Name: の組織化学的染色シロイヌナズナ二次細胞壁の要素 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ組織化学的染色法でシロイヌナズナの二次細胞壁要素を可視化する方法です。包埋、切片、染色、顕微鏡観察の手順を含み、異なる細胞型の差異的染色パターンを明らかにします。

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我々は編集支援のためのセービンラッセルに感謝しています。この作品は、ローレンス·バークレーとの間の契約DE-AC02-05CH11231を通じてエネルギー省合同バイオエナジー研究所（http://www.jbei.org）米国エネルギー省でサポートされている、科学局、生物環境研究局の一部であった国立研究所と米国エネルギー省。

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著者らには開示すべき金銭的紛争はない。

シロイヌナズナステム部が広く二次細胞壁中の細胞の組織化を研究し、定性的に、野生型およびトランスジェニック植物の間の差を調べるために使用される。標本を区画するために一般に使用される技術は、直接手で切っている。標本はアガロースまたは固定液に埋め込まれたとき、または、切片をビブラトームまたはミクロトームで行うことができます。手の切断とは対照的に、最後の二つは、単にサンプルと凹凸面との間の厚さの違いに起因する不良試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成する危険性を低減することを可能にする。これらのメソッドはすべて、彼らの長所と短所を持っている。私たちは、ビブラトームを使用して切片化した後、アガロース中に埋め込むことを選んだ、と次のような理由でそのようにした：新鮮な組織の複雑な処理が不要に埋め込むのしやすさと時間アガロースを使用して過ごした。また、私たちの手作りの金型を作るのは簡単で安価である、目を保持することができますEストレートステム、長年にわたって使用することができ、混乱を行わずに試験片の容易なリリースでは助けることができます。高割合のアガロースを溶解し、均一な溶液（分厚い顆粒を形成することなく、100ミリリットル...

