Name: の組織化学的染色シロイヌナズナ二次細胞壁の要素 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ組織化学的染色法でシロイヌナズナの二次細胞壁要素を可視化する方法です。包埋、切片、染色、顕微鏡観察の手順を含み、異なる細胞型の差異的染色パターンを明らかにします。

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我々は編集支援のためのセービンラッセルに感謝しています。この作品は、ローレンス·バークレーとの間の契約DE-AC02-05CH11231を通じてエネルギー省合同バイオエナジー研究所（http://www.jbei.org）米国エネルギー省でサポートされている、科学局、生物環境研究局の一部であった国立研究所と米国エネルギー省。

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著者らには開示すべき金銭的紛争はない。

シロイヌナズナステム部が広く二次細胞壁中の細胞の組織化を研究し、定性的に、野生型およびトランスジェニック植物の間の差を調べるために使用される。標本を区画するために一般に使用される技術は、直接手で切っている。標本はアガロースまたは固定液に埋め込まれたとき、または、切片をビブラトームまたはミクロトームで行うことができます。手の切断とは対照的に、最後の二つは、単にサンプルと凹凸面との間の厚さの違いに起因する不良試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成する危険性を低減することを可能にする。これらのメソッドはすべて、彼らの長所と短所を持っている。私たちは、ビブラトームを使用して切片化した後、アガロース中に埋め込むことを選んだ、と次のような理由でそのようにした：新鮮な組織の複雑な処理が不要に埋め込むのしやすさと時間アガロースを使用して過ごした。また、私たちの手作りの金型を作るのは簡単で安価である、目を保持することができますEストレートステム、長年にわたって使用することができ、混乱を行わずに試験片の容易なリリースでは助けることができます。高割合のアガロースを溶解し、均一な溶液（分厚い顆粒を形成することなく、100ミリリットル...

リグニン、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、グルクロノキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、混合連鎖グルカン、またはグルコマンナン）、およびペクチン：植物細胞壁は、その様々な構成要素内の情報の過多を保持している。組織学的技術は、組織および細胞レベルでの二次細胞壁の中の違いを研究する上で重要な視覚的な手がかりを提供する。様々な組織学的技術が開発されており、文献に記載されていますが、これまでに利用可能な場合、単純な視覚的な指示に非常に詳細なプロトコルはめったにないため、これらの技術は、初心者のために挑戦し、時間がかかる場合があります。本研究の目的は、高品質の画像を得るために組織学的染色技術のための簡単​​なガイドラインを提供することである。 茎組織を区画すると、細胞壁と細胞形状の可視化の最初のステップです。ハンドカットのセクションでは、安価であり、準備する時間がかからないが、ビブラトームを使用すると、一貫性を提供し、高品質の画像が得られる。ビブラトームを使用すると、シャープな画像を生成するのに役立ち、著しく単純悪い試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成するリスクを低減し、同じ厚さであってもセクションを生成することにより、より良好なデータ品質を製造することができる。新鮮な標本を修正するために樹脂を使用すると、初心者のための挑戦することができますし、分析を迅速に行う必要があるときもまだ専門家のために、時間がかかる場合があります。また、それは、樹脂中に埋め込まれたときに試料に任意の生物学的活性を測定することができなくなる。アガロース及び自家製の金型を用いたOne簡単な手法は、幹組織を包埋するのに役立ち、それはまた、軟組織の切開を必要とする他の用途に利用することができる。樹脂中に包埋標本を比較すると、この方法は、生きている組織を維持し、サンプル操作を低減するという利点を有する。ビブラトームを経由して組織を切片化することは、非常に正確であるとhomogenを生成研究の目的に応じて、組織単位（OU）のセクションでは、次に、いくつかの異なる染色技術と共に使用することができる。 リグニンおよび他の芳香族化合物を可視化するための最も簡単な方法は、紫外線（UV）光を使用する。 UV光による芳香族系分子の励起は古い技術であるが、それはまだリグニンの可視化のための最速の方法の一つです。 UV光は、他の芳香族化合物を励起するので、UV可視化は、実際にはリグニンを検出するための理想的ではない。 1-3：リグニンは、主に以下の3つのビルディングブロック、モノリグノール（コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、およびp-クマリルアルコールhydroxycinnamylアルコール）で構成されている。フロログルシノール染色は木部に存在シンナムアルデヒド、繊維、および気管組織4の範囲で手がかりを提供することができます。フロログルシノールは、一般的なシンナムアルデヒドの良好な指標であり、シンナムアルデヒド、その他の芳香族化合物を区別することができます。シナピルアルコールモノマーは検出することができるとマウレ染色を使用して分化した。トルイジンブルーO多色性染料であり、したがって異なる色5,6における細胞壁の異なる要素を染色する能力を有する。トルイジンブルーOの主な用途は、ペクチンとリグニン5,6を検出することである。トルイジンブルーOを使用する利点は、細胞壁の多くの要素は、単一のステップで可視化することができることである。カルコフロールホワイトおよびコンゴーレッドの両方を作成すると処理が容易であり、セルロースを可視化するために使用することができる。 ·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン6-9、コンゴレッド汚れが直接、特に10,11-β（1→4） -グルカンとセルロースにするのに対し。この研究の目的は、A.より高品質の画像を得るために、前述の染色技術を使用するための簡単なガイドラインを提供することであるシロイヌナズナの茎 。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス<td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS番号:9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-トリヒドロキシベンゼン[CAS番号:108-73-6]</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS番号:7647-01-0</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS番号:1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>塩化ブルテン、塩化トロニウム[CAS番号92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS番号 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール190プルーフ</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS番号:64-17-5</td></tr><tr><td>コンゴレッド</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>C6277二</td><td>ナトリウム3,3'-[[1,1'-ビフェニル]-4,4'-ジイルビス(アゾ)]ビス(4-アミノナフタレン1-スルホン酸)[CAS番号573-58-0]</td></tr><tr><td>蛍光増白剤28 /カルコフローホワイトステイン</td><td>シグマ</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'-ビス[[4-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-6-アニリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]アミノ]スチルベン-2,2'-ジスルホン酸[CAS番号4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>バイブレーター</td><td>ライ</td><td>カライカ振動ブレードミクロトームVT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>カミソリ</td><td>アメリカの安全カミソリ会社</td><td>アイテム#60-0139-0000&nbsp;</td><td>ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)</td></tr><tr><td>スクリューキャップ微量遠心チューブ(2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(0.6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>ミット</td><td>ベルアート</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp;ホットハンドプロテクターミット</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>テッドペラ株式会社</td>1003344444444日<td></td><td>で4&deg;C または 20 &deg;C 3ヶ月以上保存可能</td></tr><tr><td></td><td>電子レンジ パナソニック</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 インスタントティッシュ接着剤&nbsp;</td></tr><tr><td>メカニカルシャッターなしのCCDチップ付きカメラ&nbsp;</td><td>浜松</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカラーカメラ&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>カメラソフトウェア&nbsp;</td><td>&nbsp;Molecular Devices</td><td>MetaMorph version 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>解析のイメージ&nbsp;</td><td>アドビ&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーメガネ、スクエア、No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm(7/8 x 7/8 ")-カバーメガネは耐腐食性があり、均一に厚くて平らです。No.1の厚さは0.13〜0.17mmです。</td></tr><tr><td>つや消しマイクロスライド、1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>アルカン包装</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 フィルターキューブ</td><td>ライカ</td><td>11513851/11513885</td><td>560/40 のバンドパスでコンゴの赤の分析に使用されます。</td></tr></tbody></table>

