Name: GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶGABA_A受容体の膜局在化とエンドサイトーシスを海馬ニューロンで測定する方法。α-ブンガロトキシンと蛍光Alexa色素を用いて標識し、共焦点顕微鏡で受容体動態を可視化します。

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サポートは、医学のピッツバーグ大学大学院の薬理学およびケミカルバイオロジー部門からスタートアップ資金によって提供された。ニコラス·グラフ：ビデオの提出に貢献ヤコブラボメンバーの謝辞。

以下に説明されているすべてのプロトコルは、動物実験委員会と医学のピッツバーグ大学大学院のIRB制度審査委員会に従う。 1。組織培養フード内の海馬ニューロン培養の調製注意：プロトコル1全体で使用無菌技術および試薬を。 <ol><li>神経細胞培養のための基質としてポリ-D-リジン（0.1 mg / mlの中のH 2 O）、コーティングされたガラス製カバースリップを準備します。 <ol><li>各3.5センチメートル組織培養皿の内側4-5ラウンドガラス製カバースリップを配置。 </li><li>各12ミリメートルのカバーガラス上にスポット70μlのポリ-D-リジン。注：ライブイメージングのために、ガラスは、（埋め込まれた14ミリメートルのガラス製カバースリップ上に200μlのポリ-D-リジンを発見）3.5 cmの組織培養皿を用いることができる有底。 </li><li>組織培養フードのO / Nで惣菜を残すポリ-D-リジンの蒸発を最小限に抑え、組織培養フードに無菌表面を保ち、窓サッシを閉鎖し、目をオフにするにはEブロワーのO / N注意：UVランプは、O / Nインキュベーション中に使用されていません。 </li><li>翌朝、食器は、H 2 Oの2ミリリットルで3回洗浄</li><li>最後のH 2 Oの洗浄を除去した後、各3.5センチメートル皿にメディアの2ミリリットルを追加し、ステップ1.4でニューロンをめっきする準備が整うまでインキュベーター内で料理をしておきます。 </li></ol></li><li>海馬ニューロンは、胎生18〜19（ゴズリン22から改変）（E18-19）のラットから調製される。 </li><li>マキシ構築DNAの1-4μgの培養の日に新鮮に解離した神経細胞をトランスフェクト。 注意：一般的にDNAの3μgの50％の生存率および200万ニューロンから始まる60％のトランスフェクション効率（ 例えばで、100万〜200万ニューロンにトランスフェクトされる。（（2×10 6ニューロンX 0.5）0.6）を提供します約百万ニューロン; 1をトランスフェクトされる60万々の潜在的な問題のトラブルシューティングを行うときに、構築物のDNAの異なる量のトランスフェクトすることができる。過剰発現は、構築物の局在と機能の適切な特性評価を行った。 </li><li>プレートの3.5cm皿当たり約20万のニューロンの最終的な密度で、ポリ-D-リジンコートしたカバーガラス上にトランスフェクションしたニューロンを。注意：ガラスボトムディッシュのために、14ミリメートルのガラス面積に4〜5万ニューロンをプレート。 </li><li>神経細胞は、in vitro（DIV）または所望の段階で 14〜17日まで、インキュベーター内で開発できるようにして、神経細胞培養の調製後のメディア4月24日時間を交換してください。 </li></ol> 2。エンドサイトーシスアッセイ 注意：α-ブンガロトキシンおよびツボクラリン廃棄や取り扱いに注意してください： <ol><li>すべてのペプチド神経毒の扱いは、バイオセーフティレベル2（BL-2）研究プロトコールのガイドラインの範囲内でお勧めします。すべての適切な個人保護具を着用しなければならない。凍結乾燥された毒素粉末は、製造業者の説明書に従って再構成されるべきである。毒素廃棄寿LDは支配機関の環境衛生および安全に関するガイドラインを遵守して処分される。 </li><li>貯蔵中に形成されている可能性のある潜在的なペプチド凝集体を除去するために、α-ブンガロトキシンのアリコートを使用前に短時間遠心分離されるべきであり、そして上清を実験に使用されるべきである。 </li><li> α-ブンガロトキシン（BGT）ストックは-20℃での滅菌H 2 O中の1 mg / mlの濃度に再懸濁し、10μlのアリコートで保存されている蛍光結合されたBGTストックを3μg/ mlの時に使用されている。ツボクラリンは、150μMの最終濃度で使用されている。 </li></ol><ol><li>上に薄いアルミニウムやステンレス板と低温室で16℃に設定し、ベンチトップヒーターブロック。可能な場合あるいは、ベンチトップ冷却/加熱装置は16℃を必要とする各工程のために使用することができる</li><li>単位はmM含有クール外Hepes緩衝生理食塩水（HBS：135のNaCl、4.7 KCl、10mMのHEPES、11グルコース、1.2のMgCl 2、および2.5CaCl 2を 、水浴中で16°CまでpH7.4）中。 </li><li> 16℃、5分間のクールでアルミ板への転送ニューロン料理を。 </li><li>メディアを取り出す（ ステップ2.8、エンドサイトーシスアッセイの時点インキュベーター内条件培地と予備を保持 ）し、2分間16℃で、HBS +のツボクラリン（150μm）で1ミリリットルと交換してください。 </li><li>ラベルされた廃棄物容器にHBS +ツボクラリンを削除し、アレクサ594 [3μg/ mlの]、15分間16℃でインキュベートする1​​ミリリットル16の℃のHBS +のツボクラリン（150μM）+α-ブンガロトキシンと交換します。 </li><li>取り外しHBS +ツボクラリン+α-ブンガロアレクサ594（洗浄は50％の漂白剤50ミリリットルを含む真空フラスコに吸引を介して収集することができます）廃棄物容器とラベルと料理は16℃、HBSの2ミリリットルで3回洗浄します。 </li><li>ガラスを用いた受容体エンドサイトーシスに続いてライブイメージング時系列実験3.5 10cm培養皿の底には、2.1〜2.6の手順を実行し、次に加熱ステージに皿を転送する（ペルチェ素子）顕微鏡、共焦点またはTIRF顕微鏡のセットアップを画像化を開始します。 </li><li> 2.9ステップに他のカバースリップを続け、20分間RT 4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロースの皿にT = 0の時点カバースリップを転送する。 </li><li>他の時点では、エアコンとHBSを交換する（ステップ2.4に予約）37℃のメディアを平衡化し、37℃（注）でエンドサイトーシスのためのインキュベーターに戻る：T = 15、30、および60の追加の時点を示唆した。 </li><li>の時点で必要に応じて、インキュベーターから料理を取るのRTのDPBS 2mlですばやく2回洗わない（カルシウム、マグネシウムをDPBSない）、その後20分間、4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロースで固定します。 </li><li> 20分固定後、コンテナを無駄にし、2ミリリットルのRT DPBSで二度皿を洗うために4％パラホルムアルデヒド/ 4％ショ糖を除去します。 </li><li>透磁率0.2％トリトンX-100を含有する免疫蛍光ブロック溶液（ブロック溶液= 5％ウマ血清、DPBS中の0.5％BSA）中で室温で10分間カバースリップをインキュベートするニューロンをIZE、細胞内受容体プールと/または関心のある他のタンパク質の標識の抗GFP免疫染色を可能にする。 </li><li>ブロック+0.2％トリトンX-100を取り外し、20〜30分のためのトリトンX-100なしで免疫蛍光ブロック溶液中でカバースリップをインキュベートする。 </li><li> 4℃でRTまたはO / Nで数時間ブロックにカバースリップの一次抗体インキュベーションを行う注：4°のCO / Nにおける原色とカバースリップのインキュベーションは日常の改良免疫蛍光結果を生成します。 </li><li>洗浄はDPBSで3回（各洗浄工程のための5分間）カバースリップ。 </li><li>室温で1時間ブロック溶液中の二次抗体を用いてカバースリップをインキュベートする。 </li><li>洗浄はDPBSで3回（各洗浄工程のための5分間）カバースリップ。 </li><li>マウントカバースリップ、個別に各カバースリップの処理：スライドガラス上にメディアをマウントする4μLにカバースリップを反転して、実験室組織とカバーガラスの背面から過剰な液体を除去。 </li><li>そしてSTスライドを30分間に覆わRTで乾燥させる顕微鏡法を実行する準備するまで4℃で鉱石。 </li><li>共焦点顕微鏡（実験条件にブラインド）を用いた実験の画像取得と分析。 60XオイルNA以下のレーザーで1.49浸対物レンズ：アルゴンガスは488nm、561ダイオード、640ダイオード。 <ol><li>同じ画像取得設定を使用して、神経細胞体及びフォーカスのいくつかの樹状突起を有する単一のZ部分画像を取​​得する。 </li><li>すべてのエンドサイトーデータの分析のために同じ閾値を用いて、ニューロンあたり3-4近位の樹状突起に沿って20μmのα-ブンガロトキシンAlexaの蛍光シグナル及びGFP免疫染色を定量する。 </li><li>いくつかの独立した神経細胞培養を用いた実験を繰り返して、各時点で10〜12ニューロンからのデータを分析。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li>
<li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li>
<li>Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mobility+of+functional+GABA%28A%29+receptors+at+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses.</a> Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Cell+Surface+GABAB+Receptors+Using+an+%CE%B1-Bungarotoxin+Tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-like+protein+Plic-1+enhances+the+membrane+insertion+of+GABAA+receptors+by+increasing+their+stability+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum.</a> J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Tuning+of+Inhibitory+Neurotransmission+Based+on+GABAAR+Diffusion+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics.</a> Neuron. 62, 670-682 (2009).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+regulate+GABAA+receptor+lateral+mobility+and+clustering+at+inhibitory+synapses+through+serine+327+on+the+gamma2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).</li>