リグニン、セルロース、ヘミセルロース（キシラン、グルクロノキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、混合連鎖グルカン、またはグルコマンナン）、およびペクチン：植物細胞壁は、その様々な構成要素内の情報の過多を保持している。組織学的技術は、組織および細胞レベルでの二次細胞壁の中の違いを研究する上で重要な視覚的な手がかりを提供する。様々な組織学的技術が開発されており、文献に記載されていますが、これまでに利用可能な場合、単純な視覚的な指示に非常に詳細なプロトコルはめったにないため、これらの技術は、初心者のために挑戦し、時間がかかる場合があります。本研究の目的は、高品質の画像を得るために組織学的染色技術のための簡単​​なガイドラインを提供することである。 茎組織を区画すると、細胞壁と細胞形状の可視化の最初のステップです。ハンドカットのセクションでは、安価であり、準備する時間がかからないが、ビブラトームを使用すると、一貫性を提供し、高品質の画像が得られる。ビブラトームを使用すると、シャープな画像を生成するのに役立ち、著しく単純悪い試料調製に起因するサンプル間の不正確な差を生成するリスクを低減し、同じ厚さであってもセクションを生成することにより、より良好なデータ品質を製造することができる。新鮮な標本を修正するために樹脂を使用すると、初心者のための挑戦することができますし、分析を迅速に行う必要があるときもまだ専門家のために、時間がかかる場合があります。また、それは、樹脂中に埋め込まれたときに試料に任意の生物学的活性を測定することができなくなる。アガロース及び自家製の金型を用いたOne簡単な手法は、幹組織を包埋するのに役立ち、それはまた、軟組織の切開を必要とする他の用途に利用することができる。樹脂中に包埋標本を比較すると、この方法は、生きている組織を維持し、サンプル操作を低減するという利点を有する。ビブラトームを経由して組織を切片化することは、非常に正確であるとhomogenを生成研究の目的に応じて、組織単位（OU）のセクションでは、次に、いくつかの異なる染色技術と共に使用することができる。 リグニンおよび他の芳香族化合物を可視化するための最も簡単な方法は、紫外線（UV）光を使用する。 UV光による芳香族系分子の励起は古い技術であるが、それはまだリグニンの可視化のための最速の方法の一つです。 UV光は、他の芳香族化合物を励起するので、UV可視化は、実際にはリグニンを検出するための理想的ではない。 1-3：リグニンは、主に以下の3つのビルディングブロック、モノリグノール（コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、およびp-クマリルアルコールhydroxycinnamylアルコール）で構成されている。フロログルシノール染色は木部に存在シンナムアルデヒド、繊維、および気管組織4の範囲で手がかりを提供することができます。フロログルシノールは、一般的なシンナムアルデヒドの良好な指標であり、シンナムアルデヒド、その他の芳香族化合物を区別することができます。シナピルアルコールモノマーは検出することができるとマウレ染色を使用して分化した。トルイジンブルーO多色性染料であり、したがって異なる色5,6における細胞壁の異なる要素を染色する能力を有する。トルイジンブルーOの主な用途は、ペクチンとリグニン5,6を検出することである。トルイジンブルーOを使用する利点は、細胞壁の多くの要素は、単一のステップで可視化することができることである。カルコフロールホワイトおよびコンゴーレッドの両方を作成すると処理が容易であり、セルロースを可視化するために使用することができる。 ·ホワイト汚れセルロース、カロース、および他の非置換または弱置換されたβ-グルカン6-9、コンゴレッド汚れが直接、特に10,11-β（1→4） -グルカンとセルロースにするのに対し。この研究の目的は、A.より高品質の画像を得るために、前述の染色技術を使用するための簡単なガイドラインを提供することであるシロイヌナズナの茎 。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス<td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS番号:9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-トリヒドロキシベンゼン[CAS番号:108-73-6]</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS番号:7647-01-0</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS番号:1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>塩化ブルテン、塩化トロニウム[CAS番号92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS番号 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール190プルーフ</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS番号:64-17-5</td></tr><tr><td>コンゴレッド</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>C6277二</td><td>ナトリウム3,3'-[[1,1'-ビフェニル]-4,4'-ジイルビス(アゾ)]ビス(4-アミノナフタレン1-スルホン酸)[CAS番号573-58-0]</td></tr><tr><td>蛍光増白剤28 /カルコフローホワイトステイン</td><td>シグマ</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'-ビス[[4-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-6-アニリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]アミノ]スチルベン-2,2'-ジスルホン酸[CAS番号4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>バイブレーター</td><td>ライ</td><td>カライカ振動ブレードミクロトームVT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>カミソリ</td><td>アメリカの安全カミソリ会社</td><td>アイテム#60-0139-0000&nbsp;</td><td>ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)</td></tr><tr><td>スクリューキャップ微量遠心チューブ(2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(0.6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>ミット</td><td>ベルアート</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp;ホットハンドプロテクターミット</td></tr><tr><td>ティッシュ接着剤</td><td>テッドペラ株式会社</td>1003344444444日<td></td><td>で4&deg;C または 20 &deg;C 3ヶ月以上保存可能</td></tr><tr><td></td><td>電子レンジ パナソニック</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 インスタントティッシュ接着剤&nbsp;</td></tr><tr><td>メカニカルシャッターなしのCCDチップ付きカメラ&nbsp;</td><td>浜松</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカラーカメラ&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>カメラソフトウェア&nbsp;</td><td>&nbsp;Molecular Devices</td><td>MetaMorph version 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>解析のイメージ&nbsp;</td><td>アドビ&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーメガネ、スクエア、No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm(7/8 x 7/8 ")-カバーメガネは耐腐食性があり、均一に厚くて平らです。No.1の厚さは0.13〜0.17mmです。</td></tr><tr><td>つや消しマイクロスライド、1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>アルカン包装</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 フィルターキューブ</td><td>ライカ</td><td>11513851/11513885</td><td>560/40 のバンドパスでコンゴの赤の分析に使用されます。</td></tr></tbody></table>

