GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

この手順の全体的な目標は、海馬ニューロンの gabaa 受容体表面局在とエンドサイトーシスを測定することです。これは、最初にタグ付きgabaa受容体サブユニットで海馬ニューロンを横断し、培養ニューロンをインキュベーター内で発生させることによって達成されます。2番目のステップは、表面のgabaa受容体をアルファバンガローtoin結合蛍光Alexaダイで標識することです。

次に、ニューロンをさまざまな時点についてインキュベートし、標識された受容体がエンドサイトースになるようにします。最後のステップは、検体を適切な時点で固定し、抗GFPを使用して免疫染色を行い、タグ付き受容体プール全体を観察することです。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して、固定またはライブイメージングアプローチを使用して、タグ付きgabaa受容体の表面局在とエンドサイトーシスの変化を示します。

この方法は、リガンド結合が受容体のエンドサイトーシスと挿入速度にどのような影響を与えるか、さまざまなリガンドとモジュレーターが受容体のリサイクルと分解に影響を与えるかどうかなど、受容体輸送の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、主に神経系の文脈でGタンパク質共役受容体のライゲーションイオンチャネルの研究に使用されてきましたが、さまざまな組織の細胞培養および初代細胞における他の膜タンパク質の動的局在および輸送の研究にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、2つの理由で苦労します。

第一に、機能的な構造を作成すること、第二に、複数の時点を同時に処理するために必要な実践と経験を作成することです。まず、テキストプロトコルに記載されているように、各3.5cmの組織培養皿の内側に4〜5枚の丸いポリデリジンコーティングガラスカバースリップを準備します。次に、培養日に解離したばかりのニューロンを、1〜4マイクログラムのマキシプレペアストコンストラクトDNAプレートでトランスフェクションします。

ポリデリシンコーティングされたカバー上のトランスフェクションされたニューロンは、3.5センチメートルの皿あたり約200、000ニューロンの最終密度で滑ります。ニューロン培養物の調製後4〜24時間後に培地を交換してください。次に、インキュベーター内でニューロンをインビトロで14〜17日間、またはエンドサイトーシスアッセイを実行するための所望の段階まで発生させます。

まず、ベンチトップ冷却加熱装置を摂氏16度に設定します。細胞外ヒープ、緩衝生理食塩水、またはHBSを水浴で摂氏16度まで冷却します。ニューロン皿を16°Cのアルミニウムプレートに移し、5分間冷却します。

培地を取り外し、1ミリリットルの16°CHBSと150マイクロモルの2Bo Rineを2分間交換します。次に、ラベル付きの廃棄物容器に培地を取り出し、摂氏16度のHBSと2つのboケリンとアルファバンガロー毒素の1ミリリットルと交換します。Alexa 5 9 4を摂氏16度で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、培地を標識された廃棄物容器に移し、ガラス底の3.5cm培養皿を使用して受容体エンドサイトーシス後のライブイメージング時系列実験のために、2ミリリットルの16°CHBSで皿を3回洗浄します。ディッシュを顕微鏡の加熱ステージに移し、共焦点顕微鏡または芝顕微鏡でイメージングを開始します。固定カバースリップ用に設定します。

トランスファーTはゼロタイムポイントに等しく、カバーは室温4%パラホルムアルデヒド、4%スクロースの皿に滑り込み、他のタイムポイントでは20分間です。HBSを条件付け平衡摂氏37度培地に交換し、必要な時点で摂氏37度でエンドサイトーシスのためにインキュベーターに戻します。インキュベーターから皿を取り出し、2ミリリットルの室温、デルコスリン酸、緩衝生理食塩水またはDPBSですばやく2回洗います。

次に、試料を4%パラホルムアルデヒド、4%スクロースに20分間固定します。20分間の固定後、4%パラホルムアルデヒド、4%スクロースを廃棄物容器に取り除き、2ミリリットルの室温DPBSで皿を2回洗浄します。次に、カバースリップを室温で10分間インキュベートします。

