GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

本手順の全体的な目的は、海馬ニューロンにおけるgabaa受容体の細胞表面への局在およびエンドサイトーシスを測定することです。まず、タグ付きgabaa受容体サブユニットを導入して海馬ニューロンを分画し、培養したニューロンをインキュベーター内で成長させます。次に、蛍光Alexaダイが結合したalpha bungalow toinを用いて、細胞表面のgabaa受容体を標識します。

次に、ラベル化された受容体がエンドサイトーシスされるように、ニューロンをさまざまな時間点でインキュベートします。最終ステップとして、適切な時間点で標本を固定し、抗GFPを用いた免疫染色を行い、タグ付き受容体プールの全体を確認します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて、固定標本または生細胞イメージングの手法により、タグ付きgabaa受容体の表面局在およびエンドサイトーシスの変化を示します。

この手法は、リガンド結合が受容体のエンドサイトーシスおよび挿入速度にどのような影響を与えるか、また、異なるリガンドやモジュレーターが受容体のリサイクリングや分解に影響を及ぼすかといった、受容体トラフィッキング分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、主に神経系の文脈でリガンド結合型イオンチャネルやGタンパク質共役受容体の研究に使用されてきましたが、細胞培養や多様な組織の初代細胞における、他の膜タンパク質の動的な局在およびトラフィッキングの研究にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、2つの理由から困難に直面することがあります。

まず、機能的なコンストラクトを作成し、次に複数のタイムポイントを同時に処理するために必要な習熟と経験を積みます。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、3.5 cmの組織培養ディッシュそれぞれの中に、ポリリジンコートされた円形のガラスカバースリップを4〜5枚準備します。その後、培養当日に、新鮮に分散させたニューロンに1〜4 µgのMaxiprep精製コンストラクトDNAをトランスフェクトします。

ポリリジンコートされたカバーガラス上のトランスフェクション済みニューロンを、3.5 centimeter ディッシュあたり約 200, 000 neurons の最終密度で播種します。ニューロン培養の調製から 4 から 24 時間後に培地を交換してください。その後、インキュベーター内で、in vitro で 14 から 17 日が経過するか、エンドサイトーシスアッセイを実施するための目的の段階に達するまでニューロンを成熟させます。

まず、ベンチトップ冷却加熱装置を16 °Cに設定します。水浴を用いて、細胞外ヘパリン緩衝生理食塩水（HBS）を16 °Cまで冷却します。ニューロン培養ディッシュを16 °Cに冷却したアルミニウムプレートに移し、5分間冷却します。

培地を除去し、16 °CのHBSに150 µMのTubulinを添加した溶液1 mLで2分間置換します。次に、培地をラベル付きの廃棄容器に回収し、16 °CのHBSにTubulinとAlexa Fluor 594標識α-bungarotoxinを添加した溶液1 mLに置換し、16 °Cで15分間インキュベートします。

インキュベーション後、培地をラベル付きの廃棄容器に移し、ガラスボトムの3.5 centimeter培養皿を用いた受容体エンドサイトーシス後のライブイメージングタイムシリーズ実験に備え、16 degrees CelsiusのHBS 2 millilitersを用いて皿を3回洗浄します。皿を顕微鏡の加熱ステージに移し、共焦点顕微鏡またはTURF顕微鏡でイメージングを開始します。固定済みカバーガラス用の設定を行います。

T=0時点のカバーガラスを、室温の4%パラホルムアルデヒド、4%スクロースを含むディッシュに移し、他の時点についても20分間処理します。HBSを37 °Cで平衡化した条件培地に交換し、必要な時点まで37 °Cのインキュベーターに戻してエンドサイトーシスを誘導します。ディッシュをインキュベーターから取り出し、2 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で速やかに2回洗浄します。

次に、試料を4%paraform aldehyde、4%sucroseで20分間固定します。20分間の固定後、4%paraform aldehyde、4%sucroseを廃棄容器に捨て、室温のDPBS 2 mLでディッシュを2回洗浄します。続いて、カバーガラスを室温で10分間インキュベートします。

