Name: 基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ一次筋原前駆細胞培養法。硬骨魚の上軸筋を解剖し、機械的・酵素的解離を経てラミニン基質上で培養することで、非哺乳類の筋発生メカニズムをin vitroで解明する効率的なプロトコルを確立します。

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著者は、博士に感謝を申し上げます。小さな魚や両生類にこの培養プロトコルの開発と応用での専門知識のためのジョセップPlanasは、フアンカスティーヨ。おかげで、原因疲れを知らずにマシューは、Delciクリステンセン、ザカリー·ファウラー、ブルック·フランツェン、ネイサンフレーリッヒ、キラマーシャルの充電など、多くの魚（種内および数の両方）からの筋組織の切開および解離を支援してきた無数の個人にもあるベン·メイヤー、イーサンRemily、およびSinibaldoロメロ。この作品は、PRBにセンタープロテアーゼ研究所NIHのグラント＃2P20 RR015566、NIHのグラントNIAMS＃R03AR055350とノシュアドバンスFORWARDためのNSFグラント＃HRD-0811239、生物スタートアップ資金のバーミンガム学科のアラバマ大学によってサポートされていました。サポートもUABの栄養肥満研究センター賞＃P30DK056336、NIH NIDDKによって提供された。 その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもないNIHの公式見解を表しています。

倫理に関する声明：本明細書中に記載の脊椎動物を含むすべての実験はバーミンガムのアラバマ大学の制度的動物実験委員会が事前に承認され、実験動物福祉局によって確立されたガイドラインと一致しているし、米国の国立衛生研究所保健社会福祉省。 文化1。準備<ol><li> 9のNaHCO 3（2 1L当たり1.51グラム）を、DMEM中の20のHEPES（2 1L当たり9.53グラム）（; 2 1L当たり26.96グラム13.48グラム/ L）を次のように基本培地を準備します。 <ol><li> pHを測定し、HClまたはNaOHで7.40に調整します。 </li><li>浸透圧を決定し、（必要な場合）のNaClで〜300ミリオスモルに調整します。 </li><li>フィルタは、最大2〜3ヶ月間、光から保護し、4℃で、（2）1 L真空滅菌システムおよびストアを使用して滅菌する。 注：完全な試薬について表1と表2を参照して、ツール、consumABLES、および機器情報。 </li></ol></li><li>超純滅菌水50ml中のγ線を照射したポリ-L-リシン（平均&gt; 300,000分子量）5mgを溶解することにより、ポリ-L-リジン処理プレートを調製する。リジンのポリマーの完全な溶解を確実に室温で10分間、反転により穏やかに混合する。 </li><li>プレートタイプ（ 表3）によれば、各ウェルにポリ-L-リジン溶液の必要量をピペット。プレートを5分間層流フード内に放置する。 </li><li>次に、ポリ-L-リジン溶液を除去し、滅菌水で2回洗浄する。 20分間層流フード内で空気乾燥にプレートを許可します。 </li><li>ラミニン1mgの（エンゲルブレス - ホルム - スウォーム起点）を入手し、20μgの/ mlの最終濃度になるように基礎培地50mlに溶解する。個/ cm 2で2μgのポリ-L-リジン処理した細胞培養プレートにラミニン溶液を適用する。 （異なるプレートサイズについては表3を参照されたい） </li><li>優しくFUを確保するためのソリューションを旋回カバレッジ良くLL。 24時間インキュベーターに実験室のテープと場所でプレートをシール。インキュベーターは、使用される種にとって適切な温度（ 表7参照）に設定する必要があり、追加のガスは、インキュベーターに添加する必要はない。 注：ラミニンは細胞を播種前に24時間プレートに付着させなければなりません。そうしないと、無細胞接着が悪いことになります。 </li><li> 表4で説明したように、メディアを準備します。完全培地を最大限に活用の日を準備する。 </li><li>組織分離のための準備として、以下の項目オートクレーブを組み立てる：300〜500ミリリットルビーカー（S）;ガラスペトリ皿;メスのハンドル;鉗子（微調整と粗）;解剖はさみ;と撥水性オートクレーブ紙数枚。 注：解剖プロセスを支援するユーザー毎に、（2）、メスハンドル、（1）鉗子（タイプは個人的な好みに応じて）、（1）解剖はさみ、および撥水性オートクレーブ紙の（5-10）シートがあります十分。 </li><li>上記のオートクレーブ処理項目に加えて、70％エタノール、重量バランス、無菌の50mlコニカルチューブ（番号は培養物のサイズに依存する）、及び氷を組み立てる。 </li></ol> 2。組織切開<ol><li>開始前に、魚の十分な在庫があることを確認してください。 注：使用される魚の年齢は非常に重要である。 2つの異なる種の魚が同じような重みのかもしれないが、1種の若い魚が別の種の古い魚よりも多くのMPCを有することになる。原則、サケ科と協力し、特に若い魚として、最高です。 （15グラムまで）、年齢のサケ科魚類4〜6ヶ月歳以下が最適である一方danioninsについては、1年と同じくらい古い魚は、最適に利用することができます。 </li><li>解剖される組織の各5グラム、滅菌した50mlコニカルチューブに分離培地の一定量25ミリリットルのため。 </li><li> 、レコードの質量、個数管（群）を秤量する。氷の上にチューブを置きます。 </li><li> 2月3日の魚を安楽死させる&gt; 300 mg / Lの重炭酸ナトリウム緩衝化トリカインメタンの浸漬することにより、一度に。 &gt; 5分間停止した後、30秒間（滅菌ビーカーに含まれている）を70％エタノールに魚を沈めるためにふたの移動を可能にする。 </li><li> 70％エタノールから魚を外し、撥水オートクレーブ紙の上に置きます。直接鰓蓋の後ろに、表面的な浅い切開を行うために、メスを使用しています。上記の切開で皮膚をつかんでスケールや皮膚を除去し、魚の尾に向かって引っ張る。 </li><li>皮膚を除去した後、分離媒体に軸上の、両側から魚の急速解糖「白」の筋（横ラインの近くに位置し、スロー酸化「赤」の筋肉を回避する）と場所を切り出す。機関が必要に応じて、魚の残りを捨てる。 注：それは赤筋に起因する培養のMPCに完全に可能ですが、硬骨魚のMPCを使用して、ほぼすべての出版物は、軸上のMから単離した細胞を利用しているyotome。 </li><li>筋肉の十分な量が得られるまで繰り返して2.4から2.6を繰り返します。解剖時には、プールされた筋肉組織は細胞生存率を維持するために氷の上に残っていることを確認してください。 </li></ol> 3。機械的解離<ol><li>ガラスペトリ皿に筋肉組織を25ml / 5gを一本のチューブを注ぐ。 2メスを使用すると、付き＃10の外科用メスの刃、スラリーまたはピューレの整合性へのミンチ組織と処理します。お互いを過ぎて、メスの刃を引いての「前後」運動が最適です。 注：組織ホモジナイザーが適切かもしれませんが廃止されていない場合、生細胞の数が劇的に減少します。 </li><li> 25ミリリットルの血清学的および血清学ピペットピペッターを使用して、スラリー化した組織を除去し、元のコニカルチューブに交換してください。 </li><li>すべてのチューブ内のすべての組織が機械的に分離されるまで繰り返して3.1から3.2を繰り返します。 </li><li> 300×gで5分、10℃で遠心組織</li><li> Foll遠心分離により、25ミリリットルの血清学的ピペット、真空吸引器、または慎重にデカンテーションによりとともに培養上清の25ミリリットルを廃棄する。 </li><li>各チューブ、再懸濁組織に洗浄培地25mlを追加し、上記のようにrecentrifuge。 </li><li>上澄みを毎回削除、洗浄培地で2回洗浄します。 </li></ol> 4。酵素的解離<ol><li>ステップ3.4の間に、IV型コラゲナーゼの0.22グラムとベース媒体（または0.11 g/0.22 mlで十分な量）の44ミリリットルを組み合わせることにより、コラゲナーゼ溶液を調製する。 </li><li> 4℃で10〜15分間ビーカー中で撹拌するフィルタ50 mlシリンジ及び0.45μmのシリンジフィルターを用いて滅菌する。 NOTE：複数のシリンジフィルターコラゲナーゼ調製物に応じて、必要とされ得る。