イメージングは3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア
2014年7月7日
大きな組織内で蛍光標識された細胞の高解像度画像を得るためには、理想的には、生物学的サンプルは切片化せずに画像化されるべきです。3DISCOは、有機溶媒との逐次インキュベーションに基づく簡単な組織透明化手順です。クリアすると、臓器が透明になり、標本のエンドツーエンドのレーザースキャンが可能になります。
次の実験の全体的な目標は、組織学的切片なしで蛍光標識された無傷の生体サンプルを画像化することです。これは、完全な透明性が得られるまで、固定組織を有機溶媒中で連続的にインキュベートすることによって達成されます。第二のステップとして。
透明な組織は、レーザー走査型顕微鏡を使用して3Dで画像化されます。次に、イメージング結果を解析し、収集した3枚のディスコ画像から、未切開の脊髄と脳の神経構造を3Dで再構築します。この方法は、脳と脊髄全体のニューロンとGALの接続をどのようにマッピングするかという神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
この技術の意味は、神経系全体の神経完全性を視覚化できるようになったため、神経変性の治療にまで及びます。この方法は、神経系の組織化に関する洞察を提供しますが、肺や腫瘍組織などの他の臓器にも適用できます。習得すると、この技術は脊髄や肺などの小さな臓器では数時間しかかからず、脳では約1〜2日で、収穫した組織ごとに1つのガラスバイアルに2〜3ミリリットルの新しく準備された50%THFを追加することから手順を開始します。
次に、固定臓器を透明化溶液に移し、バイアルをしっかりと閉じます。バイアルをローテーターに置き、アルミホイルで覆い、サンプルを30RPMの一定速度で適切な時間攪拌します。次に、透明化溶液を取り出し、新しいPEまたはピペットを使用して、次の溶液に組織を懸濁します。
表に示されているように、最終クリアリングステップで、多光子顕微鏡または共焦点顕微鏡でサンプルが完全に透明になるまで溶液中に保ちます。完全な透明化が達成されたらすぐに、サンプルをイメージングスライドに取り付けます。歯科用セメントを使用して、組織の周りに境界線を作ります。
歯科用セメントが完全に硬くなる直前に、最終的な清澄化溶液をプールに充填し、すぐに清算したサンプルをプールの中央に置き、カバーガラスで覆います。完全なクリアリングが達成されるとすぐに、カバーガラスが歯科用セメントによって完全に密封され、クリアされた臓器の表面に触れるまで押してライトシート顕微鏡に取り付け、次にサンプルホルダーのネジを手動で回してサンプルを固定します。次に、イメージングされた組織に適した最終清澄溶液で満たされたライトシート顕微鏡のイメージングチャンバーにサンプルを浸します。
次に、顕微鏡が提供できる最高の解像度で透明化された組織全体をカバーするZスキャンを収集し、関心領域にズームインして高解像度の画像を収集します。画像を収集したら、AmiraソフトウェアにResolve RTモジュールを使用して画像シリーズをロードします。シリーズが読み込まれたら、画像読み取りパラメータウィンドウに正しいボクセルサイズを入力し、[OK]をクリックします。
次に、マルチプラナービューサブアプリケーションを選択します。次に、プライマリ スライダーと厚さスライダーを使用して、グレー値の最適な投影厚さとしきい値を選択します。最後に、切り抜きコーナーモジュールを使用して、さまざまな3D向きでスライスを参照します。
サンプルを可視化するためには、ニューロンの構造的組織をマッピングすることは、ニューロンが健康や疾患でどのように機能するかを理解するために非常に重要です。スリーディスコはさまざまな臓器に使用できますが、脊髄や脳の長いニューロン接続をトレースするのに特に役立ちます。例えば、透明な大きな脊髄セグメントの超顕微鏡スキャンを使用すると、これらの画像に示すように、げっ歯類の脊髄の軸索接続をセンチメートル以上追跡することができます。
同様に、クリアされたマウスの脳と海馬全体を、脳内のニューロンの接続を追跡するように画像化することができます。共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を使用すると、特にZ次元でイメージング解像度を大幅に向上させることができます。例えば、GFPM系統マウスから透明化された脊髄の多光子イメージングは、脊髄の深さ1.5〜2ミリメートル全体にわたってシームレスな画像を実現します。
クリアされた脊髄の共焦点顕微鏡検査は、同様の方法で解像度を向上させます。クリアな脳の多光子顕微鏡イメージングは、樹状突起スパインを含むニューロン構造の細部を視覚化するための非常に高解像度の画像を提供します。3つのディスコのサンプルは、さまざまな方法でラベル付けできます。
例えば、レクチン結合蛍光トレーサーを用いて脳や脊髄の血管系全体を標識することができ、健康や疾患における血液脳関門の研究に活用することができます。大きな組織中の3つのディスコ製小さな細胞を使用することもイメージングできます。例えば、ミクログリアとアストロサイトはどちらも、アルツハイマー病や外傷などの神経変性の病理に深く関与しています。
3つのディスコを使用して、脊髄内のそれらの密度と分布を研究することができます。非神経組織もイメージングできます。例えば、げっ歯類の肺全体のクララ細胞を抗体で免疫標識し、単一細胞レベルで切片化せずにイメージングすることができます。
同様に、認可されていない膵臓組織中の細胞を透明化し、画像化することが可能である。例えば、蛍光標識されたα細胞は、これらの膵臓画像で透明化した後に画像化されます。この手法の視覚的なデモンストレーションは、クリアリングとイメージングのステップは単純ですが、データ解析は複雑になる可能性があるため、重要です。
この手順を適用する際には、蛍光シグナルが透明溶液中で時間の経過とともに劣化するため、完全な透明化が達成されたらすぐに透明な組織を画像化することが重要です。この技術の開発により、研究者は脳内のニューロンネットワークのマッピングなど、詳細で無傷の臓器を探求する道が開かれました。このビデオを見れば、臓器全体の細胞構造や細胞内構造を鮮明にして画像化し、その後それらを視覚化して分析する方法を十分に理解できるはずです。
概要
本研究では、3DISCO法を用いて、組織切片を作成せずに蛍光標識した生物学的試料をそのままイメージングする方法を提示します。このプロセスでは、固定した組織を有機溶媒で逐次処理して透明化させ、その後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて3次元イメージングを行います。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- 組織透明化
