ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

このビデオの全体的な目標は、修飾ヌクレオシドリン酸の合成からその完全な生化学的特性評価までの手順を実証することです。これは、まず、適切に保護されたヌクレオシド前駆体を、4ステップのワンポット手順を適用することにより、対応する三リン酸に変換することによって達成されます。第2のステップは、得られた三リン酸を最初に沈殿によって精製し、次に逆相の高速液体クロマトグラフィーによって精製することです。

次に、三リン酸アナログは、核磁気共鳴およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間またはNMRおよびマロフによって特徴付けられ、高純度を確保します。最終ステップは、プライマー伸長反応と末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼまたはTDT重合反応です。最終的に、反応生成物、ひいては三リン酸の基質受容性がゲル電気泳動によって分析されます。

この方法の利点は、Borgeアプローチのような他の合成戦略と比較して、形成される副生成物が少なく、したがって精製が容易であることです。一般的に、この手法に不慣れな個人は、複数の分野の知識を必要とする非常に長くて複雑な手順であるため、苦労するでしょう。この方法を撮影するというアイデアを最初に思いついたのは、修飾リン酸塩を合成したときで、詳細な手順を見つけるのはかなり難しいと感じました。

この方法のもう一つの利点は、修飾核酸の分野における他の問題に取り組むために使用できることです。実際、広範囲の反応を触媒するDNA酵素の選択に使用できます。さらに、この方法は核酸の機能的標識にも使用できます。

三リン酸は極性で活性化された誘導体であり、取り扱いには注意が必要なため、合成および精製のステップを学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。まず、真空下で一晩乾燥する前に、適切に3プライムヒドロキシル保護ヌクレオシドを2ミリリットルの無水プリンで2回蒸発させます。同時に、翌日の真空下で乾式法廷のピロリン酸アンモニウムは、ヌクレオシドを最低200マイクロリットルの乾燥ピリジンに溶解した。

次に、COS溶媒として400マイクロリットルの乾燥ジオキサンを追加します。最後に、環状リンの3誘導体を添加し、室温で45分間反応させます。次に、170マイクロリットルの乾燥ジメチルホルムアミドと58マイクロリットルの蒸留したばかりのトリブチルアミンに乾燥ブチルピロリン酸アンモニウムの溶液を調製します。

得られた溶液を反応混合物に加え、室温で45分間反応させます。次に、980マイクロリットルのプリンと20マイクロリットルの水に160マイクロモルのヨウ素の溶液を準備します。溶液を反応混合物に加えます。

アルファリン中心を酸化するため。得られた暗色溶液を室温で30分間撹拌します。チオ硫酸ナトリウムの10%水溶液を使用して、過剰なヨウ素を急冷します。.

真空下で溶媒を除去します。次に、5ミリリットルの水を加え、混合物を室温で30分間放置して、環状三リン酸モティを加水分解します。この段階では、通常、保護グループは削除されます。

したがって、原油サンプルに30%水酸化イモジウムを加えます。室温で1.5時間撹拌した後、真空下で溶媒を除去します。次に、2ミリリットルの水を加え、混合物をチューブチューブに分割します。

アセトンに塩素酸当たりナトリウムの2%溶液を12ミリリットル加え、30分間遠心分離してから手順を繰り返す。もう一度。三リン酸からの合成に使用される試薬は沈殿して油性残渣を形成し、溶媒の分離を可能にするため、油性残渣の空気乾燥後の逆相HPLC精製が大幅に簡素化されます。

標準的な手順に従って、粗サンプルのP 31 NMRスペクトルを記録します。NMRに続いて、油性残留物を4ミリリットルの蒸留水に溶解しました。超純水に50ミリモルのトリエチル重曹アンモニウムをEENT Aとして、50%アセチルニトリルにテキストプロトコルに詳述されているようにEENT Bとして調製し、真空下でEENTを脱気し、20分間攪拌してHPLC精製を開始します。

10マイクロリットルの粗三リン酸を300マイクロリットルの蒸留水に溶解して、分析サンプルを調製します。次に、0%Bから100%Bの範囲の勾配を40分で使用します。セミ分取逆相C 18カラムを装備したHPLCシステムにサンプルを注入します。

三リン酸と二リン酸の保持時間に応じてHPLCプログラムを調整します。これらの条件を使用して粗混合物を精製し、二リン酸を含む可能性のある初期の画分を除去し、製品を含むすべての画分を結合して凍結乾燥させます。その後、超純水で数回蒸発させます。