ワーシントン生化学以外のベンダーから取得したコラゲナーゼは、濾過中に、より困難を伴います。コラゲナーゼは、筋内膜を構成するコラーゲンペプチド結合を解離するために使用される。この消化は筋線維の防護壁を削除します。 </li><li>筋肉組織の各グラムについては、0.2％コラゲナーゼ溶液中で組織を再懸濁する。筋肉組織5gのために、コラゲナーゼ溶液10mlとベース媒体を15mlを加える。 </li><li>コラゲナーゼ溶液/基本培地1mlあたりのPSFの10μL（ 例えば 25ミリリットルに250μL）を追加します。これは酵素消化の効率に影響を与えるように、組織が十分に中断されていることを確認してください。 </li><li>緩やかに揺り動かしながら18℃で60分間コラゲナーゼ中の筋肉組織をインキュベートする。これは細胞生存率に影響を与えるかもしれないが、機械的解離および種の程度に応じて、コラゲナーゼ消化は、90分に延長されてもよい。 </li><li> 12℃で5分間、300×gでコラゲナーゼ消化、遠心コニカルチューブを、以下の洗浄培地25ml中の上清と再懸濁組織を廃棄します。 </li><li> Recentrifuge 5分間、300×gで12時6。C.洗浄媒体で2回繰り返します。 </li><li>洗濯組織は二回、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて洗浄媒体や粉砕物の25ミリリットルに再懸濁し、筋肉組織は、組織/中ホモジネートを比較的容易にピペットの内外に通過するまでの後。 5月10日triturationsで十分です。 <ol><li> 5ミリリットル血清学的ピペットをした後、注射器に取り付け16ゲージの金属カニューレを繰り返します。 </li></ol></li><li> 12℃で5分間300×gで遠心分離コニカルチューブ上清をデカント。 </li><li>上記の5分間の遠心分離中に、基本培地5mlのトリプシン0.25gのを組み合わせることによりトリプシン消化溶液を調製する。 </li><li> 10〜15分とフィルタ20ミリリットルの注射器と0.45μmのシリンジフィルターで滅菌し、4℃で撹拌する。 </li><li>コニカルチューブを取り出し、すべてのチューブに筋肉組織のすべての1グラムトリプシン溶液100μlと分離培地の4.9ミリリットルを追加。 EXA用mple、トリプシン溶液500μlと筋肉組織の5グラムに分離培地の24.5ミリリットルを追加。 注：トリプシンは基底膜から筋原性前駆細胞を分離するセリンプロテアーゼである。 </li><li>再懸濁し、トリプシン/解離における組織の媒体だけでなく。 18℃で20分間インキュベートする</li><li> 12℃で1分間300×gで最初のトリプシンインキュベーション、遠心コニカルチューブ次</li><li>分離培地の4ボリュームへの上清の1の体積の濃度で分離培地で上清を組み合わせることにより、トリプシンを中和する。第トリプシン消化中、4℃で保存する。 </li><li>組織の残りのペレットに、繰り返して、最初のトリプシン消化からの上清/分離媒体とステップ4.15後の上清を組み合わせ、4.12から4.15を繰り返します。 </li><li> あるいは：コラゲナーゼおよびトリプシン消化物を、細胞収率を最大にするために組み合わせることができる。 &lt;OL&gt; <li>これを行うには、ホモジネートを簡単にカニューレを通過するまでのコラゲナーゼは20ミリリットルの注射器に取り付けられた金属（長さ6と16ゲージの最高の作品）カニューレを使用してダイジェスト粉砕する。 </li><li>ホモジネートに、（ステップ4.10で製造）のトリプシン溶液500μlを加え、20分間18℃でインキュベートする。 </li><li> 12℃で1分間300×gでインキュベーション、遠心分離コニカルチューブを、次の</li><li>分離培地の4ボリュームへの上清の1の体積の濃度で分離培地で上清を組み合わせることにより、トリプシンを中和する。 </li><li>第トリプシン消化中、4℃で保存する。 </li><li>標準プロトコルと同様に、ステップ4.18に進みます。 </li></ol></li><li> 300×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に最終的な上澄み液/分離培地混合物を分配 12℃で10分間</li><li>細胞を乱さないように注意しながら、上清を取り除くペレット。