Name: レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶレーザー誘起ブレークダウン分光法による生体組織内元素マッピングと定量化。100μmの高解像度とサブmM感度で、ガドリニウムナノ粒子などの金属元素分布を標識なしで可視化し、神経科学や病理学の研究に応用可能です。

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作者は感謝してLabex-Imustによって財政支援を認める。

1。生物試料の調製 この研究で説明されているすべての実験はCECCAPP（リヨン、フランス）（承認番号のLYONSUD_2012_004）の動物実験委員会によって承認された、そして実験が許可された個人（L. Sancey、DDPP承認番号の監督の下で実施した38 05 32）。 <ol><li> 、ガドリニウム（Gd）系ナノ粒子の100マイクロモルに、H 2 Oを1ミリリットルを追加し、15分待ってから、H 2 Oを100μLと80μlに、HEPES 5020μlのmMの、塩化ナトリウム1.325 M、 塩化カルシウム20ミリ追加のGd系ナノ粒子の一次溶液をすぐに注入を40mM（：ヴィルール、実験室での市）で200μlの溶液を得た。 </li><li>静脈麻酔し、腫瘍を有するげっ歯類（：リヨンシュッド（ウラン）、研究室から15キロ市）に200μLのGd系ナノ粒子液を注入する。 </li><li> 1月24日時間注射後、マウスを犠牲に液体窒素で冷却したイソペンタンへの生物学的サンプルを入れてDをサンプルで保存 - 80℃（市：リヨンシュッド（ウラン）、研究室から15キロ）。 </li><li>サンプルスライス（市：通常グルノーブル、研究室から100キロを、私はリヨンシュッドでのアクセスを持つようにしようとします）厚さ100μmのスライドで、特定のプラスチック皿（シャーレ）に生物学的なスライドを置く。 -80℃で保存 注意：プラスチック皿、基本的には非常に純粋なポリマーサンプルです。これらは、組織に含まれる要素との干渉を回避するために使用される。 </li></ol> キャリブレーションのための2。サンプル調製 <ol><li> （0 nMで、100nmであり、500nmであり、1μM、5μM、10μM、50、100μM、500μMの、1 mmであり、5 mM）を水の中にGdをベースナノ粒子の投与量の増加に伴って、バイアルを準備します。 </li><li>定期的にペトリ皿に3ミリメートルだけ離れた各溶液5μLドロップを置く。 </li><li> 20分間室温で乾燥した。 </li></ol>3。LIBS実験<ol><li> LIBSの設定​​を初期化する<ol><li>レーザー設定。楽器を切り替えた後、レーザパルスエネルギーの安定化のために10〜20分待ってから-20℃にICCDカメラの上下冷却アッテネータとパルスエネルギーを調整します。 注：マッピング組織に対する最適なレーザパラメータは、5ナノ秒のパルス持続時間、波長1064nm、及び約4ミリジュールのパルスエネルギーである。レーザー使用する典型的なのNdです：YAGレーザーナノ秒レーザー。 </li><li> LIBS設定。小さいクレーター径（約50μm以下）を得るために（試料表面に対する）レーザー焦点位置を設定します。 注意：これは100μmの試料表面下のレーザパルスカリゼーションに対応しています。 </li><li>分光器の設定。 1200本/ mm回折格子と高時間分解能ICCDカメラと組み合わせたツェルニーターナー分光計を使用してください。コンピュータですべてのこれらのデバイスを制御します。 40μmの入射スリット値を設定します。スペクトル範囲の再設定解析対象となる要素をゴルディング。スペクトルを高感度でのGdを検出するために、325から355 nmの範囲をカバーするだけでなく、ナトリウム、CuおよびCAを使用。 300ナノ秒の遅延、2秒のゲート、および200のゲインとICCDのパラメータを設定します。 </li></ol></li><li>マッピング測定<ol><li> LIBS電動試料ホルダーに生物学的サンプルを置きます。 </li><li>レーザーの焦点位置に応じて、試料の高さを調整します。 </li><li>サンプルスライスの高解像度の写真を撮る。 </li><li>約100μmの解像度を隔て、通常100×100の測定点でマップを実行するために、LIBS取得ソフトウェアのマッピングモジュールを設定します。 </li><li>取得を開始します。この時点からすべてを自動化する。配列ならびにスペクトル記録を移動して保存する。 40分間、10,000点（100μmの解決のために1cm 2の等価）のマッピングのために必要とされる。同じファイルに記録されたすべてのスペクトルを再編成する。 </li><li>場合には、Finished、サンプルスライスの2枚目の写真を撮る</li></ol></li><li>キャリブレーション測定</li></ol>同じ実験パラメータを用いて、（、調製の詳細はセクション2を参照）キャリブレーションサンプルを測定する。マップを実行するか、または較正液滴の各々に（ドロップの中央部の測定部位から得られた）25のスペクトルを記録する。 4 LIBSスペクトル解析：化学·イメージの構築 <ol><li>レコードのすべてのLIBS組織マッピングからのスペクトルとLIBSのソフトウェア解析でそれらをロードします。各スペクトルのベースラインを引き、偽色を使用して、相対強度スケールとの化学的画像を構築する。 注意：このアルゴリズムは、Gdの、銅、ナトリウム、またはCaなどの特定のライン強度を取得します。 </li><li>検量線の計算（強度と濃度との関係）を許可し、水溶液を構築するために校正されたサンプルから測定されたスペクトルに同じ操作を実行uantitativeマップや画像のGd（または関心のある他の要素）。 </li><li>このような補間やスムージングなどの化学画像に適切な治療法を適用します。画像フォーマット（ビットマップ）での強度や濃度マップを保存します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

