Name: アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚におけるin vivo架橋法によるタンパク質複合体の分離技術。ホルムアルデヒドを用いて一過性のタンパク質相互作用を安定化し、免疫沈降とウエスタンブロットで複合体を同定する方法です。

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我々は、この研究とその技術のヘルプはジョーダン·デイビス、ヤンヤン林、エリックSchadlerさんとJimiao鄭に感謝します。この作品は、AlaへのMCB-1054962を付与NSFのキャリアによってサポートされていました

1。大アップルジュース - 寒天プレートの準備<ol><li> 4板を作るために、千ミリリットルのフラスコに375ミリリットルをH 2 O、11.25グラムフライ寒天と攪拌棒を追加します。これは緩く、液体品の1 30分 - 滅菌サイクルに蓋をしたフラスコの蓋をミックスA.オートクレーブミックスAである。 </li><li> 500ミリリットルのビーカーに125ミリリットルのリンゴジュース、12.5グラムの砂糖と攪拌棒を追加します。ミックスAのオートクレーブ処理が終了するまで、約70℃で攪拌し、温度を維持しつつ、加熱されたプラットフォーム上ミックスB.ヒート·ミックスBである。 </li><li>ミックスが完了し、オートクレーブ処理すると、A.優しく合わせた混合物を攪拌してくださいミックスにミックスBを転送し、それを15分間冷ます。保存料の添加前過冷却となった寒天固化は避けてください。 </li><li>エタノール中10％（重量/体積）の4 - ヒドロキシ安息香酸メチル溶液を作る。これは防腐剤として機能します。上記のリンゴジュース寒天混合溶液の3.75ミリリットルを追加します。 anothe攪拌しておくR 5分。 </li><li>各300センチメートル2プラスチックや発泡スチロールの板状に防腐剤を125ミリリットルのリンゴジュース寒天混合物を注ぐ。それを室温に冷却して固化してみましょう。注ぎながら、気泡の形成を避けてください。 参考：アップルジュース寒天プレートはすぐに使用する準備が整いました。クリアーラップで使用されていないプレートをカバーし、一週間まで4℃で保存する。 </li></ol> 2。 ショウジョウバエ胚収集と前架橋処理<ol><li>胚を収集することができる、そこから約4万〜5万ハエで人口ケージをロードします。 </li><li>ミディアム標準コーンミール、糖蜜の125ミリリットル12を含む2枚ずつ作成し、それぞれのプレート上で乾燥パン酵母の約4グラムを振りかける。ハエを太らせるために48時間25℃のインキュベーター内で人口ケージにこれらのプレートを置きます。 </li><li> 25℃まで昇温さ2リンゴジュース寒天プレートそれぞれの上に乾燥したパン酵母の約1グラムを振りかけるプレート。 0-1 HR-齢の胚の収集を開始する人口ケージに2枚を配置します。 </li><li> 1時間のコレクションの最後に、プレートを取り出します。コレクションの別のラウンドが必要な場合は、2の新しいプレートを交換してください。 </li><li>プレートをカバーし、細かいペイントブラシで軽く胚を再懸濁するために十分な水を追加します。ステンレス製の金網からなる2層の篩を再懸濁した胚を注ぐ。 注：最上位層は、胚経由せながら、大きなフライパーツを収集中程度の孔サイズ（850ミクロン）のメッシュで作られています。最下層は、酵母と水を通過させる、一方、胚を収集し、細かいメッシュ（75ミクロン）で作られています。 </li><li> 50ミリリットルチューブと細かいナイロンメッシュで作られたコレクションバスケットに集めた胚を転送するために細かいペイントブラシを使用してください。水で簡単に胚をすすぎ、その後乾燥させるために紙タオル上でメッシュをブロット。 </li><li> 3分間穏やかに旋回して、50％の漂白剤で胚を浸す。徹底的なすすぎ残りの漂白剤を除去するために水でLY。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。 </li><li> （これはより長い30秒を取るべきではありません）15秒間、穏やかに攪拌しながら、イソプロパノールまたは多胚塊の崩壊まで、絨毛膜を除去した胚を浸す。完全に乾燥さペーパータオルの上でメッシュをブロット。 </li><li>再懸濁し、それらを維持するために胚の上にヘプタンをストリーミングするピペットを使用しながら、5分間のヘプタン中の胚を浸す。乾燥するペーパータオルの上でメッシュをブロット。 </li><li> 3分間0.1％トリトンX-100（PBST）を含むリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中（PBS）のストリームに胚をすすぐ。 </li><li>コレクションバスケットを分解し、10ミリリットルのPBSTを含む15mlチューブにメッシュと一緒に胚を移す。メッシュから胚を洗浄するために静かにチューブを反転させる。 </li><li>チューブからメッシュを削除します。垂直にチューブを入れて、胚は重力によって、チューブの底に沈むましょう。 注記：約100から300胚のμlを1ケージから1時間の収集のために期待されている。 </li><li> PBSTを取り外し、すぐに架橋実行し続けています。 </li></ol>収集された胚の3。 インビボ架橋<ol><li>使用直前に、PBST中の0.2％ホルムアルデヒドを準備します。胚へのホルムアルデヒド固定液10ミリリットルを加え、10分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。一日の終わりまでに、未使用の固定液を捨てます。 </li><li>架橋反応をクエンチ<ol><li>架橋の終了時に、胚は、チューブの底に沈むう。 </li><li>ホルムアルデヒド溶液を除去します。すぐに架橋反応を停止させ、PBST中0.25Mグリシンの10ミリリットルを追加。 5分間ロータリーシェーカー穏やかに攪拌しながら25℃でインキュベートする。 </li><li>胚は、チューブの底に沈むましょう。クエンチ溶液を除去します。 PBSTの10ミリリットルで3回胚を洗浄します。 </li><li>完全にPを削除ピペットを用いてBST洗浄溶液。使用するまで-80℃で保存胚。 </li></ol></li></ol> 4。タンパク質試料の調製と免疫沈降<ol><li> 2ミリリットルの溶解緩衝液中でDounceホモジナイザーを用いて500μlの架橋された胚を均質化する（0.5 M尿素、0.01％SDS、2％トリトン-X 100、PBS中の2mMのフッ化フェニルメタンスルホニル[PMSF]、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）。 注意：特に指定のない限り、このRTで、次の手順を実行します。 </li><li> 1.5ミリリットル遠心管に溶解液を移し、ゆっくりと徹底的な溶解を確実にするために15分間の回転台に揺する。細胞破片をペレット化し、5分間16,000×gで溶解液を遠心分離する。清潔な15mlチューブに上清を保存します。 </li><li> 40μlの抗HAアガロースビーズを上清にスラリー化し、2.5時間、回転プラットフォーム上でインキュベート追加する。 </li><li> 5分間2500×gで遠心分離することにより、ビーズを沈殿。上清を除去しますが、適切を残すチューブ内のximately 250μL。残りの上清中にビーズを再懸濁し、10μmの孔のフィルターを用いて1.5ミリリットルスピンカラムに移す。 </li><li> 10秒間12,000×gでスピンカラムを遠心して、フロースルーを捨てる。 </li><li> 200μlの洗浄緩衝液（0.1 Mグリシン、1 MのNaCl、1％のIGEPAL CA-630、0.1％のTween-20、PBS中）を添加することによりビーズを洗浄する。 10秒間12,000×gでカラムを遠心し、洗浄を捨てる。洗浄を2回繰り返します。 </li><li>ビーズに40μlの溶出緩衝液（2 mg / mlのPBS中のHA-ペプチド）を追加し、穏やかに撹拌しながら15分間37℃で5分毎にインキュベートする。 10秒間、12,000×gでカラムを遠心し、溶出液を収集します。 </li><li>抗HA抗体13を用いたウエスタンブロット解析により複合体の溶出を確認してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ホルムアルデヒドは、一般的に、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用を同定するための架橋剤として使用されている。一緒に下流の質量分析手法との互換性との良好な溶解性および細胞膜透過性は、ホルムアルデヒド、細胞内架橋アプリケーション3,15-17のための理想的な候補薬剤を作る。特に、正常ヴァーサ、 ショウジョウバエ 11において重要な生殖細胞RNAヘリカーゼに関連付けられたmRNAを同定するために使用した。近接して存在する唯一の分子は、標的タンパク質の相互作用パートナーの特異性を強化する、適当な条件下で架橋されることを意味し、市販の架橋剤のうち、 - （2.7オングストローム、2.3）、さらに、ホルムアルデヒドは最短のスペーサーアームのいずれかを有する。上述の理由により、ホルムアルデヒドは、我々のプロトコルにおいて、架橋剤として選択した。しかしながら、これは、uと除外すべきではないショウジョウバエの胚のためのin vivoアプリケーション内の他の架橋剤のsefulness。しかし、明らかなTUDはジチオビス（スクシンイミジル...