ピペット各チューブへの完全培地2ml、各細胞ペレットを溶解する。 </li><li> 1の50mlコニカルチューブに完全培地に懸濁した細胞を結合する。 </li><li>以前に再懸濁された細胞のプールと組み合わせ、完全培地1mlで各チューブを洗浄します。 </li><li>金属カニューレを粉末化し、5〜10倍の注射器。 </li><li>完全培地でリンスし、100μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li><li> 40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li><li> 50ミリリットルに十分な完全培地を加え、15℃で10分間300×gで遠心分離</li></ol> 5。カウント、希釈、および細胞の播種<ol><li>ステップ4.25の最後の遠心分離後、慎重にデカンするか、血清学的ピペットで上清を除去。完全培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>細胞が完全に再懸濁して、20μLを削除; 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中の細胞懸濁液と場所の。 </li><li>トリパンブルー色素の5μLを加え、5分間待ちます。血球計数器を用いて、生細胞の数を決定する。 </li><li>決定されると、必要な濃度に細胞を希釈する。硬骨魚MPCは最高の1cm 2あたり150,000〜200,000個の細胞で播種する。 6ウェルプレーティング戦略については、1.5×10 6細胞を希釈する-ミリリットルあたり2.0×10 6には 、十分な増殖と分化をサポートしています。 </li><li>ポリ-L-リジン処理し、ラミニンコートプレートと種細胞を取得します。 （プレート固有の希釈液とめっきボリュームについては、表5を参照してください。）注： 表6は、様々な硬骨魚種から単離された筋組織のグラム当たり単離された細胞の平均数を示している。ニジマス（O.ニジマス ）の出品ゼブラフィッシュ（D·フィッシュ ） を実行し、それによって適切な播種用から隔離するために多くの魚が必要とするより、筋組織のグラム当たり少ないのMPC。 </li><li>適切な温度で冷却インキュベーター内で実験室のテープと場所でプレートをシール。ここに記載されているすべての種からのMPCは（マウスのために保存）二酸化炭素（CO 2）の補充を行わずに、通常の大気条件下でインキュベートすることができる。 （ 表7を参照してください。） </li><li> 代わりに：いくつかの研究室は、MPCは40分間培養基質に付着させるための呼び出しのプロトコルを採用しています。 <ol><li>その後、任意の緩く付着し、非接着細胞を除去するための洗浄メディアでプレートをすすぐ。警告：この手順では、培養基質への他の細胞（ 例えば 、線維芽細胞）の「非特異的」接着を避けるために非常に重要です。 </li><li>インキュベーター内で完全なメディアと場所のセルを追加し、下記のとおりの世話。 </li></ol></li></ol>

開示することは何もありません。

筋原プログラムは、いずれの種において試験し、最も簡単にin vitro系を介して研究することができる。確かに、分離の際に、哺乳動物の魚やmyosatellite細胞（MSC）での筋原性前駆細胞（MPCは）容易に増殖、細胞周期の撤退、および端末筋芽細胞の分化と発生期の筋管にそれらの筋芽細胞の融合を含むこの高度に制御されたプロセスに入る。 （ゼブラフィッシュ67とニジマス69の可能性を除いて）魚類種の遺伝子導入遺伝子レポーター株の一般的な不足は、MPC / MSCの活性化、増殖および分化のin vivoでの作業に制約ので、ここで紹介するin vitroの系である魚種での研究のための魅力的なプラットフォーム。 MPC / MSCは関係なく、種の成功文化は無菌性のA）の厳格な注意に大きく依存している。骨格筋tのb）は、完全な機械的解離問題;およびc）酵素消化の最適化。筋肉組織の分離の初期段階の間に、細心の注意は、組織の必要量は汚染なしに切除されていることを保証するために注意...

