タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

本実験の総合的な目的は、バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いて、タンパク質のキネティクス、タンパク質間相互作用、および低分子リガンドがそれらの相互作用に及ぼすアロステリック効果を測定することです。これは、タンパク質の一方を特異的なビオチンで標識し、ストレプトアビジンコーティングされたバイオセンサーの表面に並行して固定化することで達成されます。

第2ステップとして、センサーに結合したタンパク質を結合パートナーを含むバッファーにさらし、センサー表面での光学的干渉への影響によって結合をリアルタイムで測定します。次に、タンパク質のリアルタイムでの解離を測定するため、各センサーを結合パートナーを含まないバッファーに移します。タンパク質複合体。

得られた結果により、相互作用するタンパク質の結合および解離の速度定数、およびそれらに基づく結合親和性を決定することができます。さらに、BLIを用いることで、タンパク質複合体の解離速度に対する低分子リガンドの影響を検出できることが示されました。表面プラズモン共鳴などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、BLIが屈折率の変化に対して過度に敏感ではないことです。

したがって、結合および会合のステップにおいて低分子リガンドを変更することで、タンパク質間相互作用への影響をリアルタイムで検証することが可能です。この手法は、タンパク質間相互作用のキネティクスに関する知見を提供できるほか、固定化されたDNAやRNAへのタンパク質の結合、あるいは固定化されたタンパク質へのリポソームの結合など、異なる組み合わせにも適用できます。まず、テキストプロトコルに従ってBLI装置をセットアップし、本実験を開始してください。

次に、データ収集ソフトウェアで実験デザインを設定します。実験ウィザードタブで「new kinetics experiment」を選択してください。これにより、タブ1で定義する必要があるすべてのステップを含むタブメニューが表示されます。

使用するカラムを定義します。96ウェルサンプルプレートにおいて、バッファー、固定化するタンパク質、または結合パートナーを配置するカラムを割り当てます。

各アソシエーションについて、使用する結合パートナーの濃度を入力します。2番目のタブで、アッセイに必要なすべてのステップを定義してください。これには、ベースライン、ローディング、結合パートナーのアソシエーションおよびディソシエーションが含まれます。

アッセイステップを選択し、対応する列をダブルクリックすることで、個々のアッセイステップをサンプルプレートのウェル列にリンクさせます。これにより、センサーが1つのウェル列から次の列へと移動するようにプログラムされます。アッセイの開始時には、96ウェルプレートにおける初期のBLI信号を確立するため、アッセイバッファーが入った最初のウェル列にリンクさせた短いベースラインステップから始めてください。

次に、ローディングステップをビオチン化タンパク質を含むウェルにリンクさせます。閾値関数を使用して、あらかじめ設定した結合レベルを実現してください。すべてのセンサーが次の列のウェルに移動するように、閾値オプションを設定します。

いずれかのセンサーが閾値に達した場合は、バッファーによるベースライン工程を再度追加し、センサーから非固定化ビオチン化タンパク質を洗浄し、基本的なアッセイのための新しい安定したベースライン信号を確立してください。全体の結合速度定数および解離速度定数を決定する場合は、結合工程の前に、バッファーウェルが入った新しい列のセンサーを用いて追加のベースライン工程を設けてください。次に、結合パートナーを異なる濃度で含むウェルの列へと結合工程をリンクさせます。

結合パートナーの飽和濃度において、少なくとも平衡結合シグナルに達するようにステップ時間を調整してください。解離ステップでは、センサーがカラム4、つまり結合前の追加ベースラインに使用したのと同じバッファーウェルに戻るように指定します。結合および解離ステップの時間は、速度が予想よりも遅い場合や速い場合に、実験中に調整することが可能です。

タブ3で、アッセイに使用する事前濡らし済みのセンサーを配置するセンサートレイ内の場所を指定します。タブ4では、プログラムの内容をグラフィカルに確認できます。タブ5では、データファイルの保存場所や設定温度などの必要な詳細情報を入力します。

実験に先立ち、ストレプトアビジンコートセンサーを10分以上プリウェットします。保護用のスクロースコーティングを除去するため、センサー containing rackをセンサー用トレイから取り出し、96ウェルプレートをトレイの底部に挿入します。この際、プレートの角のひとつをトレイの方向調整用ノッチにスライドさせて合わせます。

使用するセンサーの列の各ウェルに、アッセイバッファーを 200 µL ずつ加えます。96ウェルプレートのその列に、プログラミング時に割り当てられた正しい向きでセンサーラックをトレイに戻します。サンプルプレートのウェルに、アッセイバッファーまたは適切なタンパク質希釈液を満たします。気泡が入ると光学信号にノイズの原因となるため、気泡の混入を避けてください。

