レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

本手順の全体的な目的は、従来の光学顕微鏡と完全に互換性のある卓上装置を用いて、生物組織中の有機および無機元素をマッピングおよび定量化するための、簡便で堅牢な手法を提供することです。これは、目的の試料にレーザーパルスを照射して物質の分解とスパークを誘発させることで達成されます。このプラズマから放射される光を、その後分光計で分析します。

第2のステップは、目的元素に対応するスペクトル線をもって選択および同定し、試料表面をスキャンすることです。次に、元素濃度を決定できるようにするため、較正測定を行います。最後のステップは、記録されたすべてのスペクトルを用いて、相対強度または濃度スケールに基づいた試料組織の元素マッピングを構築することです。

最終的に、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS）を用いて、標識なしで様々な元素の組織分布を明らかにします。マイクロX線蛍光分析や質量分析ベースの手法などの既存の他手法と比較して、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS）は導入が容易であり、大気圧下で作動し、ほとんどの光学顕微鏡システムと互換性があります。

さらに、本手法ではマイクロメートル単位の分解能でPPMレベルの感度を達成することが可能です。この手法は、ナノ粒子のラベル化を必要とせずに、組織試料内における金属元素含有ナノ粒子の分布など、生物学的研究に応用されるナノテクノロジーにおける重要な課題の解決に寄与します。また、検出限界が低いため、体内のさまざまな臓器、特に脳に存在する可能性がある銅、鉄、アルミニウムなどの異常な金属元素の検出など、病理学への応用も期待できます。本手法を通じて、ナノ粒子の検出および同定に関する知見を得ることができます。

本手法は、TCU中の無機元素の検出や不均一な元素分布など、他のシステムにも適用可能です。このような実験を行う研究者は、サンプルに過度なダメージを与えずに最大限のシグナルを得るために、取得設定の調整に苦心することになります。まず、本プロトコルで解析するサンプルスライドを準備して、実験を開始してください。

ガドリニウムナノ粒子溶液を注入した腫瘍担持マウスから臓器を採取し、スライドを作成します。臓器を100 µmの厚さにスライスし、石英スライドまたはペトリ皿上に配置します。スライドは常に-80 °Cで保存してください。

次に、検量線作成用のサンプルを調製します。0 nMから5 mMまで、濃度を記載したラベルを数本のバイアルに貼ります。各バイアルに、適切な濃度のガドリニウム水溶液を100 µLずつ調製します。

完了後、スライドを準備します。1本目のバイアルから5 µLを量り取り、クオーツスライドまたはペトリ皿に滴下します。後で判別できるよう、必ず滴下した箇所を特定しておいてください。

円周方向に3 mm移動し、次の濃度の溶液を5 µLスライドに滴下します。残りの各溶液についても同様に操作します。スライド上の内容物を室温で20分間乾燥させます。

この実験系では、波長 1064 nm のビームを生成するナノ秒ネオジウムアルミナガーネットレーザーを使用します。ビームの一部を用いて分光計システムを同期させます。残りの部分は、実験全体を通してレーザーパルスエネルギーを調整および安定化させるために使用されるコンピューター制御のアッテネーターに通します。

次に、ビームをサンプルの領域に向けてください。ソフトウェア制御のトランスレーションステージ上にビームをフォーカスさせます。そこにサンプルマウントを設置し、CCDカメラでサンプル表面のマウントをモニターします。

もう一方はプラズマプルームのモニタリングに使用します。サンプル崩壊からの光を、-26 °Cに冷却したICCDカメラを備えたターン turner分光計で分析します。測定にあたっては、レーザーの安定化とカメラの-26 °Cへの冷却を開始してください。

実験の10分前に準備してください。準備が整ったら、アッテネーターを使用してパルスエネルギーを5 mJに固定します。次に、解析用のサンプルスライドを取り出し、サンプルステージに装着する準備をします。

電動サンプルホルダーにサンプルを固定します。固定が完了したら、コンピュータに戻ります。サンプルを配置するため、サンプルの一部がレーザービームに入るようにステージを移動させます。

レーザーの焦点を試料表面から約100 µm下に調整します。これにより、直径50 µm以下のクレーターが形成されます。コンピュータを使用して、分光計の入射スリット値を40 µmに設定し、マッピング測定用のICCDパラメータを設定します。

ホルダーの位置を調整し、サンプルの目的領域をターゲットにします。広帯域光源を用いて、サンプルの高解像度パノラマ画像を取得します。次に、ソフトウェアと取得した画像を用いて、LIBSスキャニング領域と解像度を定義します。

ここでは、グリッドを100×100とし、点間の間隔を100 µmに設定しています。グリッド上の各点におけるデータの自動取得を開始します。スペクトルが測定され、ファイルに記録されます。

約30分で測定が完了したら、サンプル切片の2枚目の画像を撮影し、その後、すべてのスペクトルを後の解析に使用するために1つのデータファイルに統合します。次に、サンプルスライドを取り外し、校正サンプルの装着準備をします。校正サンプルが付いたクオーツスライドを、コンピュータ側のトランスレーションステージに固定してください。

最初の校正サンプルの中心をレーザー光路に合わせます。実験パラメータを維持し、スペクトルを記録してください。異なるガドリニウム濃度の各サンプルについても同様の操作を行います。

これらは、腎臓組織の異なる領域から記録されたシングルショットスペクトルの例です。青色のスペクトルは腎臓の中央領域で記録されました。赤色のスペクトルは腎被膜に対応し、緑色のスペクトルは周辺領域のものです。

注入されたガドリニウムベースのナノ粒子は、ポリスラアンマトリックスで構成されており、その表面にはdocaリガンドによってキレートされたガドリニウムイオンが存在します。286 nmから320 nmの分光範囲では、ガドリニウム、カルシウム、鉄、ケイ素、およびアルミニウムを検出することが可能です。サンプルの異なる領域で強度が変化していることに注目してください。これは、これらの元素濃度に大きな不均一性があることを示唆しています。マウス腎臓切片におけるガドリニウム、ケイ素、および鉄の組織マッピングは、解像度約100 µmのLIBS（レーザー誘起ブレークダウン分光法）のデータを用いて行われました。

スケールの強度は任意単位で表されています。これは自然光画像です。比較として、腫瘍サンプルを用いて同様の結果が得られました。

このガドリニウムおよびSQ 20 B腫瘍組織のマップと同様に、自然光写真に擬似カラースケールが重ねられています。本実験では、ナノ粒子を腫瘍に直接投与しました。1時間後、腫瘍を摘出し、分析に供しました。

腫瘍体積の約半分に粒子が含まれていることに注意してください。この手法を適切に実施すれば、1 cm²のサンプルに対して解像度100 µmで1時間以内に完了させることができます。LIBSを行う際は、測定がレーザー誘起プラズマから行われることを念頭に置き、手順に従って実験全体を通じてすべてのパラメータを制御することが極めて重要です。

関心のあるプロセスの発生後に、関与している細胞の種類などのさらなる疑問を解消するため、隣接切片を用いて免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。この技術は、生物学および医学に適用されるナノテクノロジー分野の研究者が、生物組織内における金属元素を含む化合物の分布を探索する道を開きました。このビデオを視聴することで、生物組織中の多元素をマッピングするための LA-ICP-MS 技術の使用方法について十分に理解できるはずです。