哺乳動物の筋形成のかなりの理解がC2C12 5、両方の初代マウス（ ハツカネズミ ）筋芽細胞培養物と十分に記載されたマウス由来の細胞系において、このプロセスの要約を介して得られている。 1950 6年以降、これらの培養物をmurinemyogenicプログラムの理解に多くの進歩につながったと、ひいては、他の脊椎動物における筋形成している。さらに、単一細胞線維外植技術は、衛星細胞と周囲の筋線維7-9間の相互作用の理解を増加している。細胞培養はされて筋形成の調査のために特に魅力的なため、短時間に前駆体から分化した細胞10、RNAiのためのトランスフェクションが比較的容易にin vivoでの移植18〜20、さらにはCOMPに続く11月14日 、トランスジェニック15,16および過剰発現の研究14,17,18、in vitroで拡大分類群21,22の両端筋原性前駆細胞およびそれらの調節剤のアリソン。培養系の人工的な環境に起因する差異が5,23を説明してきたが、これらのin vitro系が多核体の形成を支配する複雑なプログラムの我々の切開に不可欠であることが証明された、最終分化myofibersfromはmyosatelliteとして知られている増殖性前駆細胞を単核哺乳類の中で細胞（MSC）。 哺乳綱の外では、しかし、筋形成を制御するメカニズムの保全、および/ ​​または発散はあまり大きく起因様々な分類群から筋原性前駆細胞（MPCは）と筋芽細胞を培養することが困難であるため、理解されている。確かに、一次筋芽細胞培養は、唯一の3鳥24〜26、1爬虫類27、いくつかの両生類28〜30、およびいくつかの魚1,3,4,31-33に記載されている。 VEのからの連続筋原細胞株げっ歯類34-36以外rtebratesは、日本ウズラ（Cortunixジャポニカ ）に由来している唯一の非哺乳類筋原細胞株と、QM7 37さらに稀である。不死で多くの試みにもかかわらず、硬骨魚筋原細胞株は、とらえどころのないまま、これらの細胞の効率的なトランスフェクションのためのプロトコルでのみ、今年15出版された。このように、脊椎動物の様々な一次のMPCと筋芽細胞を培養するための明確かつ十分に最適化されたプロトコルは、非常に多く、さらに筋原性プログラムの進化の我々の知識を拡大するだけでなく、ブレークスルーを作るために比較生理学の力を利用するために必要とされるヒト骨格筋疾患および障害の治療。 文学は、MPC /筋芽細胞の分離38-49の多くのレポートが含まれていますが、それは著者が簡単な、しばしば不完全で、フォーマットのようなアイソレーションのためのプロトコルを記述するのが一般的である。さらに、最も有益なプロトコルレポRTEDマウス50-53のために開発されており、これらのいくつかは、これらのプロトコルが使用不能または筋肉生物によって利用される非実用奥非げっ歯類種作り、抗体選択54,55または蛍光トランスジーン56,57に依存している。魚類、両生類、および爬虫類の筋形成についてはほとんど知られて、詳細かつ徹底したプロトコルは、視聴覚ガイダンスと遠縁種で実証効率で説明し、フィールドに最も参考になる。 まず1989年58パウエルらによって記載され、以下のプロトコルを最初に（つまり、ニジマス、 ニジマスサケ 、および大西洋サケ、 サルモ·サラル ）サケ科魚類および一部の大きなコイ科（ すなわち金魚、Carassiusauratusauratus）からのMPCおよび筋芽細胞を分離するために開発されました。 2000年には、FauconneauとPaboeufはニジマス59、およびminoroptimizationsミリアンペアのための一次筋芽細胞文化を最適化Danioninaeクレード （ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、そして巨大なゼブラ、Devario aequipinnatus）はゼブラフィッシュの仕事のために利用できる多くの遺伝的なツールへの32、したがって、その近親者のいくつかの小さなミノーでの利用可能なそのプロトコルデ。硬骨魚は、（少なくともほとんどの種で）その発散成長戦略への研究のための魅力的な生物である。大規模なサケは、ほとんどの魚のように、さらに古い時代60〜62で、満期時に漸近線によってとらわれない成長の可能性と、不定成長する。このような巨大なゼブラ63と硬骨魚の典型的な髭ゼブラ表示の成長ポテンシャルとしてゼブラフィッシュとは異なり、大danionins、MPC細胞運命選択は肥大に対する骨格筋過形成の役割を果たしているかどうかを理解するための理想的なプラットフォームの直接の並置を作る。 同様に、我々は、比較的高い細胞収率およびviabで、このプロトコルは、マウスおよびアホロートルで使用できることを実証したility指数。このようなメキシコアホロートル（Ambystomamexicanum）などの有尾サンショウウオは、全体の手足や尾64-66を含む組織を再生させる驚くべき能力を持っている。この特性は、骨格筋萎縮や老化のこれらの両生類興味深いモデルになります。このような研究のためのより広い比較コンテキストを提供する、多くの魚種で行われているように、以下に記載されるプロトコルを使用して、類似のアプローチを行うことができる。多くの真の比較生物学者は理解ようにデータ（ここでは、全体の脊椎動物系統）広いスペクトル内で分析される場合、基礎生物学および翻訳生物医学における最も意味のある進歩を行うことができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">表1。