生物学的サンプルに適用され、この技術は、異なる器官内に注射のGd系ナノ粒子からのGdとSiのマッピングと定量化、 すなわち 、化学イメージングを可能にする。主な重要な設定から、レーザ特性（波長、パルスエネルギー、フォーカス、および安定性）の制御が正確かつ細かい組織切除（ すなわちマッピング分解能）のためだけでなく、感度のために重要である。高エネルギーでの作業は良好な感度を提供しますが、残念ながら劣化した空間分解能を生成します。また、使用される分光器の種類を慎重にチェックする必要があります。基本的には、（例えばエシェル分光計を用いて）ブロードバンド調査は元素種の大規模な選択をできるようになりますが、低感度で、（ICCDまたはPMTを装備）ツェルニーターナー分光計を使用しながら、少ない要素を検出することができますが、はるかにより感度。プローブされた波長範囲の選択したすべての設定は、Pに調整する必要があります調査のurpose。 生物学的サンプル自体については、その厚さや硬度も、スペクトルの質を妨害する可能性があります。非常に薄い試料が完全に噴霧するこ...

生物学的用途のためのナノ粒子の広い開発は、生物学的サンプルでの定量化や画像化のための分析技術の並列改善を促した。通常、臓器中のナノ粒子の検出およびマッピングは、蛍光または共焦点顕微鏡法によって作製される。残念ながら、これらの方法は、特にその疎水性のために、非常に小さいナノ粒子、ナノ粒子の生体内分布を変更することができ、近赤外色素によるナノ粒子のラベル付けを必要とする。ラベルされたナノ粒子の検出、および特に非常に小さいナノ粒子（サイズ&lt;10 nm）は、このように全身の規模ではなく、組織および細胞レベルでその生体内分布を妨害する可能性があります。任意のラベルなしでナノ粒子を検出することができ、新しいデバイスの開発は、彼らの行動や反応速度の研究のための新たな可能性を提供しています。さらに、脳内の鉄や銅などの微量元素の役割は、傷病アルツハイマー1、メンケス2,3、またはウィルソン4などのDの神経変性疾患は、組織におけるこれらの要素を研究し、ローカライズするために興味をお勧めします。 様々な技術が、異なる材料の元素マッピング又は微量分析を提供するために使用されてきた。 2006年に公開された彼らのレビュー論文では、R. Lobinski らは、生物学的環境、分析科学5のための最も挑戦的な環境の一つでの微量元素分析のために利用可能な標準的な技術の概要を説明しました。元素濃度が十分であれば、透過型電子顕微鏡におけるエネルギー分散型X線マイクロアナリシスから成り電子マイクロプローブが、多数の研究に適用することができる（&gt; 100〜1,000μgの/ g）であった。検出下限に到達するために、以下の技術が使用されている。 <ul><li>用いたイオンビームマイクロ粒子励起X線発光μ-PIXE（1月10日μgの/ g）を6 </li><li> SYNchrotron放射微量分析μ-SXRF（0.1〜1μgの/ g）を7 </li><li>二次イオン質量分析法（SIMS 0.1μgの/ g）を8 </li><li> （/ gの0.01μgのまで）レーザーアブレーション誘導結合質量分析、LA-ICP-MS 9,10 </li></ul> Lobinski らから抽出された表1に示すように、上記の技術は、マイクロメートル分解能を提供する。 