タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

次の実験の全体的な目標は、生体層干渉法(BLI)を使用して、タンパク質の動力学、タンパク質相互作用、およびそれらの相互作用に対する小さなリガンドのアロステリック効果を測定することです。これは、タンパク質の1つを特定のビオチンで調製し、それを連鎖球菌の表面に固定化することによって達成されます。アデンコーティングされたバイオセンサーを並列にコーティング。

第2のステップとして、センサー結合タンパク質をその結合パートナーを含むバッファーに曝露し、センサー表面での光学干渉に対するその影響によって結合をリアルタイムで測定します。次に、各センサーを結合パートナーなしでバッファーに移し、タンパク質の解離をリアルタイムで測定します。タンパク質複合体。

得られた結果により、相互作用するタンパク質の結合と解離、したがってそれらの結合親和性のための運動速度定数を決定することができます。さらなる結果は、BLIがタンパク質タンパク質複合体の解離速度に対する小さなリガンドの影響を検出できることを示しています。この手法が表面プラズマ共鳴などの既存の方法よりも優れている点は、BLIが屈折率の変化に過度に敏感ではないことです。

したがって、結合および関連ステップには、タンパク質間相互作用に対するそれらの影響をリアルタイムでテストするために、小さなリガンドの変更を含めることができますが、この方法はタンパク質間相互作用の動力学に関する洞察を提供することができます。また、固定化されたDNAまたはRNAへのタンパク質結合、または固定化タンパク質へのリポソーム結合など、さまざまな組み合わせに適用することもできます。この実験は、テキストプロトコルで説明されているようにBLI機器をセットアップすることから始めます。

次に、データ収集ソフトウェアで実験計画を設定します。実験ウィザードのタブで新しい動力学実験を選択します。これにより、タブ 1 で定義する必要があるすべてのステップを含むタブ付きメニューが表示されます。

使用する列を定義します。96ウェルサンプルプレート上。バッファー、固定化するタンパク質、または結合パートナーを含むカラムを割り当てます。

各アソシエーションについて、使用する結合パートナーの濃度をよく入力します。タブ2で、アッセイに必要なすべてのステップを定義します。これらには、ベースライン負荷の関連付けと結合パートナーの解離が含まれます。

個々のアッセイステップは、アッセイステップを選択し、それぞれのカラムをダブルクリックすることにより、サンプルプレート上のウェルのカラムにリンクされます。これにより、センサーが1つのウェル列から次の列に移動するようにプログラムされます。アッセイ中は、アッセイバッファーを使用してウェルの1列目にリンクされた簡単なベースラインステップから開始し、96ウェルプレートで初期BLIシグナルを確立します。

次に、ローディングステップをビオチン化タンパク質を含むウェルにリンクします。しきい値機能を使用して、所定のレベルのバインディングを実現します。しきい値オプションを設定して、すべてのセンサーがウェルの次の列に移動するようにします。

いずれかのセンサーが閾値に達したら、バッファーに別のベースラインステップを含めて、固定化されていないビオチン化タンパク質をセンサーから洗い流し、基本的なアッセイのための新しい安定したベースラインシグナルを確立して、全体的な結合および解離速度定数を決定します。次に、関連付けをリンクします。さまざまな濃度の結合パートナーを含むウェルのカラムにステップします。

結合パートナーの少なくとも飽和濃度が平衡結合シグナルに達するように、ステップ時間を調整します。解離ステップでは、アソシエーション前の追加のベースラインに使用したのと同じバッファーウェルであるカラム 4 に戻るようにセンサーを指定します。関連性と解離のステップの時間は、速度が予想よりも遅いまたは速い場合に、実験中に調整できます。

タブ3で、アッセイ用の事前接液センサーを含むセンサートレイ内の位置を示します。タブ4では、プログラムをグラフィカルに確認できます。タブ5で、データファイルの場所や希望の温度など、必要な詳細を入力します。

実験用。ストレプトアビジンコーティングされたセンサーを少なくとも10分間事前に湿らせます。保護用のショ糖コーティングを剥がすには、センサーラックをセンサートレイから取り外し、トレイの底部に96ウェルプレートを挿入して、プレートの1つの角をトレイの向きノッチにスライドさせます。

使用するセンサーのカラムには、ウェルあたり200マイクロリットルのアッセイバッファーを追加します。96ウェルプレートのその列で、センサーのラックを割り当てられた正しい向きでトレイに戻します プログラミング中に、サンプルプレートのウェルにアッセイバッファーまたは適切なタンパク質希釈液を充填します。気泡は光信号にノイズを引き起こす可能性があるため、気泡の導入は避けてください。