<li>Katchalski-Katzir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+peptides+that+bind+alpha-bungarotoxin+with+high+affinity+and+mimic+the+three-dimensional+structure+of+the+binding-site+of+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor.</a> Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).</li>
<li>Scherf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta+-hairpin+structure+in+a+13-mer+peptide+that+binds+alpha+-bungarotoxin+with+high+affinity+and+neutralizes+its+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cell+surface+GABAB+receptors+using+an+alpha-bungarotoxin+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+treatment+induces+subtype-specific+changes+in+GABAA+receptor+trafficking+and+decreases+synaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).</li>
<li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkage+and+visualization+of+acetylcholine+receptors+on+myotubes+with+biotinylated+alpha-bungarotoxin+and+fluorescent+avidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).</li>
<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAB+receptor+internalisation+is+regulated+by+the+R2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
<li>Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+phosphorylation+of+GABAA+receptors+regulates+receptor+insertion+and+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current.</a> EMBO. 31, 2937-2951 (2012).</li>
<li>Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+G-Protein+Coupling+in+an+mGluR6+Point+Mutant+Associated+with+Congenital+Stationary+Night+Blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness.</a> Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).</li>
<li>Terunuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+activation+of+NMDA+receptors+promotes+dephosphorylation+and+alters+postendocytic+sorting+of+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).</li>
<li>Goslin, K. G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Nerve+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Culturing Nerve Cells.</a> , 2nd ed, MIT Press. (1998).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するBBS基づいて、固定技術は、生細胞株、ニューロン、および他の一次細胞における受容体または他の原形質膜タンパク質の輸送を追跡するために使用することができる。この方法は、正常膜挿入およびリガンド依存性イオンチャネルの除去およびGPCRを研究による受容体アゴニストおよびモジュレーターの存在下にトラフィッキングの変化を評価するために使用されている。重要な側面は、適切な細胞外の場所にタグの局在とBBSの添加を確実にするための制御を行う（GFPなど他の記者のための標準として）機能的に沈黙しているが含まれています。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。追加のGFPタグが使用されない場合、合計BBSは、タンパク質レベルは、追加の固定後に別のフルオロフォアに結合されたα-ブンガロトキシンとpermeabilizによる染色を介して決定することができるタグ付きATION。目的の受容体/タンパク質のエンドサイトーシスの速度を測定するための時点の選択は、以上の時点の初期使用と組み合わせ、受容体/タンパク質のための人...

