イメージングは​​3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア

本実験の全体的な目的は、組織切片を作成することなく、蛍光標識した生物学的試料をそのままの状態でイメージングすることです。これは、固定した組織を有機溶媒で順次インキュベートし、完全に透明化させることで達成されます。第2ステップとして、

透明化された組織を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて3D撮像します。次に、撮像結果を解析し、収集した3つのdisco画像から、切断されていない脊髄および脳内のニューロン構造を3Dで再構築することが可能です。この手法は、脳および脊髄全体におけるニューロンおよびGALの接続をどのようにマッピングするかという、神経科学分野における重要な課題の解決に寄与します。

この手法は、神経系全体の神経整合性を視覚化できるため、神経変性疾患の治療への応用が期待されます。本手法は神経系の組織に関する知見を提供できるだけでなく、肺や腫瘍組織などの他の臓器にも適用可能です。習得後は、脊髄や肺のような小さな臓器であれば数時間で、脳であれば約1〜2日で完了します。採取した組織1つにつき、1つのガラスバイアルに、調製したばかりの50% THFを2〜3 mL加えて手順を開始してください。

その後、固定した臓器を透明化溶液に移し、バイアルをしっかりと密閉します。バイアルをローテーターに設置し、アルミホイルで覆い、30 RPMの一定速度で適切な時間、サンプルを撹拌します。次に、透明化溶液を取り除き、新しいPEまたはピペットを使用して、組織を次の溶液に懸濁させます。

最終的な透明化ステップの表に示されている通り、多光子顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察する場合、試料が完全に透明になるまで溶液中に保持してください。完全に透明になったら、直ちにイメージング用スライドガラスに試料を封入します。歯科用セメントを使用して、組織の周囲に枠を作成してください。

歯科用セメントが完全に硬化する直前に、プールに最終透明化溶液を満たします。その後、すぐに透明化サンプルをプールの中心に配置し、カバーガラスで覆います。完全な透明化が達成された後、ライトシート顕微鏡での観察に向けて、カバーガラスが歯科用セメントで完全に密閉され、透明化した臓器の表面に接触するまでプレスし、サンプルホルダーのネジを手で回してサンプルを固定します。次に、作製したサンプルを、イメージングする組織に適した最終透明化溶液で満たしたライトシート顕微鏡のイメージングチャンバーに浸します。

次に、顕微鏡で得られる最高の解像度で、透明化された組織全体をカバーするようにZスキャンを収集し、関心領域をズームしてより高解像度の画像を収集します。画像の収集後、resolve RTモジュールを用いてAmiraソフトウェアに画像シリーズを読み込みます。シリーズの読み込みが完了したら、画像読み込みパラメータウィンドウに正確なボクセルサイズを入力し、「OK」をクリックします。

次に、マルチプラナービュー（multiplanar view）サブアプリケーションを選択します。その後、プライマリおよび厚さのスライダーを使用して、最適な投影厚さとグレー値のしきい値を選択します。最後に、クロップコーナー（crop corner）モジュールを使用して、さまざまな3D方向でスライスを確認します。

サンプルの可視化において、ニューロンの構造的組織をマッピングすることは、健康状態および疾患状態におけるニューロンの機能機序を理解する上で極めて重要です。3Dイメージングは様々な臓器に適用可能ですが、特に脊髄や脳における長いニューロン接続の追跡に有用です。例えば、これらの画像に示されているように、透明化処理を施した大きな脊髄セグメントの超解像顕微鏡スキャンを用いることで、げっ歯類の脊髄において数センチメートルにわたる軸索接続を追跡することが可能です。

同様に、透明化したマウス脳全体および海馬をイメージングすることで、脳内の神経接続を追跡することが可能です。共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡を使用すると、特にZ軸方向のイメージング解像度を大幅に向上させることができます。例えば、GFPMラインマウスから得られた透明化脊髄の多光子イメージングでは、脊髄の全深さである1.5から2 mmにわたってシームレスな画像を得ることができます。

同様に、透明化した脊髄の共焦点顕微鏡観察によって解像度が向上します。透明化した脳の多光子顕微鏡イメージングでは非常に高解像度の画像が得られ、樹状突起スパインを含む神経構造の微細な詳細を可視化できます。three disco用のサンプルは、さまざまな方法で標識することが可能です。

例えば、レクチン結合蛍光トレーサーを用いることで、脳および脊髄の全血管系を標識することが可能であり、これにより健康時および疾患時における血液脳関門の研究を行うことができます。また、組織透明化法（3D-DISCOなど）を用いることで、巨大な組織内の微小細胞をイメージングすることも可能です。例えば、ミクログリアとアストロサイトはともに、アルツハイマー病や外傷性損傷を含む神経変性疾患の病理に深く関与しています。

3つのdiscoを用いることで、脊髄におけるそれらの密度と分布を研究することができます。また、非ニューロン組織のイメージングも可能です。例えば、齧歯類肺全体のClara細胞を抗体で免疫ラベルし、切片作成することなく単一細胞レベルでイメージングすることができます。

同様に、非承認の膵臓組織においても、細胞の透明化およびイメージングが可能です。例えば、これらの膵臓画像では、透明化後に蛍光標識されたアルファ細胞がイメージングされています。透明化とイメージングの工程は単純ですが、データ解析は複雑になる可能性があるため、本手法を視覚的に提示することは重要です。

この手順を適用する際は、透明化溶液中で蛍光信号が時間とともに減衰するため、完全な透明性が得られたらすぐに透明化した組織のイメージングを行うことが重要です。この技術の開発により、脳内の神経ネットワークのマッピングなど、完全な状態の臓器の詳細を探索することが研究者にとって可能になりました。このビデオを視聴することで、全臓器における細胞および細胞内構造を透明化してイメージングし、その後それらを可視化および解析する方法について十分に理解できるはずです。