詳細な試薬情報</td></tr><tr><td>試薬</td><td>会社 (Preferred v. Alternate)</td><td>カタログ番号 (Preferred v. Alternate)</td><td>Quantity per Culture</td></tr><tr><td>&gamma;-照射ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1.51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9.53 g</td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌</td>剤 <td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 mL</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>ロンザ(Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z(G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>ドナー馬血清</td><td>Thermo Scientific(Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403(H1270)</td><td>75 mL</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Thermo Scientific(Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103(F2442)</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ(IV型)</td><td>ワージントン(Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189(C9891)</td><td>0.44 g</td></tr><tr><td>トリプシン(膵臓由来)</td><td>MP生物医学 (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">表 2.消耗品、ツール、機器</td></tr><tr><td>消耗品</td><td>機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>鉗子 (粗い)</td><td>血清ピペッター</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 50mL コニカルチューブ</td><td>鉗子 (細かい)</td><td>pHメーター</td><td></td></tr><tr><td>ラボ用テープ</td><td>メスハンドル</td><td>冷却インキュベーター (エコーサーム)</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;m 真空滅菌システム</td><td>メスブレード (#10, #11)</td><td>層流フード</td><td></td></tr><tr><td>撥水オートクレーブ紙</td><td>外科用ハサミ</td><td>真空マニホールド</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>ガラス製シャーレ</td><td>微小浸透圧メーター</td><td></td></tr><tr><td></td><td>12-16 G ルアーロック</td><td></td><td></td>付きカニューレ<</tr><tr>td colspan="4">表3.細胞培養プレートのコーティングに最適化された容量</td></tr><tr><td>プレートサイズ</td><td>cm^2 per well</td><td>Poly-L-lysine*</td><td>Laminin**</td></tr><tr><td>6 well</td><td>9.5</td><td>1.6 mL</td><td>1</td></tr><tr><td>24 well</td><td>1.9</td><td>0.32</td><td>0.2</td></tr><tr><td>48 well</td><td>0.95</td><td>0.16</td><td>0.1</td></tr><tr><td>96 well</td><td>0.32</td><td>0.06</td><td>0.03</td></tr><tr><td>*0.1 mg/mL concentration</td><td>** 0.020 mg/mL concentration</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表4。単離、解離、および培養試薬単離用培地</td></tr><tr><td></td><td></td><td>洗浄</td><td>解離</td></tr><tr><td>ベース培地</td><td>419.25 mL</td><td>395.40 mL</td><td>297.00 mL</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩**</td><td>0.75 mL</td><td>0.60 mL</td><td>-</td></tr><tr><td>ドナーウマ血清</td><td>75.00 mL</td><td>-</td><td></td></tr>-<tr><td>ウシ胎児血清***</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>* PSF:ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンジゾンカクテル(100倍);** 50 mg / mL濃度;特徴付け</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表5。