ビオチン化タンパク質または結合パートナーのいずれかを省略したリファレンスウェルを1つ以上含めます。装置のドアを開け、センサーアームからの光出力を確認します。トレイのタブをステージのスロットに挿入し、センサートレイをステージにセットします。

サンプルプレートをプレートホルダーに挿入します。プレートが平らに設置され、プレートホルダーに示された正しい向きになっていることを確認してください。ドアを閉め、データ収集プログラムからアッセイを開始します。

センサーに事前濡らしが必要な場合は、実験開始を遅らせるオプションを選択してください。最後に、すべての試料調製が完了し、サンプルプレートとセンサートレイの両方が装置にロードされたら、開始ボタンをクリックしてアッセイを実行します。アッセイの実行後、データ解析ソフトウェアを開き、データが含まれているフォルダをロードしてください。

「Processing」タブをクリックして、段階的な処理メニューと、データ選択（data selection）で各センサーに異なる色が割り当てられた生のキネティックデータを確認します。サンプルプレートマップ上のセンサー選択ボタンをクリックします。処理メニューで、1つまたは2つのコントロールセンサーのウェルをリファレンスウェルとして指定します。

減算（subtraction）ボックスにチェックを入れ、他のすべてのセンサー信号から参照信号を差し引くための参照ウェルを選択します。「align y axis」ステップを使用して、すべてのトレースを Y = 0 に揃えます。次に、時間範囲の調整ステップとしてベースライン（baseline）を選択します。

そのベースラインの最後の10秒間を入力します。ベースラインのステップ内をクリックすると、アライメントが表示されます。次に、結合ステップと解離ステップの間のシグナルシフトを最小限に抑えるため、「inter step correction」のチェックボックスをオンにします。

ベースラインまたは解離のためのラインを選択します。ほとんどの場合、KYゴールフィルタリング機能を選択し、「process data」をクリックして進み、右下のパネルで最終的な処理データを視覚的に確認します。データを解析するには、「data analysis」の「analysis」タブをクリックし、解析するステップを選択して、「association」および「dissociation」を選択します。

モデルでは、フィッティング用に「one to one」を選択し、「global」を選択します。「group by」では「color」を選択し、「r max」は「unlinked by sensor」を選択して、固定化タンパク質へのパートナーの飽和結合における最大信号応答を個別にフィッティングできるようにします。最後に、「fit curves」をクリックして非線形回帰分析を開始します。

回帰曲線とセンサーデータのトレースのオーバーレイ、フィッティング残差のプロット、および決定されたパラメータ値と統計量を含む表から、フィッティング結果を確認します。ここでは、リアルタイムの結合および解離のBLIキネティクスを示します。センサーはあらかじめ短時間のみ予備浸漬されていたため、この実験は10分間のベースラインステップから開始し、その後、ビオチン化epsilonをセンサーにロードしました。

結合パートナーを添加していないリファレンスクルブから分かるように、以降のすべてのステップを通じてεの解離は検出されませんでした。2つ目のリファレンスセンサーには動員タンパク質がなく、結合パートナーの非特異的結合は低い値を示しました。センサーAからFの結合ステップにおいて、結果をグローバルにフィットさせ、結合速度定数と平衡解離定数KDの最適値を得るために、さまざまな濃度のF1マイナスεを使用しました。これらの結果を処理し、青色のデータトレースを得ました。

本ケースでは、結合パートナーの非特異的結合およびシステムの信号ドリフトを補正するため、サンプル trace から参照センサー trace を差し引きました。データ解析ステップでは、すべての曲線を 1:1 モデルを用いてグローバルフィットさせました。このグローバルフィットでは、結合パートナーが完全に解離することを前提としています。

ここでは別の実験を示します。この実験では、1 mMのATP$\gamma$S（ATP-ADP-T-A）存在下で、センサーに固定化された$\epsilon$に酵素を結合させました。これにより、ほとんどのF1-$\epsilon$複合体が非抑制的な構造をとりやすくなり、容易に解離します。その後、センサーを異なるリガンドを含むアッセイバッファーが入った解離ウェルに移動させました。これにより、$\epsilon$の構造に対する異なるリガンドの影響が実証されます。

例えば、マグネシウム A GP およびリン酸塩への曝露により、正味の解離が劇的に遅延しました。これは、epsilon が強固に結合した抑制状態へと構造変化したことを示しています。BLI アッセイを最初に構築する際は、タンパク質のセンサーへの非特異的結合を確認するためのコントロールを含めること、および、使用するタンパク質濃度によって非特異的結合が大きく変動するかどうかを検証することが重要です。このビデオを視聴することで、タンパク質間相互作用のキネティクスを測定するための BLI アッセイの設計、プログラム作成、および解析方法について十分に理解し、その有用性を認識できるはずです。

BLIを用いることで、低分子リガンドがタンパク質間相互作用に及ぼす影響を直接的に検証することが可能です。