細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ
May 9th, 2014
細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。
この手順の全体的な目標は、存在量の少ない細胞表面膜タンパク質を濃縮することです。これは、最初に膜タンパク質を変性して消化することによって達成されます。第2のステップは、糖鎖を酸化し、グリコシル化ペプチドを樹脂表面に捕捉することです。
その後、非糖ペプチドを樹脂から洗い流します。最後のステップは、lc MS分析のためにN-Linked Glycopeptidesを樹脂から放出することです。最終的に、同定されたペプチド配列は、同定および定量のためにタンパク質にマッピングすることができます。
今日は、Geico peptide capture ralがどのように機能するかをお見せします。この技術の主な利点は、糖タンパク質の捕捉など、既存のものでは、膜タンパク質が最初に消化され、糖ペプチドの捕捉を1つの容器で実行できることです。この技術の応用は、疾患バイオマーカーの発見にまで及ぶ可能性があります。
ワニタンパク質は血液やその他の体液中に排出され、血液中の循環糖タンパク質は病理学的プロセスに特異的であるため、予後および診断バイオマーカーとして使用できます。まず、1〜100個のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む4ミリリットルの低張緩衝液を調製します。約10〜8番目の細胞を含む細胞ペレットに1ミリリットルの低張緩衝液を加え、混合物を15〜30分間インキュベートします氷上で、細胞を2ミリリットルのバイアルに移し、サンプルをシリンジ針に5〜10回通過させることにより細胞をシラミにします。
次に、ヘモサイトメーターとトライアンブルー染色を使用します。溶解の効率を確認するには、1ミリリットルのライセートと残りの3ミリリットルの低張緩衝液を組み合わせます。チューブをGの3000倍、摂氏4度で15分間回転させます。
スーパースーパークリッドを超遠心チューブに移し、ペレットをマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。超遠心チューブをGの100,000倍で摂氏4度で2時間回転させます。次に、ミクロソーム画分を200マイクロリットルの変性緩衝液に溶解し、次いで溶液を100°Cで10分間煮沸する。
加熱した溶液を室温まで冷却した後、超高純度尿素粉末を加えて最終濃度を8モルにし、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、500ミリモルを加えます。アセトアミド原液をサンプルに添加して、最終濃度を15ミリモルにします。
次に、溶液を室温で30分間暗所でインキュベートし、サンプル中の遊離チオールをアルキル化します。その後、モル DTT ストック溶液を 1 モルでサンプルに加え、最終濃度を 10 ミリモルにし、溶液を室温でさらに 10 分間インキュベートします。過剰なI otoアセトアミドを急冷するには、得られた溶液をPH 8の40ミリモルトリスバッファーで10倍希釈し、続いてトリプシンを総タンパク質量に対するトリプシンの1〜20の比率でサンプルに加えます。
Bradfordアッセイを使用して総タンパク質の量を取得します。消化反応を摂氏37度のオーブンで一晩維持し、反応が完了したことを確認します。終了したら、サンプル溶液を 10 ミリモルの塩酸で pH 1 に酸性化して分解を終了します。この状態も最も急速に分解します。
その後、洗剤はインキュベーター内で摂氏37度で最も急速に分解されます。インキュベーション後、遠心分離に続いて遠心分離することにより、発生した沈殿物を除去します。サンプルペプチドを含むSUPナチンをC 18固相抽出カートリッジで洗浄し、得られたサンプルを速度vacで乾燥させます。
トリップと分解の前後のサンプルのSDSページ分析を実行して、分解効率を確認します。この時点で、洗浄したペプチドを200マイクロリットルのカップリングバッファーに溶解します。ペプチド溶液に精製ナトリウムを添加して最終濃度を10ミリモルにした後。
インキュベーションが完了したら、亜硫酸ナトリウムで過剰なプレートを急冷し、最終濃度を20ミリモル、pHを5にした後、室温で10分間インキュベートし、200マイクロリットルのハイドロサイト誘導体樹脂溶液を導入し、平衡化およびカップリングバッファーをペプチド溶液に導入します。反応を摂氏37度で1〜2日間インキュベートし、エンドツーエンドの回転で完全に結合します。終了したら、1ミリリットルの脱イオン水、1ミリリットルの1.5モル塩化ナトリウム、1ミリリットルのメタノール、および1ミリリットルの80%アセトニトリルで樹脂を2回洗浄することにより、結合していないペプチドを除去します。
次に、上清と洗浄液を回収して、未結合ペプチドの分析を行います。分析まで、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。次に、1ミリリットルの100ミリモル重炭酸アンモニウムでpH8で樹脂を3回洗浄します。
最後に、300マイクロリットルの重炭酸アンモニウムをサンプルバイアルに加えます。N糖ペプチドを樹脂から放出します。PNG ACE Fを添加し、サンプルを摂氏37度でエンドツーエンドの回転でインキュベートします。
その後、放出されたペプチドを遠心分離により回収し、1ミリリットルの80%アセチルニトリルで樹脂を洗浄します。ウォッシュを以前に収集したものと組み合わせます。最後に、得られた溶液を速度VACで乾燥させ、lc MS分析を行います。
濃縮法後に採取した非定型糖ペプチドスペクトルを、得られた糖ペプチド中にここに示しています。n型糖鎖は除去され、軽蔑された糖鎖はP-N-G-A-Fによってスパルジン酸に変換されました。したがって、スペクトルは、一般的なタンパク質配列データベースに対して任意のプロテオミクス検索エンジンによって容易に検索できます。
非定型 lc MS.捕捉された n 個の糖ペプチドの結果を以下に示します。ここでは、細胞ミクロソーム画分の 1 回の lc MS 分析から 100 を超える糖タンパク質を同定できます。糖タンパク質と糖ペプチドの両方に対する濃縮選択性は一般に90%以上であり、成功した分析は、SCXカラムとステップグラジエントを使用してさらに分画することで95%の濃縮選択性を持つことができます。LCMS分析前のサンプルは、通常、糖タンパク質の同定数を2倍にします。
得られた糖ペプチドの量が少ない場合、バイアルから蓄積された不純物が最終サンプルで観察されることがあります。これらの汚染物質は、MCXカラムで除去できます。ですから、このビデオをご覧になった後、当社の糖ペプチド捕捉法を使用してセルフサービス膜タンパク質を研究する方法について十分に理解していただければ幸いです。
このプロトコルを試行している間は、トラブルシューティングのために各ステップのサンプルを確保することも重要です。試薬の容量も、特定の研究に合わせて最適化できます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、低含有量の細胞表面膜タンパク質を濃縮するためのグリコペプチド捕捉アプローチを提示します。この方法は、膜タンパク質の変性と消化、グリカンの酸化、そしてLC-MS分析のためのグリコシル化ペプチドの捕捉を含みます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- プロテオミクス
- 細胞生物学
- グリコバイオロジー
背景
- 細胞表面タンパク質は様々な生物学的機能に重要です。
- これらのタンパク質はしばしばグリコシル化されており、その安定性と相互作用に影響を与えます。