推奨希釈率とめっき量</td></tr><tr><td>プレートサイズ</td><td>cm^2/ウェル</td><td>希釈</td><td>めっき量</td></tr><tr><td>6ウェル</td><td>9.5</td><td>1.5-2.0x10^6 細胞/mL</td><td>1 mL 24</td></tr><tr><td>ウェル</td><td>1.9</td><td>1.5-2.0x10^6 細胞/mL</td><td>250 &mu;L</td></tr><tr><td>48 ウェル</td><td>0.95</td><td>1.5-2.0x10^6 細胞/mL</td><td>150 &mu;L</td></tr><tr><td>96 ウェル</td><td>0.32</td><td>1.5-2.0x10^6 細胞/mL</td><td>50-100 &mu;L</td></tr><tr><td colspan="4">表6。1g組織あたりの平均細胞数</td></tr><tr><td>種</td><td>平均#細胞/ g組織</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6,400,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1,783,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1,797,000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66,800<</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">表7。推奨インキュベーション温度</td></tr><tr><td>種</td><td>温度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 &deg;C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 &deg;C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg;C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*温度が低いほど、増殖率が低くなります。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基礎脊椎動物の系統からの一次筋原前駆細胞/筋芽細胞培養液の調製

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

により生体内での筋原性プログラムを研究に関わる固有の難しさと時間に、骨格筋の常駐成体幹細胞由来の初代培養系では、筋原性前駆細胞（MPCは）、哺乳動物の骨格筋の発達の理解に不可欠な証明されています成長。特に脊椎動物の基底分類群のうち、しかしながら、データは自己再生、増殖、および分化のMPCを制御する分子機構を説明限られている。特に興味深いのは、付属肢の損失（ すなわち有尾両生類）以下のかなりのpostlarvalの骨格筋線維の過形成（ すなわち硬骨魚）とフル再生を受ける基礎脊椎動物の能力の基礎となる潜在的なメカニズムがあります。さらに、培養された筋芽細胞の使用は、再生と筋原性プログラムの要約と、それらの間の違いの理解を助けることができます。へこのため、我々は詳細に堅牢で効率的なプロトコルを記述（および変形文献）より始まる、筋原性プログラムの進化を理解するためのプラットフォームとして、細胞培養で、MPCはおよびその子孫、筋芽細胞と未熟筋管を分離し、維持するための基礎脊椎動物。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデル生物の状況を活かし、我々は、コイ科クレードDanioninaeの小さな魚に、このプロトコルの適用について報告する。タンデムに、このプロトコルは、メキシコアホロートル（Ambystomamexicanum）、さらに実験用げっ歯類からのMPCを単離することにより、より広い比較アプローチを実現するために利用することができる。このプロトコルは、現在広くニジマス、サケ、鯛1-4を含むいくつかの魚種で筋形成を研究で使用されています。

二十四時間播種後、筋原前駆細胞（MPCは）ラミニン基層に見える接続する必要があります（ 図1aおよび1Dを参照してください）。播種後、細胞（MPCは）この細胞型を示す紡錘状形状（ 図1）を採用し、MYOD1 +（ 図2）である。 ゼブラの種では、MPCはサケやサルモ種からのMPCが何よりも小さいバイポーラプロセスとのよりコンパクトであるように思われる。しかし、文化の4日以上は、試験した全ての魚類の種からのMPCは、同様の形態を採用し、筋芽細胞のようにはっきりと見える（ 図1bおよび1E）。完全培地を除去しなければならない、とMPCは、洗浄培地で2回洗浄する必要があります。筋線維芽細胞は、筋原性の文化を汚染し、（筋芽細胞のスピンドル形状に対して）その星様の形態によるのMPC /筋芽細胞から容易に区別することができます。プレートの洗浄を大幅にIこのような線維芽細胞の除去をmproves。 <p class="jo...

体外培養系では 、脊椎動物の筋形成の理解に不可欠であることが分かっている。しかし、多くの、特に基底の分類群において、非哺乳動物の骨格筋の発達と成長について学んだことを残る。この組織を、筋原性前駆細胞（MPCは）の成体幹細胞を単離すること、及び初代培養の設定におけるそれらの自己再生、増殖、および分化を維持するための効率的かつ堅牢なプロトコルは、全体にわたって保存された発散の調節機構の同定を可能脊椎動物の系統。

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