ビオチン化タンパク質または結合パートナーのいずれかを省略する1つ以上の参照ウェルを含めます。機器のドアを開き、センサーアームからの光出力に注意してください。センサートレイをステージに挿入し、トレイタブをステージのスロットに挿入します。

サンプルプレートをプレートホルダーに挿入します。プレートが平らに装着され、プレートホルダーに示されている正しい向きになっていることを確認してください。ドアを閉め、データ取得プログラムからアッセイを開始します。

センサーにまだ事前の濡れが必要な場合は、実験の開始を遅らせるオプションを選択します。最後に、すべてのサンプル調製が完了し、サンプルプレートとセンサートレイの両方が装置にロードされたら、実行ボタンをクリックしてアッセイを実行します。アッセイの実行後、データ解析ソフトウェアを開き、データを含むフォルダをロードします。

[処理] タブをクリックすると、段階的な処理メニューと、データ選択で各センサーに異なる色が割り当てられた生の動的データが表示されます。サンプルプレートマップ上のセンサー選択ボタンをクリックします。1つまたは2つの制御センサーのウェルを、処理メニューで参照ウェルとして指定します。

減算ボックスにチェックを入れ、リファレンスウェルを選択して、他のすべてのセンサー信号からリファレンス信号を減算します。すべてのトレースを Y が 0 に等しいように整列するには、整列 y 軸ステップを使用します。次に、時間範囲の位置合わせステップとしてベースラインを選択します。

そのベースラインの最後の 10 秒間を入力します。そのベースラインステップ内をクリックすると、整列が表示されます。次に、ステップ間補正ボックスをオンにして、アソシエーションステップと解離ステップ間の信号シフトを最小限に抑えます。

ベースラインまたは関連付け解除する線を選択します。ほとんどの場合、KYゴールフィルタリング機能を選択し、プロセスデータをクリックして、右下のパネルで最終プロセスデータを視覚的に検査します。データを分析するには、分析するステップのデータ分析の[分析]タブをクリックし、関連付けと分離を選択します。

モデルの場合、フィットに1対1を選択し、グローバルを選択します。選択色によるグループ化の場合は、r max unlinked by sensor を選択して、パートナーが固定化されたタンパク質に飽和結合したときの最大シグナル応答を独立して適合させることができます。最後に、[曲線の適合] をクリックして、非線形回帰分析を開始します。

回帰曲線とセンサー データ トレースの重ね合わせ、フィッティング残差のプロット、決定されたパラメーター値と統計量を含むテーブルなど、フィッティング結果を確認します。ここでは、リアルタイムの結合と解離のBLIキネティクスを示します。この実験は、センサーが事前に濡れていたため、10分間のベースラインステップで開始され、その後、ビオチン化イプシロンがセンサーにロードされました。

参照曲線からわかるように、残りのすべてのステップでイプシロンの検出可能な解離は発生せず、結合パートナーは追加されませんでした。2つ目のリファレンスセンサーは、動員されたタンパク質を欠いており、結合パートナーの非特異的結合が低いことを示しました。センサーAからFまでの関連付けステップで、F1マイナスイプシロンのさまざまな濃度を使用して、結果をグローバルに適合させ、関連付け率定数と関連付け速度定数の最適な値を取得し、平衡解離定数KDの結果を処理して、青色のデータトレースを生成しました。

この場合、サンプルトレースからリファレンスセンサートレースを差し引いて、バインディングパートナーの非特異的結合とシステム信号ドリフトを補正しました。データ分析ステップでは、すべての曲線が 1 対 1 の 1 対 1 のモデルでグローバルに適合されました。グローバルフィットは、バインディングパートナーの完全な解離を前提としています。

ここでは、酵素を1ミリモルA-T-P-A-D-T-Aの存在下でセンサー固定化イプシロンに結合させた別の実験を示します。これは、ほとんどのF1イプシロン複合体が非阻害性の確認を仮定する素因となり、これによりセンサーは容易に解離し、次いで、異なるリガンドを有するアッセイバッファーを含む解離ウェルに移動された。これは、イプシロンの確認に対するさまざまなリガンドの影響を示しています。

例えば、マグネシウムA GPとリン酸塩への曝露は、正味の解離を劇的に遅らせ、イプシロンが確認を強固に結合した阻害状態に移行したことを示しました。BLIアッセイを初めてセットアップする際には、センサーへのタンパク質の非特異的結合をテストするためのコントロールを含めること、および使用するタンパク質濃度によって非特異的結合が大きく異なるかどうかを検査することが重要です。このビデオを見れば、タンパク質タンパク質相互作用の動態を測定するためのBLIアッセイの設計、プログラム、分析の方法を十分に理解し、それを理解できるはずです。

BLIは、タンパク質タンパク質相互作用に対する小さなリガンドの影響を直接テストすることを可能にします。