- 従来の方法では、低含有量のグリコシル化タンパク質を効果的に分離できないことがあります。
- LC-MSはタンパク質組成を分析するための強力な技術です。
研究の目的
- グリコシル化細胞表面タンパク質を濃縮する方法を開発すること。
- これらのタンパク質の同定と定量を容易にすること。
- プロテオミクス研究における低含有量タンパク質の分析を改善すること。
使用された方法
- 膜タンパク質の変性と消化。
- 捕捉の準備のためのグリカンの酸化。
- グリコシル化ペプチドの捕捉のための樹脂の使用。
- LC-MS分析のためのN-リンケージグリコペプチドの解離。
主要な結果
- 膜タンパク質からのグリコシル化ペプチドの成功的な濃縮。
- 特定のタンパク質に対応するペプチド配列の同定。
- 捕捉されたグリコペプチドに基づくタンパク質の定量。
- プロテオミクス分析におけるこの方法の有効性の実証。
結論
- グリコペプチド捕捉アプローチは細胞表面タンパク質の研究を強化します。
- この方法は様々なプロテオミクス分析に適用できます。
- 将来の研究では、この技術の応用を拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell surface proteomics faces challenges due to low abundance, hydrophobicity, and complex post-translational modifications, limiting biomarker discovery and drug target validation. This glycopeptide-capture method leverages prevalent N-glycosylation to enrich and analyze surface proteins, enabling improved target confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports translational biomarker identification and portfolio triage by providing quantitative, site-specific glycoproteome data from disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by clarifying surface protein expression and glycosylation patterns.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional target validation via enriched glycopeptide identification.
- Predictive Value: Enhances portfolio relevance by providing quantitative data for target prioritization and preclinical decision-making.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching low-abundance surface glycopeptides.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through consistent enrichment selectivity (>90%) and quantitative LC-MS outputs.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation via platform reuse across cancer, stem cell, and drug toxicity models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by identifying shed glycoproteins in biofluids linked to pathological processes.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by enabling site-specific glycosylation mapping and quantification.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biological de-risking and predictive confidence before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving N-glycoproteome identity, quantity, and glycosylation sites.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through enriched glycopeptide fractions suitable for LC-MS analysis.
- Analytics: Provides measurable readouts (peptide sequences, glycosylation sites, protein abundance) that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via biomarker-relevant glycoprotein detection in disease models and biofluids.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in surface protein function.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of glycopeptide enrichment for LC-MS workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative surface proteome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, glycobiology, and LC-MS sample preparation.
- Depends on instrumentation for ultracentrifugation, resin-based capture, and nanoLC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of digestion, oxidation, and capture protocols for reproducibility.
- Involves adaptation considerations for varying membrane protein abundance and glycosylation density across model systems.
- Limited by low surface membrane protein abundance, requiring larger sample quantities compared to cytosolic protein studies.