この手順の全体的な目的は、硬骨魚類から筋原性前駆細胞を培養し、in vitroで筋形成を行うことです。これは、まず生物から背側筋を摘出し、次に単離した組織を機械的に分散させることで達成されます。次に、目的の細胞を分散させるために、組織を酵素的に解離させます。最終ステップとして、単離した筋原細胞をLamin基質上に播種します。これにより、最終的にin vitroでの系が構築されます。筋形成（Myogenesis）は、さまざまな処理が遺伝子調節および発現の変化、タンパク質発現、および細胞表現型の変化に及ぼす影響を示すために用いられます。本ビデオでは、硬骨魚類の筋原性前駆細胞を用いた一次培養系の構築方法を実演します。解離ステップのいくつかは習得が困難である可能性があるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。後の培養に向けて十分な細胞ペレットを単離するためには、適切かつ十分な解離が不可欠です。まず、手順に必要なすべての培地と溶液を準備します。次に、組織単離に必要な追加の器具類を揃えます。必要に応じて、事前にオートクレーブ滅菌を行う。解剖作業を補助する人員ごとに、追加の資材を確実に準備すること。また、70% ethanol、滅菌済み天秤、50 milliliter コニカルチューブ、および解剖する組織 5 g ごとに氷を用意しておく。滅菌済みの50 milliliterコニカルチューブに、分離用培地を25 millilitersずつ分注します。重量を量り合わせて記録した後、チューブを氷上に置きます。準備が整ったら、組織解剖に使用する魚を取り出し、70%Ethanolに30秒間浸してから、撥水性のオートクレーブペーパーの上に置きます。メスを用いて浅い表層切開を行い、切開部位の皮膚を掴んで尾の方へ引き、鱗と皮膚を除去します。次に、魚の両側から軸速筋（糖解系白筋）を切り出します。その際、側線付近にある遅筋（酸化系赤筋）を避けてください。切り出した筋肉を分離培地に置き、魚の残りの部分は廃棄します。解剖中に十分な量の筋肉が得られるまで組織の採取を継続し、細胞の生存率を維持するため、プールした筋肉組織は常に氷上に保持してください。まず、筋肉組織が入ったチューブ1本分をガラス製のペトリ皿に注ぎます。2本のメスを交互に動かして組織を細かく刻み、組織のスラリーが容易に取り出せる状態にします。25 mLピペットを用いて、組織スラリーを元のチューブに戻します。すべての組織が機械的に解離するまで、これらの手順を繰り返します。すべての組織の処理が完了したら、その後5分間遠心分離し、上清を捨てて、新鮮な培地で組織を洗浄してから、再度遠心分離を行います。十分に洗浄した後、組織をコラゲナーゼ溶液に懸濁し、18°Cで60分間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。インキュベーション終了後、チューブを遠心分離して細胞をペレット化します。2回洗浄した後、組織を洗浄用培地に再懸濁します。次に、組織ホモジネートが10 mLピペット内を比較的スムーズに往復して通過するまでトリチュレーションを行います。この操作を5 mLピペットで繰り返し、さらにシリンジに取り付けた16ゲージの金属製カニューレを用いて再度行います。十分にホモジナイズした後、組織をペレット化し、上清をデカンテーションで除きます。組織を解離培地中のトリプシンに再懸濁し、18 °Cで20分間インキュベートします。その後、チューブを遠心機に入れ、短時間遠心します。遠心後、上清を4等分した単離液に分注します。4°Cで保存した培地を、残ったペレットに加えます。先ほど示したトリプシン処理と解離のステップを繰り返し、得られた上清を、以前に回収したものと合わせて回収します。最終混合液を50 mLのコニカルチューブに分注し、遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。各チューブに完全培地を2 mLずつピペットで加えます。溶解させるため、再懸濁した細胞を1本の50 milliliterコニカルチューブにまとめます。各チューブを1 milliliterの完全培地で洗浄します。この洗浄液を、再懸濁した細胞のプールに加えます。金属製カニューレとシリンジを用いて、組織を5〜10回トリチュレーションします。細胞懸濁液をろ過した後、完全培地を加えて全量を50 millilitersにし、遠心分離を行います。細胞を回収し、上清を除去して5 millilitersの完全培地を加えます。再懸濁後、少量のサンプルを採取し、血球計数器を用いて生存細胞数を測定します。ポリL-リジン処理したプレートからラミニン溶液を除去します。細胞を必要な濃度に希釈した後、準備したプレートに播種して密封します。密封したプレートを、適切な温度に設定した冷却インキュベーターに入れます。筋前駆細胞（MPC）の播種から24時間後には、細胞がラミニン基質に視覚的に接着しているはずであり、同時に、当初よりも凝集して見えるはずです。ゼブラフィッシュ由来のMPCは、ニジマスと同様の形態を示します。4日間の培養を経て、培養開始から6〜9日以内に筋管が形成されるはずです。培養下において、MPCおよび筋芽細胞はmyo D oneを発現することが示されています。筋芽細胞が筋管へと分化すると、myogeninの発現が始まります。これらのデータは、BRDU取り込み法を用いて培養中の細胞増殖を示したものです。このビデオを視聴することで、単離および培養の方法について十分に理解できるはずです。様々な魚類種から得られた筋原性前駆細胞を、細胞培養系で初期分化させた後に使用します。この手法により、研究者は筋生物学における新たな道を切り開き、ゼブラフィッシュ（danios）などの他の魚類や、アキソロトル（Axel.Lots）などの両生類における筋生物学の探索が可能となりました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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