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

シロイヌナズナは、植物のさまざまな細胞プロセスを理解し操作するために一般的に使用されるモデル生物であり、二次細胞壁形成の研究に広く使用されてきました。二次細胞壁の堆積は、一次細胞壁が敷設された後に発生し、これは血管組織や繊維組織を形成する細胞などの特殊な細胞によってのみ実行されるプロセスです。ほとんどの二次細胞壁は、セルロース(40〜50%)、ヘミセルロース(25〜30%)、およびリグニン(20〜30%)で構成されています。二次細胞壁生合成に影響を与えるいくつかの突然変異が単離されており、対応する変異体は、これらの突然変異が代償性応答によって隠される可能性があるため、明らかな生化学的組成の変化または視覚表現型を示す場合と示さない場合があります。染色手順は、歴史的に細胞ベースで違いを示すために使用されてきました。これらの方法は、分析の視覚的な手段のみです。それにもかかわらず、迅速かつ批判的な分析における彼らの役割は非常に重要です。コンゴレッドとカルコフルオロホワイトは多糖類の検出に使用される染色剤ですが、モイレとフロログルシノールはリグニンの違いを決定するために一般的に使用され、トルイジンブルーOは多糖類とリグニンの鑑別染色に使用されます。切片作製、染色、イメージングという一見単純な技術は、初心者にとっては難しいものです。この研究では、A. thalianaモデルを使用したサンプル調製から始めて、植物の二次細胞壁における細胞および組織組織の観察のために簡単に実施できるさまざまな染色方法のプロトコルについて詳しく説明します。

埋め込みと分割幹： 埋め込 ​​むための自家製のプラスチック金型の使用は、アガロース迅速かつ簡単に（ 図1）であることが判明した7％で生じる。二つの部分（AとB、 図1）組み込みバイアルシステムのは、それが簡単な、容易にクリーンなシステムを維持し、アガロースが不活性であるバイアル部分に付着しないようにアガロース中に埋め込 ​​まれた茎を解放すること。バイアルは何年も複数回再使用することができる。埋め込まれた茎を格納する利便性にも次のステップが容易になります。茎組み込み、同様の、いつか節約するために切片化のため、単一の切片板の上に（3まで）にグループ化することができます。 UV下で芳香族化合物の観察： 幹切片をガラススライド上に蒸留水に搭載され、UV光の下で観察した。細胞中のリグニンを含む芳香族化合物は、UV光の下で、それらの自己蛍光により可視化することができる。木部（XY）とfasciclesの間の繊維（FI）リグニン、芳香族ポリマーは、二次細胞壁の生合成の間に堆積されているので、UV照射...