マルチサブユニットタンパク質アセンブリおよびDNA-又はRNA-タンパク質複合体の単離は、タンパク質複合体、DNA結合性調節タンパク質又はRNA結合タンパク質のRNA標的によって認識される、ゲノム遺伝子座を同定するために行われる。別の方法は、転写因子またはクロマチンタンパク質（のChIP-seqの）1と所与のRNA結合タンパク質（CLIP-seqの）2に関連するRNA標的によって認識されるDNA部位のゲノムワイドな同定を可能にする。 RNA由来のcDNAまたはDNA標的のライブラリーは、その後、深く配列決定される。これらの方法には、化学的またはUV誘導に研究複合体のタンパク質成分に対する抗体を用いて免疫沈降（IP）に続いて複合体を安定させるために、架橋を使用しています。 生物の開発中に、多くのタンパク質複合体を一過形成する。したがって、デベロッパーを制御する分子メカニズムを理解するために、インビボでのこれらの複合体の組成および機能を分析することが重要であるelopment。それは、in vitroで相互作用する成分の本来の濃度と細胞生化学的環境を再現することは事実上不可能であるため、このようなin vivoでの解析は、in vitroでのアプローチよりも優れているでしょう。ここでは、我々は成功してショウジョウバエの胚から、大きなタンパク質複合体を分離するために使用して、生体内のアプローチを示しています。この方法では、生きている胚におけるタンパク質複合体は、低濃度のホルムアルデヒドで架橋され、​​続いて、目的のタンパク質複合体は、複合体のゲル精製に続いて​​複合体の既知の成分と質量分析を用いてIPに対する抗体によって単離される未知の複雑なコンポーネントを識別します。ホルムアルデヒドは、細胞膜を透過することができ、2.3〜2.7オングストローム3の架橋範囲を有するので、タンパク質複合体は、 インビボで架橋することができ、複雑な構成要素は、互いに近い可能性が高い。この記事の我々にある一例としてチューダー（TUD）タンパク質複合体の単離を使用してこの方法を説明する。 TUDは生殖細胞の発達4-7に不可欠である生殖細胞タンパク質である。このタンパク質は、他のポリペプチド8月10日のメチル化アルギニンまたはリジンと相互作用することが知られ11 TUDドメインを含む。 先に、我々は、機能TUD 5 HA-タグ化発現し、従って、特異的な抗HA抗体を架橋後TUD錯体をプルダウンするために用いられるトランスジェニックショウジョウバエ株を生成されている。 タンパク質 - タンパク質架橋に加えて、ホルムアルデヒドは、核酸 - タンパク質架橋を生成することができるとのChIP-seqの実験で使用されている。さらに、 ショウジョウバエにおいて、ホルムアルデヒドと架橋インビボでヴァーサRNAヘリカーゼタンパク質11のRNA標的の同定を可能にした。 この記事では、生体内架橋およびPURのための方法を説明しながら、ショウジョウバエ胚由来のタンパク質複合体のification、この方法は、他の生物および組織に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>ショウジョウバエ寒天</td><td>実験室科学(http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>リンゴジュースプレートが壊れやすくなる原因となるため、水と寒天の混合物を長期間オートクレーブしないでください</td></tr><tr><td>メチル4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>シグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>別名:TEGOSEP</td></tr><tr><td>人口ケージ</td><td>フライスタッフ(http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>細いナイロンメッシュ</td><td>フライスタッフ(http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>コレクションバスケットを作るときは、ハヤブサチューブキャップの開口部よりもわずかに大きいメッシュをカットして、密閉性</td></tr>を確保します <tr><td>ダウンスホモジナイザー</td><td>シグマ(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>ホモジナイザーを氷の上で冷やし、使用前に冷たく溶解したバッファーで事前にすすぎますタンパク質の分解を防ぎます</td></tr>プロ<tr><td>テアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>ロシュ(http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBSは、濃縮プロテアーゼ阻害剤ストック溶液を調製するために使用できます</td></tr><tr><td>抗HAアガロースビーズ</td><td>MBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>キットには、HAペプチドとスピンカラムも含まれています</td></tr><tr><td>HAペプチド</td><td>MBLインターナショナル(http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>PBSで2 mg / mlに調製&nbsp;</td></tr><tr><td>スピンカラム</td><td>MBL インターナショナル (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>スピンカラムは、</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>使用前にナノ純水で10倍から1倍に希釈</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>バイオラッド (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>バイオラッド(www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>バイオラッド (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>イソプロパノールに200 mMのストック溶液を調製し、溶解バッファー中に2 mMの作業濃度に希釈します</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>15 mlチューブ</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Clorox ブランド</td><td></td><td>等量のナノ純水で希釈して 50% 漂白剤</td></tr><tr><td>を作る 50 ml チューブ</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>最上層ふるい</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>最下層ふるい</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td>(代表)<td></td></tr></tbody></table>

