面タンパク質4を標的とするような細胞表面タンパク質の分子特徴付けは、生物学者のためだけでなく、製薬会社のためだけでなく、非常に興味深い。 タンデム質量分析（MS）は、その優れた感度、精度、およびタンパク質およびペプチドの同定のためのスループットで、グローバルプロテオミクス研究5,6のための強力なツールとなっている。しかし、表面タンパク質として、MSに基づくプロテオミクスの重要な課題を提起ほとんどの表面タンパク質は、低量で重い変形が存在する。表面タンパク質の膜貫通領域は、それらを疎水性;これは、特にマルチパス膜貫通タンパク質の場合である。これは、界面活性剤の助けを借りずに、水溶液中の膜タンパク質を溶解することが困難である;しかし界面活性剤の使用は一般的にタンパク質の同定において、HPLCとMS 1,7,8の性能を抑制します。したがって、膜タンパク質が不十分直接LC-MSベースのプロテオミクスに特徴付けられている。 グリコシル化は、細胞表面タンパク質9で行われている最も重要かつ豊富な翻訳後修飾の一つである。グリカンの膨大な複雑さと不均一性は、ペプチドのMSシグナル10を妨げる。それにもかかわらず、いくつかのプロテオミクスの方法は、表面タンパク質を濃縮する前LC-MS分析にタンパク質から糖部分を除去するために、このユニークな変形例を使用している。これらの方法Sは、レクチンベースの親和性捕捉11とヒドラジド系、ホウ酸系化成キャプチャ12と同様に親水性クロマトグラフィー分離8,13が含まれています。グリカンの除去は、通常のタンパク質に膜タンパク質を変換し、劇的に、MSの特性評価を簡素化します。グリコシル化はまた、膜タンパク質とは対照的に、高い溶解性を有する分泌タンパク質で起こるので、多くのglycoproteomic方法は、可溶性タンパク質用に最適化され、膜タンパク質8,14に配備されたときに低い糖ペプチドの選択性および感度を有する傾向がある。他の方法も豊かにするために存在し、特に、超遠心分離15および標識戦略16を用いたものなどの細胞表面タンパク質。膜タンパク質を特徴付けるための手法や他の既存の方法の間の詳細な比較は最近17を実施し 、その結果は我々の手法は、同様に良好に実行できることが示され、もしされませんでしたすべて比べ膜プロテオミクス方法よりも、より良い、より高いシンプルさ。 研究者はこのメソッドを使用しやすくするため、ここでは詳細に一般的なプロトコル。この方法は、既存のグライコ戦略のいくつかの利点を統合し、膜糖タンパク質のために特別に考案されて、まだ方法は、分泌タンパク質についても同様に動作します。この方法の特徴は、1）膜タンパク質の完全な可溶化は、2）の代わりに固体撮像基板を用いた場合、潜在的な立体障害を排除する糖タンパク質の糖ペプチドの濃縮は、3）ヒドラジド化学の使用は、共有結合との間を形成すること結合したグリコペプチドは、高glycoselectivityためのストリンジェントの洗浄に耐えることができ、4）能力が減少したサンプルの損失短縮手順の持続時間のために一本のチューブにキャプチャ全体の手順を実施するように、糖ペプチドおよび撮像基板。変数を研究するためにこのメソッドを実装した後細胞及び組織を含む生物学的試料のETY、我々は、糖タンパク質8,17,18に対して高い選択性（&gt; 90％）を観察した。

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td></td><td>ΣA3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>過ヨウ素酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz ヒドラジドゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ワージントン バイオメディカル</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>オアシス MCX カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 コクテール</td><td>シグマ</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>アメルスコ</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>インベルターゼ</td><td>Σ</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 トリプシン</td><td>Σ</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>リボヌレアーゼ B</td><td>Σ</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>アビジン</td><td>Σ</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン</td><td>Σ</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>コンアルブミン</td><td>Σ</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

細胞外マトリックスタンパク質を含む細胞表面タンパク質は、例えば、増殖、分化、および増殖などの全ての主要な細胞プロセスおよび機能に関与する。これらのタンパク質の総合的特徴付けは、バイオマーカー探索、細胞型の識別、および薬剤ターゲットの選択だけでなく、細胞生物学や生理学の我々の理解を進めるために支援するための豊富な情報を提供します。表面タンパク質は、しかし、本質的に低いため、その存在量、高い疎水性、及び重翻訳後修飾のため、有意な分析的な課題を提起する。表面タンパク質に普及してグリコシル化を利用して、我々はここでいくつかの既存のN-グライコ手段の利点を統合し、高スループット糖ペプチド捕獲アプローチをご紹介します。本手法は、表面タンパク質由来の糖ペプチドを豊かにし、LC-MSを用いて容易なプロテオミクスのために彼らのグリカンを削除することができます。解決のN-glycoproteomeはINFと、タンパク質の同一性および量だけでなく、糖鎖付加の自分のサイトのormation。この方法は、癌、幹細胞、および薬物毒性を含む領域における一連の研究に適用されている。この方法の限界は、試料の比較的多量のサイトゾルタンパク質を中心に研究と比較してこの分析のために必要とされるように、表面膜タンパク質、低存在量である。