ニューロンを透過処理し、細胞内受容体プールの抗GFP免疫染色やその他の目的タンパク質の標識を可能にするため、0.2% Triton X 100を含む免疫蛍光ブロッキング溶液を用います。その後、透過処理用のブロッキング溶液を除去し、Triton X 100を含まない免疫蛍光ブロッキング溶液中でカバーガラスを20〜30分間インキュベートします。続いて、ブロッキング溶液中でカバーガラスの一次抗体反応を、室温で数時間、または4 °Cで一晩行います。

カバーガラスをDPBSに5分間浸して洗浄し、これを計3回繰り返します。その後、ブロッキング溶液中で二次抗体とともに1時間、室温でインキュベートします。再び、前述と同様にDPBSでカバーガラスを3回洗浄します。

次に、カバーガラスの裏面の余分な液体をラボ用ティッシュで拭き取り、ガラススライド上の4 µLのマウンティングメディアの上にカバーガラスを反転させて載せ、封入します。実験条件をブラインドにした状態で、60x オイル浸液開口数 1.49 対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により画像取得を行います。

同一の画像取得設定を用いて、神経細胞体および複数の樹状突起が焦点面にある単一のZセクション画像を撮影し、1ニューロンあたり3〜4本の近位樹状突起の20 µmにわたって、alpha bungalow toxin、Alexa蛍光シグナル、およびGFP免疫染色の量を定量化する。なお、すべてのエンドサイトーシスデータの解析には同一の閾値を用いる。各タイムポイントについて10〜12個のニューロンのデータを解析し、複数の独立した神経細胞培養を用いて実験を繰り返す。

GABA作動性軸索は、錐体ニューロンの樹状突起に対して抑制性接触を形成する。シナプス前抑制性末端は、シナプス小胞にGABAおよびグリシンを充填する小胞性抑制性アミノ酸トランスポーターによって同定される。GABAa受容体は、後シナプス抑制性足場タンパク質であるゲイン（gephyrin）によって係留された神経伝達物質放出部位に近接して配置されている。ここに示すのは、表面GABAa受容体をAlexa 594標識bungalow toxinで標識し、続いて全受容体集団を抗GFP抗体（緑色）で免疫染色したalpha2-phg-FP-BBS発現ニューロンであり、後シナプス抑制性足場タンパク質ゲインまたは小胞性抑制性アミノ酸トランスポーターを併せて標識したものである。

ここでは、in vitroで15日経過した海馬ニューロンにおける、$\alpha_2$含有$\text{GABA}_{\text{A}}$受容体の$\alpha$-bungarotoxinによるエンドサイトーシスを示します。パネルに示されている個々の樹状突起の蛍光測定値は、GFP抗体による構築物の発現レベルに基づいて正規化されています。各タイムポイントの最終的な比較は、$T = 0$の測定値に対する正規化によって行われています。

蛍光信号の時間経過に伴う変化から、60分間における受容体の内在化量を定量化したところ、単一指数関数で最も適切に記述されました。別のアプローチとして、ライブイメージングタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、単一ニューロンにおける受容体のエンドサイトーシスを追跡する方法があります。実験開始時には、P-H-G-F-Pタグ付きGABA A受容体と表面α-bungarotoxin標識受容体の点状で重複した蛍光が観察されます。時間経過とともに、受容体がエンドサイトーシスされるため、α-bungarotoxin標識GABA A受容体の信号は減少します。

新たな受容体の挿入によりP-H-G-F-Pシグナルが高く維持される一方で、本手順後のP-H-G-F-Pシグナルのわずかな減少は、細胞表面の受容体分布の変化および光退色によるものです。異なる処理による受容体挿入率など、さらなる疑問を解消するために、バンガロトキシン挿入アッセイなどの他の手法を実施することも可能です。この手法を用いることで、細胞活性、特定のタンパク質ドメイン、アゴニスト、およびその他の調節因子が、生きたニューロンやその他の細胞および組織において、受容体のターンオーバーをどのように修飾するかを評価することができます。

このビデオを視聴することで、標準的な免疫蛍光染色法と組み合わせたAlexa色素結合α-バンガロトキシンを用いて、海馬ニューロンにおける表面受容体の局在を定量化する方法について十分に理解できるはずです。