パルプ工場廃棄物流上での微生物増殖を促進する方法および培養微生物の生分解能の特性評価

次の実験の全体的な目標は、微生物または微生物のコンソーシアムが、成長に使用されている黒液の成分であるパルプ化廃棄物の黒液、およびこのパルプ化廃棄物の微生物代謝によって生成される製品を利用する能力を決定することです。これは、パルプ化廃液である黒液を回収し、培地成分として使用するために準備することで達成されます。第2のステップとして、リグノセルロース成分が抽出され、微生物の炭素源要件を決定するために使用されます。

次に、微生物が黒液とその成分で増殖する微生物の能力を決定するために、培地を調製、接種、および微生物の増殖について分析します。結果は、最小限の培地寒天プレートで視覚化された微生物環境分離物とGCMSによる代謝産物の成長と合成のための唯一の炭素源としての黒液の利用を示しています。この手法のアイデアを思いついたのは、パルプ廃棄物で微生物が増殖する可能性や、パルプ工場から直接微生物を分離できるのではないかという議論をしていたときでした。

水酸化ナトリウム漂白のような既存の方法に対するジニャルセロース抽出技術の主な利点は、塩化ナトリウム漂白が高純度で増加していることです。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。TheoセルロースとGCMSのサンプル調製ステップは習得が困難であるため、これは必要なステップの数と、プロセスの完了を確認するために必要な視覚的な決定によるものです。

この方法は、黒液の微生物分解に関する洞察を提供するだけでなく、作物残渣、森林残渣、都市固形廃棄物などのマグノセルロース材料を含む産業廃棄物の流れにも適用できます。この手順を開始するには、クラフト消化器に取り付けられた出口バルブと滅菌ガラス瓶から黒液サンプルを採取し、室温まで冷ましてから次のステップに進みます。次に、攪拌棒を装備した500ミリリットルのビーカーに100ミリリットルの黒液サンプルを加え、サンプルを中速で攪拌します。

黒液が粘性になるまでリン酸を滴下して中和します。この分注に続いて、すべての黒液溶液を50ミリリットルの円錐管に入れ、サンプルを9、300Gで30分間遠心分離します。炭水化物を分離するには、5グラムの1ミリメートル以下の製粉スイッチグラスと攪拌子を500ミリリットルのフラスコに入れます。

次に、200ミリリットルの蒸留水、7.5グラムの亜塩素酸ナトリウム、および2.5ミリリットルの氷酢酸を追加します。フラスコを摂氏80度の攪拌板の上に置いたオイルバスに1時間置きます。次に、さらに7.5グラムの塩化ナトリウムと2.5ミリリットルの氷酢酸をフラスコに加えます。

前の手順を2回繰り返した後、摂氏80度で30分間攪拌を続けます。溶液を室温まで冷まします。次に、真空下でブフナー漏斗でろ過し、固体材料を分離します。

固形物を100ミリリットルの蒸留水で3回洗浄します。次に、1グラムの固体材料を集めて、きれいな濾紙の上に置きます。固体を摂氏50度に置き、一晩乾燥させます。

翌日、サンプルをオーブンから取り出した後、中空細胞とラベル付けされた保存バイアルに移します。残りの固体材料を500ミリリットルのフラスコに250ミリリットルの水酸化ナトリウムを加え、フラスコをストッパーでキャップします。溶液を摂氏70度のインキュベーターに1時間置き、250RPMで振とうします。

その後、溶液を室温まで冷まします 30分後、ブフナー漏斗を使用した真空ろ過により固体材料を分離します。固形残留物を摂氏50度のオーブンで一晩乾燥させたら、セルロースとラベル付けされた保存バイアルに入れます。濾液を500ミリリットルのフラスコに移し、30ミリリットルの酢酸と250ミリリットルのイソプロピルアルコールキャップを加え、得られた溶液を室温で少なくとも8時間ベンチトップに置きます。

終了したら、すべての溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、サンプルを9,300Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、溶液を円錐形チューブから慎重にピペットで取り出し、廃棄します。次に、ペレットを30ミリリットルの蒸留水でボルテックスし、9, 300Gで30分間遠心分離して洗浄します。

この手順を15回繰り返して、ペレットを完全に洗浄します。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを分離して凍結乾燥させます。サンプルを凍結乾燥したら、ヘミセルロースとラベル付けしたバイアルに入れます。

リグニン分離には、ポイント25モル水酸化ナトリウムと30%エタノールの500ミリリットル溶液に、1ミリメートル以下の粉砕スイッチグラスを5グラム加えます。スラリーを摂氏75度のインキュベーターに入れ、250RPMで2時間振とうします。冷溶液をろ過した後、フラスコに攪拌棒を追加し、中速に調整された攪拌板の上に置きます。

pH 2が得られるまで、濃塩酸を濾液に滴下します。溶液を室温で一晩放置します。溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに移したら、サンプルを9,300GSで30分間遠心分離します。

終了したら、溶液を円錐形のチューブから慎重にピペットで取り出し、廃棄します。ペレットを30ミリリットルの蒸留水でボルテックスし、9, 300Gで30分間遠心分離して洗浄します。この手順を15回繰り返して、ペレットを完全に洗浄します。

