Name: マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶマウスにおけるLPS経口咽頭気管内投与と気管支肺胞洗浄を用いた宿主免疫応答評価法。この技術は局所炎症反応と組織病理学的変化を高解像度で評価し、病原体応答メカニズムの解明に有用です。

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著者らは、このプロジェクトの中核と技術サポートを提供するための獣医薬のVA-MDリージョナルカレッジに感謝します。この作品は、NIHのキャリア開発賞（K01DK092355）でサポートされています。

すべての研究は、バージニア工科大学のための制度的管理使用委員会（IACUC）の承認の下や実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った。 1。口腔咽頭の管理ページを使用してLPSの気管内（IT）の接種<ol><li>各動物を一意に耳パンチ、耳標、またはその他の制度的に承認する方法のいずれかを使用して識別されていることを確認します。 </li><li>各動物についてベースライン体重および体温を記録する。 </li><li> LPSの作業用ストックを準備します。各マウスは、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / kgのLPSを50μl量を受けるであろう。モック処置した動物は、1×PBSを50μlの線量を受け取ります。 </li><li>次のドロップ法を用いたイソフルランの投与のために適切な容器を準備します。施設のガイドラインには、イソフルラン及びその他の麻酔薬と前initiatへの使用に関して異なる場合どんな研究をING、人が十分に満たされているすべてのガイドラインを確実にするために動物実験/福祉の彼らの機関の部門に連絡してください。ドロップ法イソフルランを選択できない場合、他の麻酔剤は、許容される代替物である。 <ol><li>適切な安全キャビネット内で、500ミリリットルのビーカーの底に折り畳まれた吸収性の紙タオルと場所にイソフルランの約3ミリリットルを適用します。 </li><li>ペーパータオルの上にアルミニウム箔の小片を配置し、透明な蓋付きビーカーを覆う。 </li></ol></li><li>その接種の際に利用されるツールおよび試薬を準備します。挿管スタンドに頭の動物を確保するゴムバンドを配置します。この手順では、ストレートピンセット、角度のついた又は湾曲したピンセット、とヒントとP200のピペットが必要になります。 </li><li>挿管スタンドの横に容易にアクセス可能な場所にピペットチップ、所定の位置に負荷のLPSを50μl。 </li><li>マウスを麻酔イソフルラン室に動物を配置し、透明な蓋で容器を覆うことにより。第一室に置かれたとき、迅速かつ浅くされる、動物の呼吸パターンを観察します。呼吸率は通常、チャンバー内に配置する30秒以内に達成されている1息/ 2秒、近づくと動物が十分に麻酔をします。滴下法イソフルランを使用して承認された動物プロトコルに記載されているように、マウスを麻酔しなければならない。 </li><li>室から麻酔をかけたマウスを取り外し、フロント切歯によって挿管スタンドに動物を一時停止する。動物が確実に抑制し、口や舌がアクセス可能であることを確認してください。 </li><li>優しくストレートピンセットで舌を固定します。角度のついた鉗子で舌をつかみ、若干の抵抗が感じられるまでゆっくりと口から引き出します。このアクションは、喉頭蓋をブロックし、気管へのアクセスを得るために十分である。 </li><li>に舌を押したまま延長された位置は、喉の奥にLPSを50μlの用量を投与し、すぐに手袋をはめた指で、動物の鼻の穴をカバーしています。マウスが吸入されるまでLPSは、喉の奥に表示されます。 </li><li>鼻の穴をカバーし、5月10日追加の呼吸のために拡張舌を押し続けます。 </li><li>挿管スタンドからマウスを取り外して、麻酔から回復するまで戻って新しいケージに動物を配置します。 </li><li>疾患の進行に関連する代理マーカーを監視します。体重および体温研究の期間毎に4-8時間を監視すべきである。同様に、行動特性の増加罹患率と関連する臨床症状を評価する。 </li><li> LPS暴露後の特定の時点で疾患の進行、収穫マウスを評価した。 LPS曝露後の収穫のための典型的な時点は0、6、12、18、24、および48時間が含まれています。回復および生存率を評価するために、7 DA用のマウスを評価YS接種後。 </li></ol> 2。血清および気管支肺胞洗浄液（BALF）コレクション<ol><li>制度的に承認された方法を使用して、マウスを生け贄に捧げる。 </li><li>その裏に動物を置き、高さ（1.27cm）の中で、理想的に0.5、剖検ボードに固定します。 </li><li> 70％エタノールでマウス全体を濡らす。 </li><li> 27 Gの針を有する1ミリリットルの注射器を使用して、前に任意の切開を行うに心臓穿刺を行っています。これは、単一のマウスから全血の500〜800μLを撤回することが可能なはずである。 </li><li>注射器から針を外し、前標識1.5ミリリットルの微量遠心管に全血を転送します。血清収集のために、全血を室温で少なくとも30分間凝固させることを可能にする。血清コレクションに加えて、この手順は、免疫細胞を研究するために、循環、全血を収集する前に、チューブ及びシリンジ内の抗凝固剤を組み込むことによって修飾することができる。 </li><li>横切開aを作るマウスの下顎に腹腔と腹膜腔からの垂直切開の長さを渡ります。 </li><li>鉗子を使用して、切開の両側をつかみ、静かに、基礎となる腹膜や胸腔から肌を引き出します。 </li><li>ダイアフラムを切らないように注意しながら、性器から胸骨に腹腔の長さに沿って大きな切開を加えます。穏やかに腎臓の一つへのアクセスを可能にする腹腔内に腸をシフトする。 </li><li>灌流のための排水ポイントとして機能する腎臓につながる腎静脈を切った。 </li><li>ニックは、振動板には、はさみを使って心臓の左側を露出させ、肺と心臓を避けるように注意しながら。 </li><li>手動で27 G針および1×PBS溶液で10mlの注射器を用いて心臓を灌流。生理食塩水が肺に強制されていないことを確実にするために灌流中、無理な力を加えないようにしてください。残血門脈切開から排出should。</li><li>慎重に心臓や肺を切らないように注意しながら、鈍/鈍ハサミを使用して胸骨に沿って胸郭を切った。誤ってこの手順の間に肺を切断して大幅に収集されたBALFの量を減らすことになり、適切に固定液で肺を膨らませることができないことになります。 </li><li>静かにピンセットを用いて胸郭から心臓や肺を分離します。慎重に、できるだけ背骨の近くに鈍/鈍ハサミを使用して胸郭の各セクションをカットし、完全に両方のセクションを削除します。 </li><li>ピンセットを用いて唾液腺を分離またはハサミで除去してください、気管を露出させる。 </li><li>慎重にハサミを使って気管をオーバーレイ筋肉を切る。これは、気管このプロセス中に切断されないことが必須である。 </li><li>はさみを使用して、気管の上にある鎖骨を分離。 </li><li>優しく鉗子を使用して、胸腺を把握し、心臓から組織を持ち上げます。に注意しながら、はさみを使用して、胸腺を削除心臓や肺を切断しないようにします。 </li><li>角度のついたはさみ（45〜90度の角度、シャープ/シャープ）を使用して、1〜2輪喉頭下の気管に小さな横切開する。切開はしっかりとカニューレを固定するのに十分な大きさでなければなりません。 </li><li>テーパ端部を切開下に2〜3気管輪を拡張するようにカニューレを挿入し、絹縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。縫合糸が気管と食道の間を通過し、カニューレにきつく引っ張られていることを確認してください。 </li><li>ハンクス溶液（HBSS）1mlで1ミリリットルの注射器を記入し、ゆっくりとカニューレにそのルアーを挿入します。 </li><li>ゆっくりと、しかし一定の動きを使用して、肺を膨らませる、気管に〜900μLを注入し、すぐにHBSSを撤回。 15ミリリットルコニカルチューブに回収BALFを配置します。 </li><li>将来の分析のために、BALFの約3ミリリットルを収集するには、この洗浄を2回追加を繰り返します。使用するまで氷上で、または4℃でBALF保管してください。 </li></ol><ol><li>肺膨張スタンドに10ミリリットルの注射器を挿入します。シリンジにルアーにチューブ、ストップコックにルアー、およびストップコックを組み立てます。ストップコックが閉じた位置にあることを確認してください。 10mlシリンジは、重力流溜めとして機能する。リザーバは、動物の上に4.75スタンドとリザーバの上部が動物上で10.5を拡張する必要があり、インフレに添付する必要があります。 </li><li>中性緩衝ホルマリン溶液で注射器を埋める。注射器が完全に固定液で満たされていることを確認します。 </li><li>チューブの開放端部の下に吸収性タオルを置き、固定液は、チューブを埋めることができるようにストップコックを開いてください。固定液は、チューブから流れる始まると、すぐにストップコックを閉じて、固定剤でトップに注射器を補充します。それは、注射器が完全に肺のインフレ圧力の適切な量を提供するために満たされることが重要である。 </li><li&gt;静かに約1〜2気管輪カニューレの終わりの下に、気管の下に縫合糸の第二の一枚を渡す。 </li><li>縫合糸の単一緩い結び目を作る。しかし、結び目をしっかり引っ張らないでください。 </li><li>カニューレにマウスインフレスタンドからチューブを挿入します。 </li><li>ストップコックを開き、肺が重力インフレによって埋めることができます。 </li><li>肺は彼らの最大のインフレ水準に達すると、縫合糸がきつく引っ張り、二結び目を作る。 </li><li>ストップコックを閉じて、カニューレからチューブを取り外します。 </li><li>静かにピンセットで縫合糸をつかみ、指でカニューレを保持することによって気管からカニューレを取り外します。しっかりと胸腔とバックマウスの鼻に向けてカニューレに向けて縫合糸を引っ張る。 </li><li>優しく鉗子で気管または縫合糸をつかみ、首キャビティから気管に持ち上げます。 </li><li>鈍いはさみを使用して結ば縫合糸に気管尾を切断。 </li><li>一度trache離れてマウスの気管を引っ張って始め、基盤となる組織がない。優しく胸腔から肺を持ち上げます。 </li><li>慎重に胸腔内の肺を保持する結合組織をカット。根本的な接続を切断しながら、離れてマウスの体から気管を引っ張って継続し、着実に上向きの力を適用します。肺を切らないように注意してください。心臓が左に、この方法を使用して肺に接続する必要があることに注意してください。 </li><li>肺が削除された後は、緩衝ホルマリン10mlに配置します。 </li><li>ジェノタイピングのためのマウス尾の部分を削除します。 </li><li>適切な施設のガイドライン以下のマウス死体を処分。 </li></ol> 4。サイトカイン評価<ol><li>血清を単離するために5分間12,000×gで、ステップ2.5の下で採取した全血を、遠心分離する。 -80℃での前標識1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアに血清を転送</li><li>干せるを評価ELISAまたは他の同様のアッセイによるMのサイトカインレベル。製造指示に従って、アッセイに応じて、適切な希釈バッファーで1時20分 - 血清を1:5に希釈します。これらの希釈液は、経験的に前のサンプルの大部分を実行しているに判断すべきものである。 </li><li>採取した血清の低容量に起因して、半分にELISAプレート上にロードしたサンプルの体積を減少させる。たとえば、ほとんどの市販のELISAは、標準および試料100μlの容量を利用する。標本、負荷50規格のμLとウェルあたり希釈した血清を節約する。 </li><li>遠心分離機5分間200×gで冷蔵卓上遠心機でBALF。 2に、無細胞上清を移し-80℃で1.5 mlマイクロチューブや店舗を前標識</li><li>希釈することなく、ELISAまたは他の類似のアッセイにより、BALFのサイトカインを評価します。 </li><li> -80℃で保存し、未使用の血清およびBALF </li></ol> 5。染およびBAL細胞性評価<ol><li> BALFを遠心分離し、完全HBSSを除去した後、低張性食塩水を用いてペレット化した赤血球を溶解。蒸留水900μLで細胞を懸濁します。すぐに10倍のPBS 100μLを加える。 </li><li>個別に各サンプルを溶解。サンプルは、赤血球の過剰な量が含まれている場合、細胞は、5分および赤血球溶解プロトコル400×gでテーブルトップ遠心機でペレット化することができる繰り返すことができる。 </li><li>トリパンブルー染色で10倍または20倍の倍率の下で血球計を使用して、1ミリリットルの懸濁液中の総BALF細胞性を決定します。細胞/ mlとして、これらのデータを評価し、提示する。 </li><li>サイトスピンや染のための材料を準備します。鉛筆や耐溶剤性のペンを使用して標準的な顕微鏡用スライドにラベルを付けます。サイトスピンブラケットと漏斗にスライドを固定します。サイトスピンローターでスライドアセンブリを固定します。 </li><li> 5分間100×gでBALFのサイトスピン150μL。細胞密度を効果的に大きすぎると細胞形態を評価し、スライド上にスピンダウンし、ボリュームを下げる。スライドを一晩乾燥を放送することができます。 </li><li>差動製造プロトコル以下のスライドを染色する。スライドを一晩乾燥を放送することができます。パーマウントを使用してスライドをカバースリップし、20Xおよび40X目的を備えた顕微鏡を使用してスライドを評価します。 </li><li>例えば、FACS、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、遺伝子発現の評価のためのRNAの抽出、および/またはウェスタンブロットのためのタンパク質抽出などのその後の分析のために残りの細胞を、収穫。 </li></ol> 6。組織病理学的評価<ol><li>組織病理学的評価のための肺を準備します。ホルマリン固定の24〜48時間後に、腹全体の膨張した肺を配向し、パラフィンに包埋した。メイン誘導気道を露出させられたブロックをカット。 </li><li>採点の精度を向上させるために、同じ位置に肺を位置決めし、tの最大前後視覚化を得るために各ブロックをトリム彼はメインの軸方向の気道を肺内。この点から、5ミクロンの連続切片ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色を切った。追加の切片を切り出し、標準的なプロトコルを用いてin situハイブリダイゼーションのために調製することができる。 </li><li> 0（不在）及び3（重度）の間で採点され、以下の炎症性パラメータに基づいて半定量的スコアリングシステムを用いて組織病理を評価する：核及び多核細胞浸潤;上皮細胞過形成や傷害気道;溢出;血管周囲とperibroncheolarカフィング;および炎症に関与肺のパーセント。肺の組織病理は、経験豊富な病理学者で評価してください。 </li><li>総組織病理学スコアを生成したり、病気の進行の特定の側面を定量化するために個々のスコアを使用して、パラメータのスコアがすべて平均。遺伝子型と治療の両方を知らされていない査読者との、二重盲検法ですべてのスコアリングを行っています。このスコアリングシステムは、previouslされているYは、6,7,10を記述した。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

成功したマウスの肺における宿主免疫応答を評価するための最も重要なステップは次のとおりです。1）評価対象モデルに適したマウス系統、性別を選択する。 2）肺へのPAMPの配信を最適化する。 3）正しくBALFを収集し、処理する。そして4）適切に修正し、組織病理学的評価のための肺の準備。 マウス株の選択は、宿主の免疫応答を評価する上で重要な要因である。 C57BL / 6マウスは、典型的ほとんどのPAMPへのTh1のスキューで堅牢なレスポンスに対する自然免疫を研究するための最適なマウスの背景と考えられている。同様に、BALB / cマウスは、典型的には、それらのTh2スキューアレルギー疾患モデルを研究するために使用される。肺モデルでの第三一般的に使用される株は、遺伝子改変動物を生成する際に、その一般的な使用のために129SvEvの背景にマウス、である。すべての場合において、注意が実験計画と可能な限り、年齢、性別ミリアンペア時に注意が必要ですリットルメイトコントロール動物は野生型動物に遺伝的に改変されたマウスを比較する研究のために使用されるべきであるtched。 LPSプロトコルは、ここで...