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

シロイヌナズナは、植物のさまざまな細胞プロセスを理解し操作するために一般的に使用されるモデル生物であり、二次細胞壁形成の研究に広く使用されてきました。二次細胞壁の堆積は、一次細胞壁が敷設された後に発生し、これは血管組織や繊維組織を形成する細胞などの特殊な細胞によってのみ実行されるプロセスです。ほとんどの二次細胞壁は、セルロース(40〜50%)、ヘミセルロース(25〜30%)、およびリグニン(20〜30%)で構成されています。二次細胞壁生合成に影響を与えるいくつかの突然変異が単離されており、対応する変異体は、これらの突然変異が代償性応答によって隠される可能性があるため、明らかな生化学的組成の変化または視覚表現型を示す場合と示さない場合があります。染色手順は、歴史的に細胞ベースで違いを示すために使用されてきました。これらの方法は、分析の視覚的な手段のみです。それにもかかわらず、迅速かつ批判的な分析における彼らの役割は非常に重要です。コンゴレッドとカルコフルオロホワイトは多糖類の検出に使用される染色剤ですが、モイレとフロログルシノールはリグニンの違いを決定するために一般的に使用され、トルイジンブルーOは多糖類とリグニンの鑑別染色に使用されます。切片作製、染色、イメージングという一見単純な技術は、初心者にとっては難しいものです。この研究では、A. thalianaモデルを使用したサンプル調製から始めて、植物の二次細胞壁における細胞および組織組織の観察のために簡単に実施できるさまざまな染色方法のプロトコルについて詳しく説明します。

埋め込みと分割幹： 埋め込 ​​むための自家製のプラスチック金型の使用は、アガロース迅速かつ簡単に（ 図1）であることが判明した7％で生じる。二つの部分（AとB、 図1）組み込みバイアルシステムのは、それが簡単な、容易にクリーンなシステムを維持し、アガロースが不活性であるバイアル部分に付着しないようにアガロース中に埋め込 ​​まれた茎を解放すること。バイアルは何年も複数回再使用することができる。埋め込まれた茎を格納する利便性にも次のステップが容易になります。茎組み込み、同様の、いつか節約するために切片化のため、単一の切片板の上に（3まで）にグループ化することができます。 UV下で芳香族化合物の観察： 幹切片をガラススライド上に蒸留水に搭載され、UV光の下で観察した。細胞中のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光の下で、それらの自己蛍光により可視化することができる。木部（XY）とfasciclesの間の繊維（FI）リグニン、芳香族ポリマーは、二次細胞壁の生合成の間に堆積されているので、UV照射...