遠心分離後、仰臥位のナタントを取り出して、凍結乾燥用のペレットを分離します。凍結乾燥したら、リグニンとラベル付けしたバイアルにサンプルを入れます。滅菌125ミリリットルのフラスコに50ミリリットルの滅菌M nine最小培地を追加します。

次に、黒液の10体積をメディアに追加します。接種のためには、混合物に一晩の細菌培養物の0.1体積を加え、200RPMで振とうしながらインキュベーターで摂氏37度で培養物をインキュベートします。中間対数期では、国連接種および接種細菌培養物の遠心分離後、注射器を使用して密封された滅菌嫌気性血清ボトルに細菌を移します。

成長の450時間後、各上清の10ミリリットルを別々のガラス試験管に加えます。各上清を濃塩酸で酸性化し、pH 1〜2に滴下します。各サンプルについて、30ミリリットルの酢酸エチルをスープラナタントに加えます。

試験管にキャッピングした後、チューブを4〜6回反転させて溶液を混合します。次に、1〜2グラムの無水硫酸ナトリウムを清潔なガラス試験管に入れます。使い捨てガラス製パスチャーピペットでピペッティングすることにより、上部の有機層を慎重に収集します。

無水硫酸ナトリウムを含む試験管に有機層を置きます。試験管を軽くたたいて徐々に混合することにより、無水硫酸ナトリウムの上の有機層を脱水します。無水硫酸ナトリウムを少量加え、大きな塊がなくなるまで混ぜます。

これに続いて、真空下でブフナー漏斗を通して溶液をろ過し、次に溶液を蒸発フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを使用して濾液を蒸発させます。終了したら、3ミリグラムの酢酸エチル抽出残留物を2ミリリットルの琥珀色のクロマトグラフィーバイアルに入れます。残留物を100マイクロリットルの1つの4ジオキサンと10マイクロリットルのピリジンで溶解します。

次に、バイアルに1%トリメチル塩素を含むB-S-T-F-Aの溶液を50マイクロリットル加えます。溶液を摂氏60度のインキュベーターに置き、15分間振とうします。GCMSでサンプルを分析します。

クラフトパルプ化プロセスで生成された黒液の収集と改質は、このパルプ化廃棄物を使用して、単一の細菌分離物または混合培養物の生分解能力を決定するためのものです。ここに示されているのは、LB培地およびLB培地に10%中和黒液を添加した環境株の光学密度によって測定された好気性成長です。これらの結果は、この細菌が黒液の存在下で増殖することを示しています。

LB培地中の環境分離物の成長は、黒液の存在下で成長した場合よりも速くなりますが、光学密度は62時間後に減少し始めます。一方、黒液の存在下での微生物環境分離物の成長は、成長の230時間後まで光学密度で増加し続けます。黒液の存在下での微生物環境分離物の成長曲線も二相性の成長を示しており、これは、黒液が微生物環境分離物によって使用できる複数の炭素源を含んでおり、細菌が示す栄養素利用の好みがあることを示唆しています。

成長要件に黒液を利用する能力を決定するには、さらなる実験が必要です。また、中和されていない黒液に対する細菌の増殖を決定したり、黒液の濃度の増加が成長に及ぼす影響を判断したりすることもできます。黒液の成長を実証した後、最小限の培地成長実験を使用して炭素源の利用を決定できます。

リグノセルロースの成分を構成する市販の基質は、最小限の媒体で炭素源として使用できます。ここに提示されるLIGNOCELLULOSEの抽出の議定書はここにM nineの環境微生物の分離物の成長がある写真の細菌の成長の条件を決定するためのモデルを提供する。リグノセルロース抽出の各成分を添加した最小限の培地寒天

最小培地寒天プレート上のコロニーの存在は、環境分離物がM nineに存在するホロセルロース、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンコロニーを分解する能力を示しています。最小限の媒体は、プレートの代わりに寒天を分解する環境分離物の能力を示唆している可能性があります。液体培養の最小培地成長曲線を使用して、各リグノセルロース画分の特定の成長速度を決定することもできるため、潜在的な炭素源である可能性のある寒天を添加する必要はありません。

GCMSによる抽出された眼と誘導された眼、細菌培養の分析により、産生された代謝産物が明らかになります。ここに示されているのは、未接種サンプル中に存在するTMS誘導体のGCMSスペクトル、嫌気的に成長した場合に環境微生物分離物によって生成されるTMS誘導体のスペクトル、およびM nine、10%の中和されていない黒液を含む最小培地がここに描かれています。2つのスペクトルを比較すると、培地中に存在する成分の違いが明らかになり、発酵生成物の存在と黒液成分の劣化が示唆されます。

接種したサンプルには、保持時間が39.34分のピークが現れました。21ポイント84分の保持時間を有するピークが接種したサンプルで増加した。保持時間が 25.79 のピークは、接種したサンプルで減少しました。

ここに示されているスペクトルは、保持時間が 25.79 分でピークを特定するために使用された guac 標準のスペクトルです。このビデオを見た後、微生物または微生物のコンソーシアムが黒液を分解できるかどうかを判断する方法についてよく理解しているはずです。さらに、このプロトコルに従って、成長曲線などの他の方法を使用して、さまざまな濃度の黒液またはライゴンセルロース抽出成分の微生物または微生物の成長率に関する追加の質問に答えることができます。