の蛍光体の局在とダイナミクスを研究するため、α-ブンガロトキシンを結合された使用は、ニコチン性アセチルコリン受容体13〜15、毒素の内因性標的の研究で開拓された。続いて、最小限のBGT結合ペプチド（BBS）の組み込みは、興奮性および阻害性リガンド依存性イオンチャネルおよびGタンパク質共役受容体2,10,16-21両方の輸送を研究するために使用されている。このBBSベースの技術は、表面ビオチン化法、細胞外エピトープに対する抗体を用いた生細胞の抗体標識、および（FRAP）を光退色後蛍光回復などの人身売買の研究に使用される他のアプローチには利点を提供します。細胞表面の間にビオチン化遊離アミンが共有結合し細胞活性に影響を与える可能性を秘めた、変更されます。抗体ベースの研究は、多くの場合、人身売買のイベントを変更することができ、表面抗原クラスタリングまたはキャッピングによって妨げられてきた。原因FRAP sの漂白工程へtudies、重要な関心事は、下にある細胞構造を損傷している。さらなる利点は、BBSが構築物はまた、ビオチン結合ロバにブンガロトキシン受容体の輸送生化学手法を用いることができるタグ付けすることである。この技術は、細胞株および初代細胞に容易に適用可能である。示されるように、ニコチン性アセチルコリン（nAChRの）受容体を発現する細胞で使用するためには、のnAChR拮抗ツボクラリンは、プロトコル全体で使用されている必要があります。ツボクラリンの非存在下でトランスフェクトしていない細胞に（エンドサイトーシスプロトコルのT = 0の時点に相当）の単純な表面BGT標識を行うと、内因性nAChRの証拠を提供する。 それは、目的のタンパク質が原形質膜に送達される細胞外の位置に存在するように、この技術を使用するための重要な考慮事項は、BBSの適切な挿入である。例えば、GABAARサブユニットのN-末端ドメインは、人身中に水疱ルーメン内に常駐fickingおよび細胞表面受容体およびエンドサイトーシスイベントによる細胞表面からの除去の評価の特異的標識を可能にする、原形質膜中の受容体の挿入後に細胞外になります。我々は以前GABAARサブユニットのこのドメインへのGFP、mycを、BBS又はエピトープの添加は、機能的にサイレントであることが示されている。標準コントロールは、それが適切に局在すること、タグ付きタンパク質はタグなし構築物に類似したレベルで発現されることを保証するために行われ、それが受容体の機能に影響を与えないべきである。トランスフェクトコンストラクトのこの特性は、トラブルシューティングの過剰発現の懸念を支援します。