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

この手順の目的は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のANA二次細胞壁成分の組織化学染色を示すことです。まず、植物の茎をアロス（aros）に埋め込みます。次に、アロスに埋め込まれた茎を脱型して標本ディスクに移し、ビブラトームを用いて茎の横断切片を作成します。次に、切片に対してさまざまな組織化学的染色処置を行います。最終的に、顕微鏡を用いて、組織化学的染色によって得られた二次細胞壁構成要素の分化による変化を観察します。この手法は、植物茎における斑点組織の変化など、細胞壁に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う方は苦労することがあります。というのも、本プロトコルで述べているシンプルながらも重要な手順が、これまで十分に文書化されていなかったか、あるいは簡潔に提示されていなかったためです。まず、プラスチック製バイアルを用いて、茎を埋め込むための自家製モールドを準備します。最初に、カミソリで2 mLスクリューキャップ式マイクロ遠心チューブの円錐形の底部を切り落とします。このコンポーネントをパートAと呼び、チューブキャップに、埋め込むステムの直径よりわずかに大きいシリンジ針用の穿刺孔を設けます。次に、0.6 mL マイクロ遠心チューブの底から0.5 cm分を切り取ります。このコンポーネントをパートBと呼びます。切り取った0.6 mL マイクロ遠心チューブの0.5 cm分を、あらかじめ切り込みを入れた2 mL マイクロ遠心チューブの中に入れます。パラフィルムを使用して2つのパーツを密封します。カミソリを使用して、目的の領域から茎のセクションを切り出します。7%aros溶液を電子レンジの低出力で加熱して溶かします。溶けたarosが約50 degrees Celsiusまで冷却されたら、5 millilitersのagrosをあらかじめ用意したプラスチック製モールドにゆっくりとピペットで注入し、バイアルを満たします。アロースが30〜60秒間冷却され、半凝固状態になったら、ステムをアロースを満たしたバイアルに入れます。次に、ステムの先端がキャップで固定されるように、穿孔キャップを装着します。バイアルを室温または4°Cで10〜30分間放置し、凝固させます。チューブから型をゆっくりと滑らせるようにして取り出します。パラフィルムを開け、型のパートBの底部を親指で軽く押し、凝固したアロスをパートAからガラス顕微鏡スライド上に放出させます。スライドカットを行います。アロスに埋め込まれた茎を、約1.2 cmの長さに3等分します。アロスの外側にある茎の部分を切り取り、廃棄します。試料ディスクが清潔で完全に乾燥していることを確認してください。柔らかいペーパーワイプを使用して、標本が入ったarosブロックから水分を完全に取り除きます。標本ディスクの上に組織接着剤を少量滴下します。標本が、横断面の場合はプレートに対して垂直に、またはプレートと平行になるように、arosブロックを素早く配置します。縦断切片を作成する場合、接着剤を用いてサンプルを標本ディスクに固定し、室温または4°Cで10〜30分間静置します。標本ディスクを緩衝液トレイまたはアロスブロックに固定し、切断面がカミソリ刃と平行になるように配置します。サンプルが完全に浸るまで、室温の蒸留水を緩衝液トレイに満たします。カミソリの刃を半分に切り、丈夫なハサミで端を整えて、刃が完全に平らな状態になるようにします。あらかじめ切っておいたカミソリの刃の半分をナイフホルダーに取り付けます。ナイフホルダーの角度を84度、速度を0.90 millimeters per second、周波数を50 hertzに設定します。連続モードを用いて、切片を100 micronの厚さに切断します。切断中、バッファー用トレイ内で使い捨てプラスチックピペットを用いて切片を回収します。数枚の切片を2 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、フルオロール染色を行います。茎の切片をマイクロ遠心チューブに移します。チューブに1 mLのフルオロール溶液を加え、すぐに蓋を閉めます。フルオログルカノール染色の塩酸は腐食性が非常に強いため、チューブを静かに動かして、すべての切片が染色されるようにしてください。切断したピペットチップを用いて、切片を慎重に顕微鏡スライドグラス上へ移します。切片にカバーガラスをかけます。明視野照明下で切片を観察します。溶液は5～10分で乾燥し、試料の劣化を招きます。したがって、イメージングはこの時間内に完了させる必要があります。脱染色を行う場合は、茎の切片をマイクロ遠心チューブに移してください。切片が入ったチューブに0.5%過マンガン酸カリウム溶液を1 mL加えます。