背景
- 神経構造を理解するためには、完全な生物学的サンプルのイメージングが不可欠です。
- 従来の方法では切片作成が必要なことが多く、これにより接続関係が不明確になる場合があります。
- 3DISCOを用いることで、器官全体を3Dで可視化することが可能です。
- この手法は、脳や脊髄を含むさまざまな組織に適用できます。
研究目的
- 未処理の組織における神経接続をイメージングする方法を開発すること。
- 神経変性と神経の完全性に関する理解を深めること。
- 切片作成を必要とせずに細胞構造を可視化すること。
使用方法
- 組織を有機溶媒で段階的に処理し、透明化を行う。
- レーザー走査型顕微鏡を用いた3Dイメージング。
- Amiraソフトウェアを用いたデータ解析による神経構造の可視化。
- さまざまな細胞型に対する蛍光標識技術の適用。
主な結果
- 脊髄および脳における神経構造の高解像度イメージングを実現した。
- 数センチメートルにわたる長い神経接続を追跡できる能力を実証した。
- 肺や膵臓などの他の臓器のイメージングへの応用の可能性が示された。
- 神経系の組織化に関する知見を提示し、神経変性疾患への影響について考察した。
結論
- 3DISCO法は、完全な生物学的サンプルのイメージングに有効です。
- この技術は、神経科学およびその他の分野の研究に新たな道を切り開きます。
- 神経ネットワークの解明は、神経変性疾患の治療法の進展につながる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
3DISCOは、切片作成を行うことなく、無傷の生物学的システムの高解像度3Dイメージングを可能にし、神経科学および腫瘍学のR&Dにおけるターゲットバリデーションとメカニズムのデリスキングを支援します。組織構造を維持し、臓器全体の可視化を可能にすることで、前臨床モデルにおける予測信頼性を高め、ターゲットエンゲージメント研究における生物学的な曖昧さを低減します。この機能により、疾患に関連するシステム全体で定量的かつ空間的に分解されたデータが提供され、リード化合物の同定およびトランスレーショナルバイオマーカーの探索が加速されます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索および標的バリデーション
- 科学的価値： 未処置の脊髄および脳組織においてニューロンとグリアの接続をマッピングすることにより、治療仮説を検証できる。
- 運用の価値： 組織学的アーティファクトを伴わずに、臓器全体にわたるターゲットへの結合およびパスウェイ調節を検証できる。
- 予測的価値： ラベル化された細胞種のサブセルラー解像度イメージングを通じて、表現型スクリーニングおよびリード化合物の同定を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 蛍光標識されたバイオマーカーをイメージングするための、標準化され再現性のあるプラットフォームとして、透明化組織を調製する。
- 運用上の価値： 共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡に対応した、スケーラブルでマルチプレックスなイメージングワークフローを可能にする。
- アッセイの準備状況： 疾患モデルにおける細胞密度、分布、および構造的完全性の定量的な従属変数測定を容易にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 神経変性モデルにおいてミクログリア、アストロサイト、および血管系をイメージングし、トランスレーショナルバイオマーカーとの整合性を図る。
- 運用上の価値： 適用範囲を肺および腫瘍組織まで拡張し、臓器横断的なターゲット検証を行う。
- 予測的価値： 無傷の神経系における神経の完全性と構造的組織化を可視化することで、リスク調整後の進展決定を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
3DISCOは、ターゲット検証から前臨床イメージングに至るディスカバリーの連続的なプロセスに適合し、神経科学および免疫腫瘍学プログラムにおける仮説検証とメカニズムのリスク低減を支援します。
- 基礎生物学研究： 透明化した脊髄および脳標本から3D神経構造を再構築し、仮説の検証を可能にする。
- スクリーニング： 再現性のある透明化プロトコルと定量的なイメージング出力により、アッセイの標準化を支援する。
- 解析： 高解像度のZスタックおよび3D再構築画像を生成し、治療効果の比較解析を行う。
- トランスレーショナルリサーチ： 無傷の臓器内で疾患に関連する細胞表現型をイメージングし、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行う。
- 組織内での再利用： 複数の組織タイプや治療領域に適用可能な、再利用可能な透明化およびイメージングプラットフォームを構築する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疾患モデルにおける細胞内構造および長距離接続を可視化することで、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：溶媒ベースの透明化法と定義されたイメージングパラメータにより、標準化と再現性を実現する。
- 戦略的価値：後期の生物学的リスクを低減する全臓器データを提供することで、Go/No-Go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ調節の定量的かつ空間分解能の高いイメージングを通じて、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 組織固定、溶媒の取り扱い、および蛍光顕微鏡に関する専門知識が必要である。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡またはライトシート顕微鏡、およびAmiraなどの画像解析ソフトウェアに依存する。
- 透明化時間、封入手順、およびボクセルサイズの校正について、チーム間での標準化が必要となる。
- 器官系によって異なる組織密度や脂質含有量に応じた適応が必要である。
- 時間の経過に伴う透明化溶液中での蛍光信号の減衰などの実用的な制限が含まれる。
