アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚

本実験の全体的な目的は、in vivo架橋法を用いて、生存しているショウジョウバエの胚からタンパク質複合体を得ることであります。まず、数千匹のハエを個体ケージに入れ、初期胚を回収します。次に、ホルムアルデヒドを用いてタンパク質をin vivoで架橋し、内部のタンパク質複合体を安定化させます。

次に、タンパク質複合体を免疫沈降させるため、架橋した胚からタンパク質抽出液を調製します。その結果、ウェスタンブロット分析によって単離されたタンパク質複合体が同定されます。in vitroアプローチによる従来のタンパク質複合体の単離法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、このin vivoアプローチにより、従来のin vitro法では検出できない可能性がある、一過性ながら機能的に重要なタンパク質間相互作用を捕捉できることです。

本テクニックの実演は、私の研究室のポストドクであるMin Gao博士が行います。まず、撹拌子を用いて水とフライアガーを混ぜ合わせます。この混合物をオートクレーブで滅菌します。

スクロースをリンゴジュースに混ぜ、プレート上で70 °Cまで加熱します。その後、混合物を合わせ、アガールが凝固するまで15分間冷却します。新鮮な4-ヒドロキシ安息香酸メチルをエタノールで調製します。

これは保存剤です。これを凝固混合物に加え、5分間攪拌します。その後、気泡が入らないように、混合物を300平方センチメートルのプラスチック製または発泡スチロール製のプレートに注ぎます。

プレートを4°Cで保存し、1週間以内に使用してください。胚を回収するための、4万～5万匹のハエが入ったポピュレーションケージを用意します。表面に約4gのパン酵母を散布した、新鮮なコーンミール・モラセス充填プレート2枚をポピュレーションケージに取り付けます。

これらのプレート上で、25°Cで48時間、ショウジョウバエを飼育させます。2日後、2枚のアップルジュースアガープレートに約1gの酵母を散布し、個体群ケージ内のプレートをこれらのプレートに交換します。1時間後、ケージ内のプレートを、同タイプの新しいプレート2枚にさらに交換します。

ハエを1時間使用した2枚の回収プレートに胚が溜まっています。プレート上の胚を水とともに懸濁させ、ブラシを用いて取り除きます。その後、2層のふるいを通して回収します。

上層には850 µmのステンレスメッシュを、下層には75 µmのステンレスメッシュを使用します。胚はより目の細かいメッシュ上に回収され、絵筆を用いて粗いゴミから分離します。回収した胚を、50 mLコニカルチューブの上部で作製した細目のナイロンメッシュバスケットに移します。

胚を水で洗浄し、メッシュに入れたままペーパータオルで水分を拭き取ります。次に、胚を50%次亜塩素酸ナトリウム溶液に3分間浸します。溶液中で胚を軽く振り混ぜた後、水で十分に洗浄し、吸い取るようにして乾燥させます。

次に、胚をイソプロパノールに約15秒間浸します。容器を軽く回すことで胚の凝集を解消させます。この操作に30秒以上かけないようにしてください。胚を吸い取って乾燥させ、その後、ヘプタン溶液に5分間移します。

胚が凝集するのを防ぐため、ヘプタンを頻繁にピペッティングして胚にかけ、胚をブロッティングして乾燥させ、PBSTで洗浄します。3分間洗浄した後、メッシュごと胚を10 mLのPBSTが入った15 mLチューブに移します。メッシュを取り出し、胚を溶液中に残し、胚の量が100～300 µLの間になるように調整します。

沈殿させた後、PBSTを吸引し、直ちに胚の架橋処理に移行します。まず、調製したばかりの0.2% ホルムアルデヒド/PBST溶液を10 mL、胚に加えます。25 °Cで緩やかに撹拌しながら10分間インキュベートします。

10分間反応させた後、胚を沈降させてから溶液を除去します。次に、反応を停止させるため、速やかに0.25 Mのグリシン含有PBST 10 mLに溶液を置換します。チューブをさらに5分間振盪させます。クエンチ後、溶液を除去し、1回あたり10 mLのPBSTを用いて胚を3回洗浄します。

残りのPBSTをピペットで吸引して除去し、胚は必要になるまで-80°Cで保存します。ダウンホモジナイザーと2 mLの溶解バッファーを用い、架橋した胚500 µLをホモジナイズします。これは、密着したペッスルを用いて約15回ストロークすることで完了します。

溶解物をマイクロ遠心チューブに移し、15分間緩やかにロッキングミキサーで攪拌します。次に、溶解物を16,000 GSで5分間遠心分離します。上清を15 milliliterチューブに移します。

ペレットは廃棄して構いません。次に、上清に anti ha agros ビーズスラリーを 40 µL 加えます。ビーズのコンジュゲーションが完了するまで、ロッキングミキサーで約 2.5 時間静置します。

ビーズを2,500 Gsで5分間遠心分離し、ペレット化します。チューブ内に約250 µLの上清を残し、そこでビーズを再懸濁します。懸濁させたビーズをスピンカラム上の10 µmフィルターに転移させます。

12,000 Gsで10秒間遠心分離し、溶液を除去します。カラム上のビーズを200 µLの洗浄バッファーで洗浄し、再度遠心分離します。この操作を合計3回繰り返します。次に、ビーズに40 µLの溶出バッファーを加え、37 °Cで15分間インキュベートします。

この期間中、5分ごとにチューブを軽く振って、流出液を回収します。さらに一度、カラムを12,000 GSで10秒間遠心分離します。架橋の効率および架橋された2つのタンパク質複合体の精製効率を、3〜7%のステップゲルを用いたSDS-PAGEおよびそれに続くウェスタンブロットで分析しました。HAタグおよびGFPタンパク質を発現する胚を用いて、架橋の程度をモニタリングし、本プロトコルにおけるさまざまなホルムアルデヒド濃度を検討しました。

処理した胚内のGFPの大部分は架橋されなかったため、この現象は起こりませんでした。ランダムに架橋された2つの複合体を、未架橋のコントロールと比較しました。架橋されなかった2つのタンパク質は、自由に移動する285 kilodaltonのバンドとして観察されます。

架橋されたものは分子量が増大するため、粗タンパク質ライセート中での移動度は低くなります。2つのタンパク質の約半分がin vivoで架橋されていました。比較としてHAペプチドを用いて相互作用パートナーを溶出したところ、ビーズを洗浄した後、溶出画分には複合体と遊離したタンパク質の両方が含まれていました。

SDSを除去することで、チューブ内には最小限のチューブ複合体と、大部分が遊離した状態の成分が残ります。この手順に続き、質量分析などの他の手法を用いることで、単離された複合体中のタンパク質成分の同定など、さらなる疑問を解消することが可能です。