実験手順の代表的なフローチャートを図1に要約されている。標識およびさらなる分画工程は任意であり、詳細は最近の刊行物18に記載されている。別のオプションは、樹脂と反応しない非修飾ペプチドを分析することである。変更されていないペプチドを分析することの利点は、そのようなタイトジャンクショ​​ンにおけるクローディンのような非グリコシル化ペプチドおよびタンパク質の潜在的な識別を含む。さらなる利点は、より正確な定量化である。これらの利点に基づいて、我々は、このメソッドgのlycocapture-ssisted-GローブQ uantitative P roteomics（gagQP）と呼ばれ、最近の刊行物18で分析を詳述。 濃縮方法後に採取した代表的な糖ペプチドのスペクトルを図2に示す。得られた糖ペプチドにおいて、N-グリカンは、グリカン結合型アスパラギン（N）wを除去し、そしてPNGアーゼFによってアスパラギン酸（D）に変換した通りであり;し...

細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

この手順の全体的な目的は、低存在量の細胞表面膜タンパク質を濃縮することです。これは、まず膜タンパク質を変性・消化させることで達成されます。第二のステップでは、糖鎖を酸化させ、糖鎖修飾されたペプチドをレジン表面で捕捉します。その後、非糖ペプチドをレジンから洗浄して取り除きます。最終ステップは、lc MS分析のためにN結合型糖ペプチドをレジンから溶出させることです。最終的に、同定されたペプチド配列をタンパク質にマッピングすることで、同定および定量を行うことができます。本日は、Geicoペプチドキャプチャ法の仕組みについて実演します。糖タンパク質キャプチャなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、まず膜タンパク質を消化し、糖ペプチドのキャプチャを単一の容器内で行える点にあります。この技術の応用により、疾患バイオマーカーの探索を拡大することが可能です。gatorタンパク質は血液やその他の体液中に放出される可能性があり、病理学的プロセスに特異的な血中循環糖タンパク質は、予後および診断のバイオマーカーとして利用できる。まず、1:100のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む低張緩衝液を4 mL調製する。約10⁸個の細胞を含む細胞ペレットに低張緩衝液を1 mL加え、混合物を氷上で15〜30分間インキュベートする。その後、細胞を2 mLバイアルに移し、サンプルをシリンジ針で5〜10回通過させて細胞を溶解させる。次に、血球計数器とトリパンブルー染色を用いて計測します。溶解効率を確認するには、1 mLの溶解液に3 mLの低張緩衝液の残液を混合します。チューブを4 °Cで15分間、3000 ×gで遠心分離します。上清を超遠心管に移し、ペレットを-80 °Cのフリーザーで保存します。超遠心管を4 °C、100,000 ×gで2時間遠心分離します。次に、ミクロソーム画分を200 µLの変性バッファーで溶解し、溶液を100 °Cで10分間加熱します。加熱した溶液を室温まで冷却した後、超高純度尿素粉末を加えて最終濃度を8 Mにし、サンプルを37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベート後、500 mMのヨードアセトアミドストック溶液をサンプルに加え、最終濃度を15 mMにします。次に、溶液を室温かつ暗所で30分間インキュベートし、サンプル中の遊離チオール基をアルキル化します。その後、DTTストック溶液を最終濃度が10 millimolarになるようにサンプルに添加し、室温でさらに10分間インキュベートします。過剰なIodoacetamideをクエンチするため、得られた溶液をPH eightの40 millimolar trisバッファーで10倍に希釈し、続いて総タンパク質量の1/20の比率でトリプシンをサンプルに添加します。Bradford法を用いて全タンパク質量を定量します。反応を完全に完結させるため、消化反応を37 °Cのオーブン内で一晩維持します。終了後、10 mM 塩酸を用いて試料溶液をpH 1まで酸性にし、消化を停止させます。この条件はrapidestを分解させる効果もあります。その後、界面活性剤をインキュベーター内で37 °Cで1時間処理し、最も速やかに分解させます。インキュベーション後、遠心分離を行い、生じた沈殿物を除去します。サンプルペプチドを含む上清をC 18固相抽出カートリッジで精製し、得られたサンプルをSpeedVacで乾燥させます。消化効率を確認するため、トリプシン処理および消化の前後でサンプルのSDS-PAGE分析を行います。