病原性細菌種に関連する肺感染は、世界的な罹患率および死亡率の一般的な原因である。これらの病原体に対する宿主の免疫応答をドライブするメカニズムを決定することは、これらの感染症の影響を減衰させる新たな予防戦略と治療薬の開発を推進していきます。ここに記載されたプロトコルの全体的な目標は、生きた細菌の代用物としての病原体関連分子パターン（PAMP）を用いて病原体感染に対する宿主の先天性免疫応答を評価するために柔軟な方法をユーザに提供することである。細菌に対する宿主自然免疫応答を評価する以前の研究の大部分は、実行が比較的容易に腹膜モデルに焦点を当てている。これらのモデルは非常に有用であり、宿主 - 病原相互作用および全身性炎症分野で大きな進歩をもたらしましたが、これらのモデルから生成されたデータには、常に問題研究のための適切ではありませんinvolvi呼吸器系ngの。ここでは、急性肺炎症の肺モデルは、古典的な腹腔内（ip）注射モデルの実用的かつ臨床的に関連する拡張として提案されている。提案された技術は、器官特異的モデル系における先天性免疫応答の局所的評価を可能にする。 ここで説明する方法は、ユーザが共通のPAMPであるLPSに対する宿主の免疫応答を評価することを可能にするための簡単​​かつ堅牢な技術を提供するように設計されている。方法は、マウスおよび呼吸器感染症及び急性肺障害に罹患している1ヒト患者において観察される病態生理学的特徴の多くを模倣するの肺におけるロバストな先天性免疫応答を誘導するLPSの気管内（it）点滴に基づいている。この技術の主な利点は、ユーザがインビボ研究導通に関連付けられた交絡因子および安全性の懸念なしに宿主免疫応答を評価することを可能にすることである生菌を使用した。同様に、このプロトコルで説明した露光の口腔咽頭のIT投与経路は、行政（中）、鼻腔内、外科、IT管理など、他の一般的に利用された技術、上の重要な利点を持っています。例えば、口腔咽頭IT管理は、典型的に、鼻腔内のエージェントの損失に肺沈着の増加変動を患っており、2〜4洞管理、中に比べて比較的正確な投薬および肺沈着を可能にします。それの投与経路は、これらの空洞を回避し、気管や気道に直接アクセスすることができます。同様に、外科的なITアプローチは、かなり多くの病的な投与方法で、マスターに広範囲の訓練を必要とします。ここで説明するプロトコルも記述一般的な技術と炎症の進行を評価し、LUを調製するための適切な技術を記載したプロトコルで終了するために使用する代理マーカーが含まれる組織病理学的評価のためのNGS。これらのプロトコルは、各々の動物から生成されたデータを最大にすることによって、各試験に必要なマウスの数を最小化に焦点を当てている。 記載されたプロトコルは、非常に柔軟であり、容易に多様な範囲のPAMPのダメージ関連分子パターン（減衰）を評価するために修飾することができる。さらに、いくつかの追加の修飾と、これらのプロトコルはまた、アレルギー性気道疾患の進行または生細菌、ウイルスまたは真菌5-10有する宿主-病原体相互作用を評価する研究に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>ストック 000664</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトスケール</td><td>オーハウススケールコーポレーション</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>小動物直腸体温計</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類用直腸プローブ</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>イヤーパンチ</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>トラキャエル内投与および肺インフレーションスタンド</td><td>ICAP製造</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類挿管スタンド</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>はさみ(鈍/鋭利)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>鉗子(ストレート)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>鉗子(45&ordm;、湾曲)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>ハサミ(鈍/鈍い)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(200&micro;l 容量)</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグ</td><td>マ 459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD メディカル</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD メディカル</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5 インチ ニードル</td><td>BD メディカル</td><td>305109メディカル アンド</td><td></td></tr> 