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

多くの細胞プロセスは、マルチサブユニットタンパク質複合体によって制御される。頻繁にこれらの複合体は、一過性に形成し、組み立てるためにネイティブ環境が必要です。したがって、これらの機能性タンパク質複合体を同定するためには、細胞溶解およびその後の精製の ​​前に、生体内でそれらを安定化することが重要である。ここでは、 ショウジョウバエの胚から大真正タンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。この方法はin vivoで容易に細胞膜を通過することができ、低濃度のホルムアルデヒドを用いて架橋することによって、胚の内側の複合体の胚の透過化と安定化に基づいている。続いて、関心対象のタンパク質複合体は、ゲル精製し、そして質量分析によって分析免疫精製される。我々は、生殖系列発達のために必須であるチューダータンパク質複合体の精製を使用してこの方法を説明する図である。チューダーは、複数のチューダードメインを含む大規模なタンパク質である - 小さな標的タンパク質のメチル化アルギニンまたはリジンと対話モジュール。この方法は、異なる生物及び組織由来の天然タンパク質複合体の単離のために適合させることができる。

ウェスタンブロット（ 図2）、続いて（ 図1に示されている）、7％工程ゲル-架橋および架橋TUDタンパク質複合体の精製に成功したの有効性は3％でSDS-PAGEにより分析した。 3％の使用目的 - 7％ステップゲルを複合体の残りの未架橋TUDタンパク質および濃度の架橋TUDタンパク質複合体の効果的な分離に基づいている。上述した我々のインビボ架橋条件で、TUDタンパク質の大部分は依然として残っている未架橋の可能性がある。これ自由TUDタンパク質は、SDS-PAGEによる分離するまで、IPの間に架橋された複合体と同時精製でしょう。明らかに保持することなく、7％のボーダー - サイズが大きくても、未架橋TUDタンパク質（285 kDa）は、3％を越え移行されます。大きな分子量を有する架橋TUDタンパク質複合体は、目に得られた、難易ゲル国境を越えて移行を有するのに対しE複合体は、「トラップ」との国境に近い境界線や「テーリング」に集中しているため、自由TUDタンパク質から分離されている。 <p ...