<table><tbody><tr><td>P3 Primary Cell 4Dキット&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>&-ブンガロトキシン、アレクサフルーア 647 コンジュゲート</td><td>分子プローブ</td><td>B35450</td><td></td></tr><tr><td>&-ブンガロトキシン、アレクサフルオア 488 コンジュゲート</td><td>分子プローブ</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>&-ブンガロトキシン、アレクサフルーア 594 コンジュゲート</td><td>分子プローブ</td><td>B13423</td><td></td></tr><tr><td>(+)-塩化ツボクラリン</td><td>トクリス</td><td>2820</td><td></td></tr><tr><td>実装媒体&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>cS703</td><td></td></tr><tr><td>DPBS no calcium, magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Gephyrin 抗体</td><td>シナプス</td><td>システム 147 011</td><td>1:300</td></tr><tr><td>VIAAT/VGAT 抗体</td><td>シナプス</td><td>システム 131 002</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗 GFP</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ A6455</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>ガラス底組織培養皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C - Mattek 皿</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ (丸型カバーガラス)、#1 厚さ、12 mm</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>640-0702</td><td></td></tr></tbody></table>

gaba a受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

これは、ますます明らかであるイオンチャネル型GABA A受容体（GABAAR）、展示高度に動的な輸送および細胞表面移動度1-7を含む神経伝達物質受容体、。受容体細胞表面局在化およびエンドサイトーシスを研究するために、ここに記載された技術は、α-ブンガロトキシン（BGT）結合部位（BBS）を含む構築物を発現する細胞と蛍光α-ブンガロトキシンの使用を兼ね備えています。 BBS（WRYYESSLEPYPD）は、高親和性8,9でBGTをバインドし、筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニットに基づいています。掲示板サイトの取り込みは、以前に、GABA Aと代謝型GABABの追跡2,10受容体で説明したように、表面局在および受容体の挿入または外因性蛍光BGTの適用と除去の測定を可能にする。 BBS部位に加えて、我々は標準mで成熟GABAARサブユニットのアミノ酸4と5の間のpH感受性GFP（pHGFP 11）に挿入olecular分子生物学およびPCRクローニングストラテジー12（ 図1参照）。 BBSは、13個のアミノ酸のアラニン/プロリンリンカーにより分離、pH感受性GFPレポーターの3 &#39;である。固定したサンプルに基づいており、この文書に記載されて人身売買の研究のために、pHGFPが全体の記者がBGTの正規化は、全受容体集団に受容体集団をラベル付けできるように、GABAARサブユニットタンパク質レベルタグとして機能します。これはタグ付けされたGABAARサブユニットの高いまたは低いベースライン発現に起因する細胞BGT染色シグナルの変動にセルを最小限に抑えることができます。さらにpHGFPタグは、ライブまたは固定イメージング実験用の細胞を発現する構築物を容易に識別することができます。

BBSタグ付けされた構造のキャラクタリゼーションは、発現されたタンパク質は（特に複数のサブユニットからなる受容体に）適切に組み立てるかどうかを判断するなどの重要なコントロールが含まれ、細胞表面にトラフィックを適切局在する。抑制性シナプスは、阻害足場タンパク質ゲフィリンと共局在し、シナプス小胞（VIAAT / VGAT）にGABAおよびグリシンをロード水疱性抑制性アミノ酸トランスポーターによって識別されるシナプス前抑制端末に並置された受容体表面のクラスターは、GABAで構成されています。 図2に示されている抗GFP抗体を用いた総受容体集団の免疫染色し、シナプス後抑制性足場タンパク質のゲフィリン（ 図2A）またはVIAAT（ 図2B）のいずれかに続いてBGTで標識された表面GABAARで発現ニューロンα2pHGFP+掲示板です。 図3は、αのエンドサイトーシスを示しています2 15 DI​​Vの海馬神経細胞にGABAARを含む。パネル（ <stro...

ここでは、GABA海馬ニューロンにおける受容体表面局在およびエンドサイトーシスを測定するために、ブンガロトキシンをαに結合された蛍光Alexaの色素の使用を示す。 α-ブンガロトキシンに結合する細胞外の短いタグを有する構築物の使用によって、血漿膜タンパク質のエンドサイトーシス輸送の分析を達成することができる。