NMRによる三リン酸の純度と、標準プロトコルの適用によるmaloffの純度を評価します。このプロトコルの適用によって得られる典型的な収率は、プライマーの5つのプライムおよび標識の基質に応じて30〜70%の範囲にあります。テキストプロトコールに詳述されているようにプライマーと試薬を混合し、標識反応を摂氏37度で30分間インキュベートします。

標識反応中に、1 ミリリットルのピペットチップをサイロ化されたグラスウールで塞ぎ、チップに G 10 溶液を充填して、G 10 cidex カラムを調製します。スピンダウンして500マイクロリットルの二重蒸留水で3回洗浄し、最後に50マイクロリットルの二重蒸留水で1回洗浄します。標識反応のインキュベーション後、キナーゼを70°Cで10分間加熱不活性化します。

次に、反応混合物をG10に通します。遊離放射性標識ゲルを除去するには、放射性標識プライマーを精製し、クラッシュアンドソーク法の適用により回収し、エタノール沈殿物およびG10脱塩して逃亡したオリゴヌクレオチドを脱塩する。プライマー伸長反応には、放射性標識プライマー1PICAモル、プライマー10PICAモルのP1、テンプレートのP1および10PICAモル、反応バッファー10×10にT1を組み合わせ、お湯でひざまずきます。

その後、45分かけて徐々に室温まで冷まします。チューブを氷の上に置き、ヌクレオシドリン酸またはDNTPカクテルとDNAポリメラーゼ氷1ユニットを追加します。総量20マイクロリットルの水との反応を完了し、酵素の最適な使用温度でインキュベートします。

次に、20マイクロリットルの停止溶液を加え、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。涼しく、サンプルは摂氏0度で下がります。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離の前に。

リン酸化イメージャーでバンドを可視化し、TDT重合を行い、一本鎖非標識プライマーP 2と無線標識プライマーを1マイクロリットルのTDTバッファーで希釈します。チューブを氷の上に置き、DNTPカクテルとTDTポリメラーゼを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、10マイクロリットルの停止溶液を加えてから、サンプルを摂氏95度で5分間加熱し、摂氏0度で冷却します。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサンプルを分離した後、リン酸化イメージャーを使用してバンドを可視化します。ここに示されているのは、リン中心の特性シグナルを観察できる修飾DNTPの典型的な粗P 31 NMRスペクトルです。さらに、二リン酸側と一リン酸側から生じる信号。

この段階では、高リン酸塩を含む製品が常に観察されます。粗混合物の逆相HPLC分析を以下に示します。メインピークは5プライムリン酸塩に対応しますが、メイン副産物であるファイブプライム二リン酸は保持時間がわずかに短くなります。

最後に、徹底的な逆相の後、HPLC精製、修飾DNTPはNMRによって特徴付けられ、ここに示されているのはサルファイドのマルオフスペクトルであり、修飾DUTPアナログです。ナトリウム付加物は712.54の質量過電荷で見られ、二リン酸の痕跡は存在しません。P 31 NMRとプロトンNMRのスペクトルはどちらも、修飾されたdpsの純度を評価するために重要です。

望ましくない色素とモノリン酸塩の存在は、図示された独特のシグナルを与えるため、ここでは、トランスプロリン修飾DUTPヒスタミン修飾DATPおよび吉草酸修飾DCTPとの一次伸長反応の結果を示します。これは、2つの修飾DN dpsの組み合わせとして、または一緒に、単独の天然DGTPとともに使用されます。最後に、代表的なTDT媒介重合反応と異なる修飾DUTPアナログを用いたものを、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析しました。この文脈では、シスプロリン修飾DUTPとペプチド修飾DUTPがTDTに最適な基質です。

テーリング効率は天然DTTPと同等またはそれを超えるため、尿素修飾DUTPはこの文脈ではかなり貧弱な基質です。ポリ分散が少ないため、より長いサイズのオリゴヌクレオチドが観察できます 一度習得すると、この手法は適切に行えば約1週間で行うことができます。この手順を試みる際には、核状細胞リン酸は自然界の活性化ビルディングブロックであるため、それらを扱う際には注意

核酸の分野の研究者は、この方法を使用して、修飾されたエーバーと触媒核酸を生成するための組み合わせ選択を調査しています。このビデオを見れば、4ステップ1のPOP手順を使用して修飾リン酸塩を合成し、特性評価する方法、その後の逆相HPLC精製および一次伸長反応について十分に理解できるはずです。通常、実験的なセクションでは見られない実験的な詳細が明らかになります。

この方法は、PCRなどの他の手法と組み合わせて使用 することで、追加の疑問に答えることができます。実際、修飾三リン酸とin VIO選択法との適合性を評価するために使用できます。