シリアル2D調査の3次元再構成も深部組織11の再構築のために提案することができた。しかし、すべてのデバイスとシステムが両方の高い高価な機器への適度な有資格の専門家、および長期的な実験（μ-SXRF用×100〜100μmでとLA-ICP-MS用のX 10ミリメートル10ミリメートルのため、通常以上の4時間を必要とする）12。要するに、これらの要件は、微量元素分析が非常に制限し、従来の光学イメージングシステムとの互換性が確認蛍光顕微鏡や非線形顕微鏡。ここで言及することができますもう一つのポイントは、定量的な測定能力はまだかなり限られており、マトリックスマッチング実験室の規格の利用可能性に依存することである。さらに、業界プロセスにおける微量元素分析の利用の一般化、地質学、生物学、アプリケーションの他のドメインは、重要な概念や技術革新を生成します。 現在の原稿の目的は、従来の光学顕微鏡と完全な互換性を卓上計測機器との生物学的組織における定量元素マッピング（または微量元素分析）のためのソリューションを提案することである。我々のアプローチは、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS技術）に基づいています。 LIBSに、レーザーパルスは、材料の破壊や火花を作成するために、対象サンプルに焦点を当てています。血漿中に放出された原子放射線は、その後、分光計とエレメンによって解析されているTAL濃度は13,14予め行わ較正測定で取得できます。 LIBSの利点は、感度（μgの/ gで、ほぼすべての要素）、コンパクト、非常に基本的なサンプル調製、試料との接触がない場合、瞬時の応答と正確にローカライズされた（マイクロ）表面分析が含まれています。組織のレーザアブレーションは、微細に一緒μgの/ gの範囲15,16内の感度で高空間分解能でマッピングを行うように制御しなければならないので、組織化学的画像化の適用は困難なままである。 このようなソリューションでは、トレーサーまたは標識剤の付加は、生物学的組織におけるそれらのネイティブ環境で直接無機元素を検出することを可能にする、必要とされていません。我々の研究室で開発されたLIBS機器が可能に0.1 mMの16に相当35μgの/ g未満のGdの推定感度が100μmよりも劣っ現在の解像度を提供しています大規模なサンプルのマッピング（&gt; 1 cm 2）を 30分以内。また、自家製のソフトウェアは、データの取得や活用を促進します。この器具は、（Gdの）マップを検出し、およびガドリニウムの組織分布を定量化するために使用される系ナノ粒子17 -小動物から腎臓および腫瘍サンプル18 1〜24時間の粒子の静脈内注射（サイズ&lt;5 nm）の後に。例えば、鉄、カルシウム、ナトリウム、及びPのような本質的に、生体組織に含まれる無機元素は、、、も検出し、画像化されている。