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

本手順の全体的な目的は、海馬ニューロンにおけるgabaa受容体の細胞表面への局在およびエンドサイトーシスを測定することです。まず、タグ付きgabaa受容体サブユニットを導入して海馬ニューロンを分画し、培養したニューロンをインキュベーター内で成長させます。次に、蛍光Alexaダイが結合したalpha bungalow toinを用いて、細胞表面のgabaa受容体を標識します。次に、ラベル化された受容体がエンドサイトーシスされるように、ニューロンをさまざまな時間点でインキュベートします。最終ステップとして、適切な時間点で標本を固定し、抗GFPを用いた免疫染色を行い、タグ付き受容体プールの全体を確認します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて、固定標本または生細胞イメージングの手法により、タグ付きgabaa受容体の表面局在およびエンドサイトーシスの変化を示します。この手法は、リガンド結合が受容体のエンドサイトーシスおよび挿入速度にどのような影響を与えるか、また、異なるリガンドやモジュレーターが受容体のリサイクリングや分解に影響を及ぼすかといった、受容体トラフィッキング分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、主に神経系の文脈でリガンド結合型イオンチャネルやGタンパク質共役受容体の研究に使用されてきましたが、細胞培養や多様な組織の初代細胞における、他の膜タンパク質の動的な局在およびトラフィッキングの研究にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、2つの理由から困難に直面することがあります。まず、機能的なコンストラクトを作成し、次に複数のタイムポイントを同時に処理するために必要な習熟と経験を積みます。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、3.5 cmの組織培養ディッシュそれぞれの中に、ポリリジンコートされた円形のガラスカバースリップを4〜5枚準備します。その後、培養当日に、新鮮に分散させたニューロンに1〜4 µgのMaxiprep精製コンストラクトDNAをトランスフェクトします。ポリリジンコートされたカバーガラス上のトランスフェクション済みニューロンを、3.5 centimeter ディッシュあたり約 200, 000 neurons の最終密度で播種します。ニューロン培養の調製から 4 から 24 時間後に培地を交換してください。その後、インキュベーター内で、in vitro で 14 から 17 日が経過するか、エンドサイトーシスアッセイを実施するための目的の段階に達するまでニューロンを成熟させます。まず、ベンチトップ冷却加熱装置を16 °Cに設定します。水浴を用いて、細胞外ヘパリン緩衝生理食塩水（HBS）を16 °Cまで冷却します。ニューロン培養ディッシュを16 °Cに冷却したアルミニウムプレートに移し、5分間冷却します。培地を除去し、16 °CのHBSに150 µMのTubulinを添加した溶液1 mLで2分間置換します。次に、培地をラベル付きの廃棄容器に回収し、16 °CのHBSにTubulinとAlexa Fluor 594標識α-bungarotoxinを添加した溶液1 mLに置換し、16 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地をラベル付きの廃棄容器に移し、ガラスボトムの3.5 centimeter培養皿を用いた受容体エンドサイトーシス後のライブイメージングタイムシリーズ実験に備え、16 degrees CelsiusのHBS 2 millilitersを用いて皿を3回洗浄します。皿を顕微鏡の加熱ステージに移し、共焦点顕微鏡またはTURF顕微鏡でイメージングを開始します。固定済みカバーガラス用の設定を行います。T=0時点のカバーガラスを、室温の4%パラホルムアルデヒド、4%スクロースを含むディッシュに移し、他の時点についても20分間処理します。HBSを37 °Cで平衡化した条件培地に交換し、必要な時点まで37 °Cのインキュベーターに戻してエンドサイトーシスを誘導します。ディッシュをインキュベーターから取り出し、2 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で速やかに2回洗浄します。次に、試料を4%paraform aldehyde、4%sucroseで20分間固定します。20分間の固定後、4%paraform aldehyde、4%sucroseを廃棄容器に捨て、室温のDPBS 2 mLでディッシュを2回洗浄します。続いて、カバーガラスを室温で10分間インキュベートします。ニューロンを透過処理し、細胞内受容体プールの抗GFP免疫染色やその他の目的タンパク質の標識を可能にするため、0.2% Triton X 100を含む免疫蛍光ブロッキング溶液を用います。その後、透過処理用のブロッキング溶液を除去し、Triton X 100を含まない免疫蛍光ブロッキング溶液中でカバーガラスを20〜30分間インキュベートします。続いて、ブロッキング溶液中でカバーガラスの一次抗体反応を、室温で数時間、または4 °Cで一晩行います。カバーガラスをDPBSに5分間浸して洗浄し、これを計3回繰り返します。その後、ブロッキング溶液中で二次抗体とともに1時間、室温でインキュベートします。再び、前述と同様にDPBSでカバーガラスを3回洗浄します。次に、カバーガラスの裏面の余分な液体をラボ用ティッシュで拭き取り、ガラススライド上の4 µLのマウンティングメディアの上にカバーガラスを反転させて載せ、封入します。実験条件をブラインドにした状態で、60x オイル浸液開口数 1.49 対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により画像取得を行います。同一の画像取得設定を用いて、神経細胞体および複数の樹状突起が焦点面にある単一のZセクション画像を撮影し、1ニューロンあたり3〜4本の近位樹状突起の20 µmにわたって、alpha bungalow toxin、Alexa蛍光シグナル、およびGFP免疫染色の量を定量化する。なお、すべてのエンドサイトーシスデータの解析には同一の閾値を用いる。各タイムポイントについて10〜12個のニューロンのデータを解析し、複数の独立した神経細胞培養を用いて実験を繰り返す。GABA作動性軸索は、錐体ニューロンの樹状突起に対して抑制性接触を形成する。シナプス前抑制性末端は、シナプス小胞にGABAおよびグリシンを充填する小胞性抑制性アミノ酸トランスポーターによって同定される。GABAa受容体は、後シナプス抑制性足場タンパク質であるゲイン（gephyrin）によって係留された神経伝達物質放出部位に近接して配置されている。ここに示すのは、表面GABAa受容体をAlexa 594標識bungalow toxinで標識し、続いて全受容体集団を抗GFP抗体（緑色）で免疫染色したalpha2-phg-FP-BBS発現ニューロンであり、後シナプス抑制性足場タンパク質ゲインまたは小胞性抑制性アミノ酸トランスポーターを併せて標識したものである。ここでは、in vitroで15日経過した海馬ニューロンにおける、$\alpha_2$含有$\text{GABA}_{\text{A}}$受容体の$\alpha$-bungarotoxinによるエンドサイトーシスを示します。パネルに示されている個々の樹状突起の蛍光測定値は、GFP抗体による構築物の発現レベルに基づいて正規化されています。各タイムポイントの最終的な比較は、$T = 0$の測定値に対する正規化によって行われています。蛍光信号の時間経過に伴う変化から、60分間における受容体の内在化量を定量化したところ、単一指数関数で最も適切に記述されました。別のアプローチとして、ライブイメージングタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、単一ニューロンにおける受容体のエンドサイトーシスを追跡する方法があります。実験開始時には、P-H-G-F-Pタグ付きGABA A受容体と表面α-bungarotoxin標識受容体の点状で重複した蛍光が観察されます。時間経過とともに、受容体がエンドサイトーシスされるため、α-bungarotoxin標識GABA A受容体の信号は減少します。新たな受容体の挿入によりP-H-G-F-Pシグナルが高く維持される一方で、本手順後のP-H-G-F-Pシグナルのわずかな減少は、細胞表面の受容体分布の変化および光退色によるものです。異なる処理による受容体挿入率など、さらなる疑問を解消するために、バンガロトキシン挿入アッセイなどの他の手法を実施することも可能です。この手法を用いることで、細胞活性、特定のタンパク質ドメイン、アゴニスト、およびその他の調節因子が、生きたニューロンやその他の細胞および組織において、受容体のターンオーバーをどのように修飾するかを評価することができます。このビデオを視聴することで、標準的な免疫蛍光染色法と組み合わせたAlexa色素結合α-バンガロトキシンを用いて、海馬ニューロンにおける表面受容体の局在を定量化する方法について十分に理解できるはずです。