この時点で、精製したペプチドを200 µLのカップリングバッファーに溶解させます。その後、ペプチド溶液にピロリン酸ナトリウムを加え、最終濃度を10 mMにします。サンプルを室温で暗所に30分間インキュベートします。インキュベーション完了後、亜硫酸ナトリウムを加えて過剰なprateをクエンチし、最終濃度を20 millimolar、pHを5に調整します。室温で10分間インキュベートした後、あらかじめ平衡化した200 microlitersのhydrocyte誘導体樹脂溶液およびカップリングバッファーをペプチド溶液に導入します。完全にカップリングさせるため、反応液を37 degrees Celsiusで1〜2日間、エンドトゥエンド回転させながらインキュベートします。完了後、1 milliliterの脱イオン水、1 milliliterの1.5 molar塩化ナトリウム、1 milliliterのメタノール、および1 milliliterの80%アセトニトリルで樹脂を2回洗浄し、未結合のペプチドを除去します。次に、未結合ペプチドを分析するため、上清と洗浄液を回収します。サンプルは分析まで-80°Cのフリーザーで保存してください。その後、pH 8の100 mM重炭酸アンモニウム溶液1 mLを用いて、レジンを3回洗浄します。最後に、サンプルバイアルに300 µLの炭酸水素アンモニウムを加えます。樹脂からN-糖ペプチドを遊離させるため、PNGase Fを添加し、サンプルを37 °Cでエンドツーエンド回転させながらインキュベートします。続いて、遠心分離により放出されたペプチドを回収し、次に1 mLの80%アセトニトリルでレジンを洗浄します。洗浄液を先に回収したものと合わせます。最後に、得られた溶液をスピードバック（Speed VAC）で乾燥させ、lc MS分析に供します。濃縮法後に得られた糖ペプチドの非典型的な糖ペプチドスペクトルをここに示します。n-糖鎖が除去され、糖鎖が結合していた部位はPNGase Fによってアスパラギン酸に変換されました。したがって、このスペクトルは、一般的なタンパク質配列データベースに対して、任意のプロテオミクス検索エンジンを用いて容易に検索することが可能です。非定型LC-MS。捕捉されたN-糖ペプチドの結果をここに示します。細胞マイクロソーム画分の単一のLC-MSランから100種類以上の糖タンパク質を同定することが可能です。糖タンパク質および糖ペプチドの両方に対する濃縮選択性は、一般的に90%を超えます。SCXカラムとステップグラジエントを用いてさらに分画を行うことで、95%の濃縮選択性を得て解析を成功させることができます。LC-MS分析前のサンプル処理により、通常は糖タンパク質の同定数が倍増します。得られた糖ペプチドの量が少ない場合、バイアルから蓄積した不純物が最終サンプルに観察されることがあります。これらの汚染物質はMCXカラムによって除去することが可能です。このビデオをご覧いただくことで、私たちの糖ペプチドキャプチャー法を用いて自己組織化膜タンパク質を研究する方法について、十分な理解を深めていただければ幸いです。本プロトコルを実施する際は、トラブルシューティングのために各ステップのサンプルを別途保存しておくことが重要です。また、試薬の容量については、個々の研究目的に合わせて最適化することが可能です。

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レクチン抱合POROSビーズはHPLCに使用した。糖ペプチドの基準は、ポジティブとネガティブコントロールとして役立った。 MARS - 14欠乏、トリプシン消化したヒト血漿をクロマトグラフィー及びフロースルー（FT）と結合した分画はESI-LC-MS/MS分析のために収集された。...

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このプロトコールでは、がんの糖鎖生物学をより深く理解するために必要な複雑な腫瘍微小環境における不均一なグリコプロテオームに関する包括的な洞察を提供する統合オミクス技術である、グライコミクスガイド下グライコプロテオミクス法について詳しく説明します。...

グライコミクスガイド下グライコプロテオミクスは、複雑な腫瘍微小環境におけるグリコプロテオームの包括的なプロファイリングを容易にします 

学ぶ糖ペプチドキャプチャー法による細胞表面膜タンパク質の濃縮とLC-MS解析。糖鎖酸化後の樹脂吸着とN-結合型糖ペプチドの遊離により、低存在量タンパク質の同定と定量が可能となる革新的なプロテオミクス技術です。

細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

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