冷蔵<tr><td>マイクロ遠心機</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mm 気管カニューレ ルアーアダプター付き</td><td>ハーバード製装置</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバランスの取れた塩溶液</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 シルク編組外科用縫合</td>糸 <td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>ルアー チューブ コネクタキット</td><td>ハーバード製装置</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>ルアー ストップコック キット</td><td>ハーバード製 721664</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイゴン式E-3603実験室の管</td><td>シグマ</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリンの解決、中性緩衝、10%</td><td>シグマ</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-1&ベータ;OptEIA ELISAキット</td><td>BD Biosciences 559603</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウスIL-6 OptEIA ELISAキット</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>マウスTNF-&alpha;OptEIA ELISAキット</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤カバー メガネ</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnels</td><td>Fisherサイエンティフィック</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>フィルターカード</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>サイトスピン サイト遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff クイック染色キット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>パーマウント マウント ミディア</td>ム <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内pamp管理および気管支肺胞の活用

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

病原体に対する宿主免疫応答は、複雑な生物学的プロセスである。 インビボ研究の大部分は、古典的宿主-病原体相互作用は、マウスにおけるセレクト細菌または病原体関連分子パターン（PAMP）の腹腔内注射を活用特徴付けるために用いられる。これらの技術は、感染症の病理生物学に関連した膨大なデータが得られているが、腹腔内注射モデルは常に、肺における宿主 - 病原体相互作用の研究には適していません。マウスにおける急性肺炎症モデルを利用し、それは先天性免疫応答は、リポ多糖（LPS）を利用してホストの高分解能解析を行うことができる。ここでは、非外科的口腔咽頭気管内投与を使用して、LPSを投与し、疾患の病因に関連する臨床パラメータをモニタし、宿主の免疫応答を評価するために気管支肺胞洗浄液を利用する方法を記載している。記載されている技術のPAMPおよび病原体の多様な範囲に対する宿主自然免疫応答を研究するために広く適用可能である。同様に、若干の変更を加え、これらの技術はまた、アレルギー性​​気道炎症を評価する研究および薬理学的用途に適用することができる。

グラム陰性菌の細胞壁は、環境において非常に豊富であるLPS、から構成されている。敏感なヒト集団におけるLPSの吸入は気道反応性を悪化させると、強い免疫response11をトリガすることができます。 LPSはまた、堅牢な先天性免疫応答を誘発するためにマウスモデルで使用される一般的なPAMPである。ここに記載されたプロトコルでは、マウスは、E.から単離されたLPSのそれの投与を受けた大腸菌 ：口腔咽頭のIT管理を使用して（血清型0111 B4）。 LPS曝露のモデルでは、体温及び体重の両方が、動物の病的状態および疾患進行の典型的な代理マーカーである。 LPS攻撃は徐々に24時間（ 図1A）の過程でベースラインに戻って増加している、最初の6時間以内に体温の有意な減少の原因となります。しかし、体重は順調にそれがピークに徐々 Nの上に回復する場合には、24時間（ 図1B）の経過とともに減少しますEXT 48〜72時間。このように、体温は、炎症開始の初期段階を評価するためのより適切なマーカーである。一方、体重が病因および回復の後の段階の間に、よ...

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