using-an-bungarotoxin-binding-site-tag-to-study-gaba-receptor

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膜受容体の細胞外ドメインにsuperecliptic...

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

このビデオは、初代海馬ニューロン培養におけるグルタミン酸受容体の輸送を研究するための抗体栄養アプローチを示しています。このアプローチにより、血漿膜と内膜の両方で受容体集団を観察できます。これらのサブセット間の識別は、膜透過化の前後で、同じ一次抗体と異なる蛍光色素に結合した二次抗体を使用して受容体を標識することによって達成されます。...

海馬ニューロンにおけるグルタミン酸受容体輸送を研究するためのIn Vitro技術

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

真核生物の発現のために設計されたカルボキシ末端にGFPタグを有する構築物をコードするTMEM184Aは、血管細胞中のヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定を確認するために設計されたアッセイに使用しました。...

GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。...

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

ここでは、生理・薬理のバインドからの GABAAの受容器のアクティブな化合物を発見するためのプロトコルを提案する.

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR)...

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

神経細胞の興奮は、遠藤の動的過程と興奮性イオン型グルタミン酸受容体の開口放出を変調することができます。表面と内部の受容体人口プールを定量化するためのアクセス可能な高アッセイは、ここで説明しました。...

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。...

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。...

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。...

哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

学ぶGABA_A受容体の膜局在化とエンドサイトーシスを海馬ニューロンで測定する方法。α-ブンガロトキシンと蛍光Alexa色素を用いて標識し、共焦点顕微鏡で受容体動態を可視化します。

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

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