多成分タンパク質複合体は、細胞機能および開発中に重要な役割を果たしている。ここでは、後続の構造-機能分析のための架橋された複合体の精製に続いてインビボ架橋後のショウジョウバエ胚から天然のタンパク質複合体を単離するために用いた方法を記載している。

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

本実験の全体的な目的は、in vivo架橋法を用いて、生存しているショウジョウバエの胚からタンパク質複合体を得ることであります。まず、数千匹のハエを個体ケージに入れ、初期胚を回収します。次に、ホルムアルデヒドを用いてタンパク質をin vivoで架橋し、内部のタンパク質複合体を安定化させます。次に、タンパク質複合体を免疫沈降させるため、架橋した胚からタンパク質抽出液を調製します。その結果、ウェスタンブロット分析によって単離されたタンパク質複合体が同定されます。in vitroアプローチによる従来のタンパク質複合体の単離法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、このin vivoアプローチにより、従来のin vitro法では検出できない可能性がある、一過性ながら機能的に重要なタンパク質間相互作用を捕捉できることです。本テクニックの実演は、私の研究室のポストドクであるMin Gao博士が行います。まず、撹拌子を用いて水とフライアガーを混ぜ合わせます。この混合物をオートクレーブで滅菌します。スクロースをリンゴジュースに混ぜ、プレート上で70 °Cまで加熱します。その後、混合物を合わせ、アガールが凝固するまで15分間冷却します。新鮮な4-ヒドロキシ安息香酸メチルをエタノールで調製します。これは保存剤です。これを凝固混合物に加え、5分間攪拌します。その後、気泡が入らないように、混合物を300平方センチメートルのプラスチック製または発泡スチロール製のプレートに注ぎます。プレートを4°Cで保存し、1週間以内に使用してください。胚を回収するための、4万～5万匹のハエが入ったポピュレーションケージを用意します。表面に約4gのパン酵母を散布した、新鮮なコーンミール・モラセス充填プレート2枚をポピュレーションケージに取り付けます。これらのプレート上で、25°Cで48時間、ショウジョウバエを飼育させます。2日後、2枚のアップルジュースアガープレートに約1gの酵母を散布し、個体群ケージ内のプレートをこれらのプレートに交換します。1時間後、ケージ内のプレートを、同タイプの新しいプレート2枚にさらに交換します。ハエを1時間使用した2枚の回収プレートに胚が溜まっています。プレート上の胚を水とともに懸濁させ、ブラシを用いて取り除きます。その後、2層のふるいを通して回収します。上層には850 µmのステンレスメッシュを、下層には75 µmのステンレスメッシュを使用します。胚はより目の細かいメッシュ上に回収され、絵筆を用いて粗いゴミから分離します。回収した胚を、50 mLコニカルチューブの上部で作製した細目のナイロンメッシュバスケットに移します。胚を水で洗浄し、メッシュに入れたままペーパータオルで水分を拭き取ります。次に、胚を50%次亜塩素酸ナトリウム溶液に3分間浸します。溶液中で胚を軽く振り混ぜた後、水で十分に洗浄し、吸い取るようにして乾燥させます。次に、胚をイソプロパノールに約15秒間浸します。容器を軽く回すことで胚の凝集を解消させます。この操作に30秒以上かけないようにしてください。胚を吸い取って乾燥させ、その後、ヘプタン溶液に5分間移します。胚が凝集するのを防ぐため、ヘプタンを頻繁にピペッティングして胚にかけ、胚をブロッティングして乾燥させ、PBSTで洗浄します。3分間洗浄した後、メッシュごと胚を10 mLのPBSTが入った15 mLチューブに移します。メッシュを取り出し、胚を溶液中に残し、胚の量が100～300 µLの間になるように調整します。沈殿させた後、PBSTを吸引し、直ちに胚の架橋処理に移行します。まず、調製したばかりの0.2% ホルムアルデヒド/PBST溶液を10 mL、胚に加えます。25 °Cで緩やかに撹拌しながら10分間インキュベートします。10分間反応させた後、胚を沈降させてから溶液を除去します。次に、反応を停止させるため、速やかに0.25 Mのグリシン含有PBST 10 mLに溶液を置換します。チューブをさらに5分間振盪させます。クエンチ後、溶液を除去し、1回あたり10 mLのPBSTを用いて胚を3回洗浄します。