切片を乱さないように注意しながら、0.5%過マンガン酸カリウム溶液をピペットで穏やかに吸い上げ、吐き出します。2分間のインキュベーションとピペッティングの繰り返し後、すべての切片が沈殿するまでマイクロ遠心チューブを静置します。1 mLピペットを用いて、0.5%過マンガン酸カリウム溶液を700 µL吸い出し、さらに蒸留水を700 µL加えて過マンガン酸カリウムを洗い流します。この操作を3〜4回、または水溶液が透明になるまで繰り返します。水を廃棄した後、切片から濃褐色が消失するまで3%塩酸を1 mL迅速に加えます。この操作は3〜5分以内に完了する場合もありますが、5分間の洗浄を2回行う必要がある場合もあります。3%塩酸溶液をすべてピペットで吸い出し、直ちに1mLの濃アンモニア水を加えます。コンゴレッド染色の明視野照明下での観察を行う前に、茎の切片をマイクロ遠心チューブに移し、0.5%コンゴレッド溶液を1mL加えます。切片を乱さないように、0.5% Congo red溶液をピペットで静かに吸い上げ、戻してください。本文のプロトコルに従って切片のインキュベーションおよび洗浄を行う前に、切片をカットしたピペットチップで静かに吸い上げ、顕微鏡スライドグラス上に移します。その後、カバーガラスで覆ってください。顕微鏡でサンプルを観察します。カルシオールホワイト染色を確認するため、560 nanometerのエミッションフィルターを用い、青色光励起下でスライドを観察してください。茎の切片をマイクロ遠心チューブに移し、0.02%カルシオールホワイト溶液を1 milliliter加えます。ピペットを用いて、溶液を優しく吸い上げ、吐き出しを繰り返します。次に、テキストプロトコルに従って切片のインキュベーションと洗浄を行い、UVライト下で切片を観察します。トルイジンブルーO染色を行う場合は、茎の切片をマイクロ遠心チューブに移します。次に、0.02% toluidine blue O溶液を1 mLチューブに加え、ピペットで穏やかに吸い上げと吐き出しを繰り返して混ぜ合わせます。その後、テキストプロトコルに記載されている通りに切片をインキュベートおよび洗浄し、明視野照明下で観察します。イメージングのための顕微鏡およびカメラの設定、ならびに紫外線および明視野イメージングの手順の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。細胞内のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光下での自家蛍光によって可視化できます。UV照射下において、道管および界面繊維は自家蛍光を示しましたが、髄、皮層、および表皮では示されませんでした。これは、リグニンおよび芳香族ポリマーが二次細胞壁の生合成中に沈着するためです。一方で、フルオロール染色はリグニンのアルデヒド末端基と反応し、UV照射下で観察されるようなピンク色またはフューシャ色を呈します。道管および界面繊維ではフューシャ色の着色が観察されますが、髄、皮層、および表皮では認められません。通常、色の強度は木化の程度と定性的に相関します。MALS染色は、道管および間接繊維におけるingalリグニン単位を特異的に検出します。赤色の着色は、リグニン要素にingalリグニン単位が存在することを示しています。しかしながら、道管組織と比較して繊維ではより鮮やかな赤色の呈色が観察され、これは繊維にingalリグニンが高レベルで含まれているのに対し、道管組織にはguaリグニン単位がより豊富に含まれていることを示唆している。calcior whiteで染色した茎の切片をUV光下で観察したところ、表皮、皮層、および髄が染色された。これは、これらの組織の細胞壁に主要な多糖類ポリマーとしてセルロースが含まれているためである。コンゴーレッドで染色した切片を青色光励起下で観察したところ、同様に表皮、皮層、および髄が染色された。calciorとは対照的に、白色コンゴーレッドは木部および interf 繊維の多糖類をより良好に染色し、リグニンの存在による影響をあまり受けないようでした。Odine Blue Oは、多色染色の標本が得られるため、多色性染料に分類されます。Odine blue Oは、負に帯電した基に結合して異なる色を生成するイオン性染料です。染料が細胞内の異なるイオン基と結合するため、茎の横断面をスタインブルーOで染色すると、道管および束間繊維が緑青色または青色に染まり、木化していることが明らかになりました。これはUVおよびフルオログルカンによる結果と一致しています。対照的に、髄、皮層、および表皮組織も緑青色または青色に染まりますが、これは木化していないものの、細胞壁に一部のペクチンポリマーが含まれているためです。このビデオを視聴することで、植物の茎の切片作成方法と、さまざまな組織化学的染色を用いて植物細胞壁の各組織を分染する方法について十分に理解できたはずです。

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