<table><tbody><tr><td>レーザーナノ秒 Nd:YAG</td><td>Quantel</td><td>Brillant</td><td>5 nsec パルス幅、波長 1,064 nm</td></tr><tr><td>分光器 Andor</td><td>Technology</td><td>Shamrock 303</td><td>with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating</td></tr> detector <tr><td>ICCD</td><td>Andor Technology</td><td>Istar</td><td>2 nsec 時間分解能</td></tr><tr><td>LIBS ユニット</td><td>ILM</td><td></td><td>自家製計装</td></tr><tr><td>Gd ベースナノ粒子</td><td>ナノH</td><td></td><td>粒子</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>粒子希釈用</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr> 粒子希釈用 <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td> 粒子希釈<td>マウス</td></tr><tr><td></td><td>チャールズ川</td> 動物<td>飼育による</td><td></td></tr><tr>イ<td>ソフルラン</td><td>Coveto / Virbac</td><td></td>麻酔<td>用 - イソフルラナム</td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59060</td><td>サンプルを凍結する&nbsp;ゆっくりと</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>エアリキードイ</td><td></td><td>ソペンタン</td></tr><tr><td>Cryostat</td>ライ<td>カ</td><td>CM-3050S</td>を<td>冷却してサンプルをスライドさせる</td></tr>ペ<tr><td>トリ皿</td><td>ダッチャー</td><td>353004</td><td>を貼り付ける見本</td></tr></tbody></table>

レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

レーザ誘起プラズマの発光分光法は、生体試料の元素分析に適用した。レーザ誘起ブレークダウン分光法（LIBS）げっ歯類組織の薄切片上で行わ：、腎臓および腫瘍例えば、（i）のNa、Ca、CuやMgの、P、及びFe等の無機元素の検出を可能にする、体内に自然に存在し（II）SiとGdが、ガドリニウム系ナノ粒子の注入後に検出。動物は、粒子の静脈内注射後1〜24時間後に安楽死させた。試料の二次元走査が、赤外レーザ光 ​​が横解像度が100未満μmは表面を探索させ、電動マイクロメートル3Dステージを用いて行わ。臓器内部のGd元素の定量化学画像は、サブmMの感度が得られた。 LIBSは、特定のlabeliなしに無機材料の分布を研究するためのシンプルかつ堅牢な方法を提供していますNG。 、元素、分子、または細胞：さらに、標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの適合性は、応答の異なる種類の同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。

図1に示すように、Ndをビームが：1064nmの基本波長でのYAGレーザは50ミリメートルの焦点距離の石英レンズにより組織切片上に垂直に集中していた。パルスエネルギーは4ミリジュール及び繰返し率10Hzであった。空気中でプラズマの発生を回避するために、レーザビームが試料の表面下100μmの周りに集中していた。空気プラズマは、この状態で観察されなかった。実験の間、サンプルは、サンプル（単発）上の1つの位置における1つのプラズマを生成するためにステップモータによって移動された。基板上に生成されたクレーターの顕微鏡観察は、50μmよりも低いクレーターの直径を示した。生成されたプラズマは、（300 nmでブレーズ）1mmあたり1200ラインの格子を搭載したツェルニーチューナー分光器へのもう一方の端に接続された光ファイバの入口の上にレンズのカップルが画像化した。 ICCDカメラは、分光器の出力焦点面に搭載されたスペクトルを記録します。測定中に、（レーザ焦点位置に関して）試料表面の高さは、試料表面上の低電力のcwレーザダイオードやCCD監視カメラから斜めに入射ビームを三角法を用いて監視される。 ICCDは、レーザ...