残りのPBSTをピペットで吸引して除去し、胚は必要になるまで-80°Cで保存します。ダウンホモジナイザーと2 mLの溶解バッファーを用い、架橋した胚500 µLをホモジナイズします。これは、密着したペッスルを用いて約15回ストロークすることで完了します。溶解物をマイクロ遠心チューブに移し、15分間緩やかにロッキングミキサーで攪拌します。次に、溶解物を16,000 GSで5分間遠心分離します。上清を15 milliliterチューブに移します。ペレットは廃棄して構いません。次に、上清に anti ha agros ビーズスラリーを 40 µL 加えます。ビーズのコンジュゲーションが完了するまで、ロッキングミキサーで約 2.5 時間静置します。ビーズを2,500 Gsで5分間遠心分離し、ペレット化します。チューブ内に約250 µLの上清を残し、そこでビーズを再懸濁します。懸濁させたビーズをスピンカラム上の10 µmフィルターに転移させます。12,000 Gsで10秒間遠心分離し、溶液を除去します。カラム上のビーズを200 µLの洗浄バッファーで洗浄し、再度遠心分離します。この操作を合計3回繰り返します。次に、ビーズに40 µLの溶出バッファーを加え、37 °Cで15分間インキュベートします。この期間中、5分ごとにチューブを軽く振って、流出液を回収します。さらに一度、カラムを12,000 GSで10秒間遠心分離します。架橋の効率および架橋された2つのタンパク質複合体の精製効率を、3〜7%のステップゲルを用いたSDS-PAGEおよびそれに続くウェスタンブロットで分析しました。HAタグおよびGFPタンパク質を発現する胚を用いて、架橋の程度をモニタリングし、本プロトコルにおけるさまざまなホルムアルデヒド濃度を検討しました。処理した胚内のGFPの大部分は架橋されなかったため、この現象は起こりませんでした。ランダムに架橋された2つの複合体を、未架橋のコントロールと比較しました。架橋されなかった2つのタンパク質は、自由に移動する285 kilodaltonのバンドとして観察されます。架橋されたものは分子量が増大するため、粗タンパク質ライセート中での移動度は低くなります。2つのタンパク質の約半分がin vivoで架橋されていました。比較としてHAペプチドを用いて相互作用パートナーを溶出したところ、ビーズを洗浄した後、溶出画分には複合体と遊離したタンパク質の両方が含まれていました。SDSを除去することで、チューブ内には最小限のチューブ複合体と、大部分が遊離した状態の成分が残ります。この手順に続き、質量分析などの他の手法を用いることで、単離された複合体中のタンパク質成分の同定など、さらなる疑問を解消することが可能です。

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の"フィレット"の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。...

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス -...

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

我々は生体内での密度によって細胞小器官を分離する方法を説明します...

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。...

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

このプロトコールの目標は、中程度の規模（0.5〜1g）でショウジョウバエ胚を採取し、アフィニティー精製 - 質量分析法（AP-MS）のような下流のプロテオーム用途に使用できるタンパク質抽出物を調製するための、 ）。...

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

学ぶショウジョウバエ胚におけるin vivo架橋法によるタンパク質複合体の分離技術。ホルムアルデヒドを用いて一過性のタンパク質相互作用を安定化し、免疫沈降とウエスタンブロットで複合体を同定する方法です。

アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚

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