0.2%Triton X 100を含有する免疫蛍光ブロック溶液で、ニューロンを透過し、細胞内受容体プールの抗GFP免疫染色や、他の目的タンパク質の標識を可能にします。次に、透過性ブロック溶液を除去し、Triton X 100を含まない免疫蛍光ブロック溶液でカバースリップを20〜30分間インキュベートします。カバースリップの一次抗体インキュベーションは、室温で数時間、またはインキュベーション後4°Cで一晩ブロックで実施します。

カバースリップをDPBSに5分間浸し、合計3回洗浄して洗浄します。次に、カバースリップを二次抗体とブロック溶液中で1時間インキュベートし、1時間後に室温で1時間インキュベートします。前回と同様に、カバースリップをDPBSで3回洗います。

次に、カバースリップの裏側からラボティッシュで余分な液体を取り除き、スライドガラス上でカバースリップを4マイクロリットルの封入剤に反転させて、各カバースリップをマウントします。60 x オイル開口数を使用して、実験条件に盲目で共焦点顕微鏡で画像取得を行います。1.49イマージョン対物レンズ。

同じ画像取得設定を使用して、ニューロン細胞体といくつかの樹状突起に焦点を合わせた単一のZセクション画像を取得し、ニューロンあたり3〜4個の近位樹状突起の20ミクロンに沿ったαバンガロー毒素、Alexa蛍光シグナル、およびGFP免疫染色を定量し、すべてのエンドサイトーシスデータの分析に同じしきい値を使用します。各時点の 10 個から 12 個のニューロンのデータを解析します。いくつかの独立したニューロン培養物で実験を繰り返します。

GABA作動性軸索は、錐体ニューロン樹状突起に抑制性接触を行います。シナプス前抑制末端は、GABAとグリシンをシナプス小胞にロードする小胞性抑制性アミノ酸トランスポーターによって同定されます。GABA受容体は、ここに示されているシナプス後抑制性足場タンパク質ゲインによってつながれた神経伝達物質放出部位と密接に対立しており、Alexa 5 9 4バンガロー毒素で標識された表面gabaa受容体を持つニューロンを発現するα 2 phg F-P-B-B-Sと、緑色で示されている抗GFP抗体による全受容体集団の免疫染色、およびシナプス後抑制性足場タンパク質ゲインまたは小胞性抑制性アミノ酸トランスポーター

ここでは、15日間のin vitroでのGABAA受容体と海馬ニューロンを含むα2のエンドサイトーシスがαバンガロー毒素を示しています。パネルに示されているように、個々の樹状突起の蛍光測定は、GFP抗体を介したコンストラクト発現のレベルに正規化されます。時点の最終的な比較の染色は、T がゼロ測定値に等しいように正規化することによって行われます。

蛍光シグナルの経時変化から60分間にわたる受容体の内在化の定量化は、単一の指数関数によって最もよく説明されました。別のアプローチは、ライブイメージングのタイムラプス共焦点顕微鏡法により、単一のニューロンの受容体エンドサイトーシスを追跡することです。P-H-G-F-Pタグ付きGABA A受容体と表面アルファバンガロー毒素標識受容体の点状および重なり合う蛍光は、実験の開始時に、アルファバンガロー毒素標識GABA A受容体シグナルが受容体エンドサイトースとして減少する時間経過にわたって見えます。

P-H-G-F-Pシグナルは新たな受容体の挿入により高いままであるが、P-H-G-F-Pシグナルの最小限の減少は、この手順に続く細胞表面受容体の分布変化および光退色によるものである。バンガロー毒素挿入アッセイなどの他の方法を実行して、さまざまな処理による受容体挿入率などの追加の質問に答えることができます。この技術により、細胞活性、特定のタンパク質ドメイン、アゴニスト、およびその他のモジュレーターが、生きたニューロン、他の細胞、および組織の受容体代謝回転をどのように変更できるかを評価できます。

このビデオを見た後、海馬ニューロンの表面受容体局在を定量化するために、α bungalow毒素結合Alexa色素を標準的な免疫蛍光法と組み合わせて使用する方法について十分に理解しているはずです。