薄い臓器や腫瘍組織で実行レーザー誘起ブレークダウン分光法は、成功したGd系ナノ粒子から発行された自然の要素と人工的に注入されたガドリニウム（Gd）を検出しました。化学元素の画像が100μmであり、定量的なサブミリ感度の解像度に達した。標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの相溶性が同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

本手順の全体的な目的は、従来の光学顕微鏡と完全に互換性のある卓上装置を用いて、生物組織中の有機および無機元素をマッピングおよび定量化するための、簡便で堅牢な手法を提供することです。これは、目的の試料にレーザーパルスを照射して物質の分解とスパークを誘発させることで達成されます。このプラズマから放射される光を、その後分光計で分析します。第2のステップは、目的元素に対応するスペクトル線をもって選択および同定し、試料表面をスキャンすることです。次に、元素濃度を決定できるようにするため、較正測定を行います。最後のステップは、記録されたすべてのスペクトルを用いて、相対強度または濃度スケールに基づいた試料組織の元素マッピングを構築することです。最終的に、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS）を用いて、標識なしで様々な元素の組織分布を明らかにします。マイクロX線蛍光分析や質量分析ベースの手法などの既存の他手法と比較して、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS）は導入が容易であり、大気圧下で作動し、ほとんどの光学顕微鏡システムと互換性があります。さらに、本手法ではマイクロメートル単位の分解能でPPMレベルの感度を達成することが可能です。この手法は、ナノ粒子のラベル化を必要とせずに、組織試料内における金属元素含有ナノ粒子の分布など、生物学的研究に応用されるナノテクノロジーにおける重要な課題の解決に寄与します。また、検出限界が低いため、体内のさまざまな臓器、特に脳に存在する可能性がある銅、鉄、アルミニウムなどの異常な金属元素の検出など、病理学への応用も期待できます。本手法を通じて、ナノ粒子の検出および同定に関する知見を得ることができます。本手法は、TCU中の無機元素の検出や不均一な元素分布など、他のシステムにも適用可能です。このような実験を行う研究者は、サンプルに過度なダメージを与えずに最大限のシグナルを得るために、取得設定の調整に苦心することになります。まず、本プロトコルで解析するサンプルスライドを準備して、実験を開始してください。ガドリニウムナノ粒子溶液を注入した腫瘍担持マウスから臓器を採取し、スライドを作成します。臓器を100 µmの厚さにスライスし、石英スライドまたはペトリ皿上に配置します。スライドは常に-80 °Cで保存してください。次に、検量線作成用のサンプルを調製します。0 nMから5 mMまで、濃度を記載したラベルを数本のバイアルに貼ります。各バイアルに、適切な濃度のガドリニウム水溶液を100 µLずつ調製します。完了後、スライドを準備します。1本目のバイアルから5 µLを量り取り、クオーツスライドまたはペトリ皿に滴下します。後で判別できるよう、必ず滴下した箇所を特定しておいてください。円周方向に3 mm移動し、次の濃度の溶液を5 µLスライドに滴下します。残りの各溶液についても同様に操作します。スライド上の内容物を室温で20分間乾燥させます。この実験系では、波長 1064 nm のビームを生成するナノ秒ネオジウムアルミナガーネットレーザーを使用します。ビームの一部を用いて分光計システムを同期させます。残りの部分は、実験全体を通してレーザーパルスエネルギーを調整および安定化させるために使用されるコンピューター制御のアッテネーターに通します。次に、ビームをサンプルの領域に向けてください。ソフトウェア制御のトランスレーションステージ上にビームをフォーカスさせます。そこにサンプルマウントを設置し、CCDカメラでサンプル表面のマウントをモニターします。もう一方はプラズマプルームのモニタリングに使用します。サンプル崩壊からの光を、-26 °Cに冷却したICCDカメラを備えたターン turner分光計で分析します。測定にあたっては、レーザーの安定化とカメラの-26 °Cへの冷却を開始してください。実験の10分前に準備してください。準備が整ったら、アッテネーターを使用してパルスエネルギーを5 mJに固定します。次に、解析用のサンプルスライドを取り出し、サンプルステージに装着する準備をします。電動サンプルホルダーにサンプルを固定します。固定が完了したら、コンピュータに戻ります。サンプルを配置するため、サンプルの一部がレーザービームに入るようにステージを移動させます。レーザーの焦点を試料表面から約100 µm下に調整します。これにより、直径50 µm以下のクレーターが形成されます。