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

この手順の目的は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のANA二次細胞壁成分の組織化学染色を示すことです。まず、植物の茎をアロス（aros）に埋め込みます。次に、アロスに埋め込まれた茎を脱型して標本ディスクに移し、ビブラトームを用いて茎の横断切片を作成します。次に、切片に対してさまざまな組織化学的染色処置を行います。最終的に、顕微鏡を用いて、組織化学的染色によって得られた二次細胞壁構成要素の分化による変化を観察します。この手法は、植物茎における斑点組織の変化など、細胞壁に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う方は苦労することがあります。というのも、本プロトコルで述べているシンプルながらも重要な手順が、これまで十分に文書化されていなかったか、あるいは簡潔に提示されていなかったためです。まず、プラスチック製バイアルを用いて、茎を埋め込むための自家製モールドを準備します。最初に、カミソリで2 mLスクリューキャップ式マイクロ遠心チューブの円錐形の底部を切り落とします。このコンポーネントをパートAと呼び、チューブキャップに、埋め込むステムの直径よりわずかに大きいシリンジ針用の穿刺孔を設けます。次に、0.6 mL マイクロ遠心チューブの底から0.5 cm分を切り取ります。このコンポーネントをパートBと呼びます。切り取った0.6 mL マイクロ遠心チューブの0.5 cm分を、あらかじめ切り込みを入れた2 mL マイクロ遠心チューブの中に入れます。パラフィルムを使用して2つのパーツを密封します。カミソリを使用して、目的の領域から茎のセクションを切り出します。7%aros溶液を電子レンジの低出力で加熱して溶かします。溶けたarosが約50 degrees Celsiusまで冷却されたら、5 millilitersのagrosをあらかじめ用意したプラスチック製モールドにゆっくりとピペットで注入し、バイアルを満たします。アロースが30〜60秒間冷却され、半凝固状態になったら、ステムをアロースを満たしたバイアルに入れます。次に、ステムの先端がキャップで固定されるように、穿孔キャップを装着します。バイアルを室温または4°Cで10〜30分間放置し、凝固させます。チューブから型をゆっくりと滑らせるようにして取り出します。パラフィルムを開け、型のパートBの底部を親指で軽く押し、凝固したアロスをパートAからガラス顕微鏡スライド上に放出させます。スライドカットを行います。アロスに埋め込まれた茎を、約1.2 cmの長さに3等分します。アロスの外側にある茎の部分を切り取り、廃棄します。試料ディスクが清潔で完全に乾燥していることを確認してください。柔らかいペーパーワイプを使用して、標本が入ったarosブロックから水分を完全に取り除きます。標本ディスクの上に組織

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、特殊な植物細胞に存在するリグニンを染色するためのWiesner染色技術について説明します。この染色技術は、シロイヌナズナの茎の木質化した細胞壁を視覚化するのに役立ち、さまざまな種類の細胞の細胞壁の木質化を定量化するのに役立ちます。...

リグニンを可視化するためのWiesner染色:シロイヌナズナの茎に存在するリグニン沈着物を染色する技術

このビデオでは、特殊な植物細胞に存在するシリンギルリグニンを染色するためのマウレ染色技術について説明します。この染色技術は、木部および束間繊維のリグニン分布を特徴付けるのに役立ちます。...

リグニンのモール染色:シロイヌナズナの茎切片におけるリグニン分布を特徴付ける技術

このビデオでは、シロイヌナズナの茎切片にセルロース沈着物を可視化するコンゴレッド染色法を実演しています。...

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Calcofluor白色染色:双子葉植物の茎切片の細胞壁におけるセルロース沈着物のUV誘起蛍光可視化のための簡単な方法

このビデオは、アラビノガラクタンタンパク質(AGP)とペクチンを植物組織に局在させる免疫染色技術を示しています。固定および樹脂に包埋された植物組織切片を、AGP特異的およびペクチン特異的な一次抗体および蛍光二次抗体、およびセルロース結合性蛍光色素で染色し、細胞壁におけるそれらの組織特異的な共局在を明らかにします。...

植物組織におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と...

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

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シロイヌナズナの底部のシンク組織に装填された CFDA トレーサーの Shootward 運動

このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。...

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

本プロトコルは、 Plasmodiophora brassicae によって誘導されるゴールの組織学的観察のための最適化された方法を記載する。胚軸のビブラトーム切片は、蛍光イメージングの前に除去され、疾患進行中の転写因子と植物ホルモンの関与を研究します。このプロトコルは、樹脂包埋の制限を克服し、蛍光タンパク質の プランタ 可視化を可能にします。...

透明化顕微鏡と蛍光顕微鏡を組み合わせて、アブラナ原虫に対する遺伝子発現の変化と生理学的応答を視覚化

このプロトコルは、 シロイヌナズ...

発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

学ぶ組織化学的染色法でシロイヌナズナの二次細胞壁要素を可視化する方法です。包埋、切片、染色、顕微鏡観察の手順を含み、異なる細胞型の差異的染色パターンを明らかにします。

の組織化学的染色

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