2014年7月7日
大きな組織内で蛍光標識された細胞の高解像度画像を得るためには、理想的には、生物学的サンプルは切片化せずに画像化されるべきです。3DISCOは、有機溶媒との逐次インキュベーションに基づく簡単な組織透明化手順です。クリアすると、臓器が透明になり、標本のエンドツーエンドのレーザースキャンが可能になります。
次の実験の全体的な目標は、組織学的切片なしで蛍光標識された無傷の生体サンプルを画像化することです。これは、完全な透明性が得られるまで、固定組織を有機溶媒中で連続的にインキュベートすることによって達成されます。第二のステップとして。
透明な組織は、レーザー走査型顕微鏡を使用して3Dで画像化されます。次に、イメージング結果を解析し、収集した3枚のディスコ画像から、未切開の脊髄と脳の神経構造を3Dで再構築します。この方法は、脳と脊髄全体のニューロンとGALの接続をどのようにマッピングするかという神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
この技術の意味は、神経系全体の神経完全性を視覚化できるようになったため、神経変性の治療にまで及びます。この方法は、神経系の組織化に関する洞察を提供しますが、肺や腫瘍組織などの他の臓器にも適用できます。習得すると、この技術は脊髄や肺などの小さな臓器では数時間しかかからず、脳では約1〜2日で、収穫した組織ごとに1つのガラスバイアルに2〜3ミリリットルの新しく準備された50%THFを追加することから手順を開始します。
次に、固定臓器を透明化溶液に移し、バイアルをしっかりと閉じます。バイアルをローテーターに置き、アルミホイルで覆い、サンプルを30RPMの一定速度で適切な時間攪拌します。次に、透明化溶液を取り出し、新しいPEまたはピペットを使用して、次の溶液に組織を懸濁します。
表に示されているように、最終クリアリングステップで、多光子顕微鏡または共焦点顕微鏡でサンプルが完全に透明になるまで溶液中に保ちます。完全な透明化が達成されたらすぐに、サンプルをイメージングスライドに取り付けます。歯科用セメントを使用して、組織の周りに境界線を作ります。
歯科用セメントが完全に硬くなる直前に、最終的な清澄化溶液をプールに充填し、すぐに清算したサンプルをプールの中央に置き、カバーガラスで覆います。完全なクリアリングが達成されるとすぐに、カバーガラスが歯科用セメントによって完全に密封され、クリアされた臓器の表面に触れるまで押してライトシート顕微鏡に取り付け、次にサンプルホルダーのネジを手動で回してサンプルを固定します。次に、イメージングされた組織に適した最終清澄溶液で満たされたライトシート顕微鏡のイメージングチャンバーにサンプルを浸します。
次に、顕微鏡が提供できる最高の解像度で透明化された組織全体をカバーするZスキャンを収集し、関心領域にズームインして高解像度の画像を収集します。画像を収集したら、AmiraソフトウェアにResolve RTモジュールを使用して画像シリーズをロードします。シリーズが読み込まれたら、画像読み取りパラメータウィンドウに正しいボクセルサイズを入力し、[OK]をクリックします。
次に、マルチプラナービューサブアプリケーションを選択します。次に、プライマリ スライダーと厚さスライダーを使用して、グレー値の最適な投影厚さとしきい値を選択します。最後に、切り抜きコーナーモジュールを使用して、さまざまな3D向きでスライスを参照します。
サンプルを可視化するためには、ニューロンの構造的組織をマッピングすることは、ニューロンが健康や疾患でどのように機能するかを理解するために非常に重要です。スリーディスコはさまざまな臓器に使用できますが、脊髄や脳の長いニューロン接続をトレースするのに特に役立ちます。例えば、透明な大きな脊髄セグメントの超顕微鏡スキャンを使用すると、これらの画像に示すように、げっ歯類の脊髄の軸索接続をセンチメートル以上追跡することができます。
同様に、クリアされたマウスの脳と海馬全体を、脳内のニューロンの接続を追跡するように画像化することができます。共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を使用すると、特にZ次元でイメージング解像度を大幅に向上させることができます。例えば、GFPM系統マウスから透明化された脊髄の多光子イメージングは、脊髄の深さ1.5〜2ミリメートル全体にわたってシームレスな画像を実現します。
クリアされた脊髄の共焦点顕微鏡検査は、同様の方法で解像度を向上させます。クリアな脳の多光子顕微鏡イメージングは、樹状突起スパインを含むニューロン構造の細部を視覚化するための非常に高解像度の画像を提供します。3つのディスコのサンプルは、さまざまな方法でラベル付けできます。
例えば、レクチン結合蛍光トレーサーを用いて脳や脊髄の血管系全体を標識することができ、健康や疾患における血液脳関門の研究に活用することができます。大きな組織中の3つのディスコ製小さな細胞を使用することもイメージングできます。例えば、ミクログリアとアストロサイトはどちらも、アルツハイマー病や外傷などの神経変性の病理に深く関与しています。
3つのディスコを使用して、脊髄内のそれらの密度と分布を研究することができます。非神経組織もイメージングできます。例えば、げっ歯類の肺全体のクララ細胞を抗体で免疫標識し、単一細胞レベルで切片化せずにイメージングすることができます。
同様に、認可されていない膵臓組織中の細胞を透明化し、画像化することが可能である。例えば、蛍光標識されたα細胞は、これらの膵臓画像で透明化した後に画像化されます。この手法の視覚的なデモンストレーションは、クリアリングとイメージングのステップは単純ですが、データ解析は複雑になる可能性があるため、重要です。
この手順を適用する際には、蛍光シグナルが透明溶液中で時間の経過とともに劣化するため、完全な透明化が達成されたらすぐに透明な組織を画像化することが重要です。この技術の開発により、研究者は脳内のニューロンネットワークのマッピングなど、詳細で無傷の臓器を探求する道が開かれました。このビデオを見れば、臓器全体の細胞構造や細胞内構造を鮮明にして画像化し、その後それらを視覚化して分析する方法を十分に理解できるはずです。
この研究では、組織切片を必要とせずに、蛍光標識された生体サンプルのイメージング方法を3DISCO技術を用いて提示します。このプロセスでは、固定組織を有機溶剤で順次インキュベートして透明化し、その後レーザー走査顕微鏡を用いて3Dイメージングを行います。
3DISCO enables high-resolution 3D imaging of intact biological systems without sectioning, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology R&D. By preserving tissue architecture and enabling whole-organ visualization, it enhances predictive confidence in preclinical models and reduces biological ambiguity in target engagement studies. This capability accelerates lead identification and translational biomarker discovery by providing quantitative, spatially resolved data across disease-relevant systems.
3DISCO fits within the discovery continuum from target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in neuroscience and immuno-oncology programs.