コンピュータを使用して、分光計の入射スリット値を40 µmに設定し、マッピング測定用のICCDパラメータを設定します。ホルダーの位置を調整し、サンプルの目的領域をターゲットにします。広帯域光源を用いて、サンプルの高解像度パノラマ画像を取得します。次に、ソフトウェアと取得した画像を用いて、LIBSスキャニング領域と解像度を定義します。ここでは、グリッドを100×100とし、点間の間隔を100 µmに設定しています。グリッド上の各点におけるデータの自動取得を開始します。スペクトルが測定され、ファイルに記録されます。約30分で測定が完了したら、サンプル切片の2枚目の画像を撮影し、その後、すべてのスペクトルを後の解析に使用するために1つのデータファイルに統合します。次に、サンプルスライドを取り外し、校正サンプルの装着準備をします。校正サンプルが付いたクオーツスライドを、コンピュータ側のトランスレーションステージに固定してください。最初の校正サンプルの中心をレーザー光路に合わせます。実験パラメータを維持し、スペクトルを記録してください。異なるガドリニウム濃度の各サンプルについても同様の操作を行います。これらは、腎臓組織の異なる領域から記録されたシングルショットスペクトルの例です。青色のスペクトルは腎臓の中央領域で記録されました。赤色のスペクトルは腎被膜に対応し、緑色のスペクトルは周辺領域のものです。注入されたガドリニウムベースのナノ粒子は、ポリスラアンマトリックスで構成されており、その表面にはdocaリガンドによってキレートされたガドリニウムイオンが存在します。286 nmから320 nmの分光範囲では、ガドリニウム、カルシウム、鉄、ケイ素、およびアルミニウムを検出することが可能です。サンプルの異なる領域で強度が変化していることに注目してください。これは、これらの元素濃度に大きな不均一性があることを示唆しています。マウス腎臓切片におけるガドリニウム、ケイ素、および鉄の組織マッピングは、解像度約100 µmのLIBS（レーザー誘起ブレークダウン分光法）のデータを用いて行われました。スケールの強度は任意単位で表されています。これは自然光画像です。比較として、腫瘍サンプルを用いて同様の結果が得られました。このガドリニウムおよびSQ 20 B腫瘍組織のマップと同様に、自然光写真に擬似カラースケールが重ねられています。本実験では、ナノ粒子を腫瘍に直接投与しました。1時間後、腫瘍を摘出し、分析に供しました。腫瘍体積の約半分に粒子が含まれていることに注意してください。この手法を適切に実施すれば、1 cm²のサンプルに対して解像度100 µmで1時間以内に完了させることができます。LIBSを行う際は、測定がレーザー誘起プラズマから行われることを念頭に置き、手順に従って実験全体を通じてすべてのパラメータを制御することが極めて重要です。関心のあるプロセスの発生後に、関与している細胞の種類などのさらなる疑問を解消するため、隣接切片を用いて免疫組織化学などの他の手法を実施することができます。この技術は、生物学および医学に適用されるナノテクノロジー分野の研究者が、生物組織内における金属元素を含む化合物の分布を探索する道を開きました。このビデオを視聴することで、生物組織中の多元素をマッピングするための LA-ICP-MS 技術の使用方法について十分に理解できるはずです。

laser-induced-breakdown-spectroscopy-new-approach-for-nanoparticle-s

Research

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工学

レーザーアブレーションのエレクトロスプレーイオン化（LAESI）は質量分析用大気圧イオン源です。イメージングモードでは、中赤外レーザーのプローブは組織切片またはバイオフィルム全体の分子の分布。この手法は、ネイティブの実験条件の下で実施、多様な生物分析研究のための新しいアプローチを提示。...

LAESI質量分析による生体組織とバイオフィルムの大気圧分子イメージング

出典:Hare, D. J., et.al.レーザーアブレーション-誘導結合プラズマ-質量分析(LA-ICP-MS)による脳組織中の金属のイメージング。J. Vis. Exp.

レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法によるマウス脳組織中の金属の可視化

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レーザー誘起分解分光法による真空誘導融解の定量分析

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レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

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