本手順の全体的な目的は、マウスにおける宿主免疫応答を評価するための、口咽頭経気管的なLPS投与および気管支肺胞洗浄法の使用法を実演することである。まず、口咽頭投与を用いてマウスにLPSを接種する。次に、気管カニューレを挿入し、その後、局所的な炎症反応を評価するためにカニューレを通じて気管支肺胞洗浄液を回収する。最終ステップとして、組織病理学的評価のために肺をホルマリンで固定（膨張）させます。最終的に、腸管のサイトカインプロファイルと肺の組織病理学を解析することで、LPSに対する宿主の免疫応答を評価することができます。鼻腔内投与や外科的な気管内投与などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、操作が比較的簡便であり、正確な投与量と肺への沈着が可能である点にあります。まず、LPSを気管内に注入します。麻酔をかけたマウスを挿管し、固定します。前切歯の部分で固定し、動物がしっかりと拘束され、口と舌にアクセスできる状態であることを確認してください。ストレート鉗子で舌をそっと固定し、次に角度付き鉗子で舌を掴み、舌を保持したまま、わずかな抵抗を感じるまで筋肉を口からゆっくりと引き出します。この状態で、喉の奥にLPSを50 µL投与し、直ちに手袋を着用した指で動物の鼻孔を5〜10回呼吸の間塞ぎ、屠殺後の洗浄液を回収できるようにします。次に、腹腔の長さに沿って水平に切開し、腹腔からマウスの下顎に向かって垂直に切開します。次に、ピンセットで切開部の両端を掴み、皮膚を下の腹腔および胸腔からそっと引き離します。続いて、生殖器から胸骨まで、腹腔の長さに沿って大きく切開します。このとき、横隔膜を切らないように注意してください。その後、腹腔内の腸管をそっとずらし、片方の腎臓にアクセスできるようにします。灌流の排液点とするため、腎臓につながる腎静脈を切断します。次に、肺と心臓を傷つけないよう注意しながら、鋏で横隔膜に切れ込みを入れます。心臓の左側を露出させるため、27ゲージの針を装着した10 milliliterシリンジを用いて、心臓にPBSを手動で灌流します。残りの血液を門脈の切開口から排出させます。次に、鈍端剪刀を用いて、胸骨に沿って肋骨を慎重に切断します。この際、心臓や肺を切断しないように注意してください。心臓と肺を穏やかに分離し、次に鈍端剪刀を用いて、肋骨の各部位を脊椎にできるだけ近い位置で慎重に切断します。両側の肋骨を完全に除去した後、唾液腺を分離して気管を露出し、気管自体を切断しないように注意しながら、気管を覆う筋肉を慎重に切断します。次に鎖骨を分離し、胸腺をそっと掴んで心臓から持ち上げます。次に、心臓や肺を切断しないように注意しながら、はさみで胸腺を除去します。続いて、角度付きの鋭いはさみを用い、喉頭から1〜2個下の気管輪の位置で、カニューレをしっかりと固定できる十分な大きさの小さな水平切開を加えます。その後、テーパー状の先端が気管輪2〜3個分まで届くようにカニューレを挿入します。切開部の下方で、気管と食道の間をシルク縫合糸で結び、カニューレを固定するために糸をきつく締め付けます。次に、1 mLシリンジにHBSSを満たし、ゆっくりと一定の動作でルアーを慎重にカニューレに挿入します。続いて、約900 µLのHBSSを気管内に注入して肺を膨張させ、直ちにHBSSを回収し、回収した液体を15 mLコニカルチューブに分注します。洗浄をさらに2回繰り返し、約3 mLの洗浄液を回収します。肺の解剖に備え、洗浄液を氷上で保存します。組織病理学的解析のために、10 mLシリンジを肺膨張スタンドに挿入し、チューブをルアーに、ルアーをストップコックに、そしてストップコックをシリンジに接続します。ストップコックが閉じた状態であることを確認し、シリンジに中性緩衝ホルマリン溶液を満たします。シリンジが固定液で完全に満たされたら、チューブの開放端の下に吸収性タオルを敷き、ストップコックを開いて固定液をチューブ内に満たします。チューブから固定液が流れ始めたら、すぐにストップコックを閉じて、シリンジを固定液で満たします。次に、気管の下、気管輪1〜2個分ほどの位置に2本目の縫合糸をそっと通します。カニューレの先端より下の位置で縫合糸を緩く一結びし、マウスのインフレーション用のチューブを挿入します。カニューレを固定します。ストップコックを開き、重力による膨張で肺を満たします。肺が最大膨張レベルに達したら、縫合糸を強く引き、2つ目の結び目を作ります。ストップコックを閉じてカニューレからチューブを取り外し、ピンセットで縫合糸を掴みます。縫合糸を胸腔方向へしっかりと引き下げ、同時にカニューレをマウスの鼻方向へゆっくりと引いて抜去します。次に、気管を頚腔からそっと持ち上げ、鈍端剪刀を用いて結紮糸の側で気管を切断します。気管を下の組織から切り離したら、気管をマウスから引き離し、肺を胸腔からゆっくりと持ち上げます。次に、肺を胸腔に固定している結合組織を、安定した上方向への力で慎重に切断し、肺を傷つけないように注意しながら、気管をマウスの体から引き離し続けます。最後に、肺を10 millilitersの緩衝ホルマリンに固定します。LPS曝露モデルにおいて、動物の罹患度および疾患進行の典型的な代替マーカーである体温と体重を確認すると、グラフに示されている通り、LPSチャレンジによって最初の6時間以内に体温が著しく低下し、その後24時間かけて徐々にベースラインまで回復します。一方、体重は24時間かけて着実に減少し、その後48から72時間かけて徐々に回復します。したがって、炎症の初期段階を評価するには、体温の方がより適切なマーカーとなります。体重は病態の後半段階および回復期においてより信頼性の高い指標となりますが、気道へのLPS曝露は白血球の顕著な浸潤を引き起こします。曝露後6時間以内の肺では、宿主の自然免疫応答に関連する細胞が肺胞内で観察されます。その後、免疫応答がピークに達する24〜48時間にかけて細胞数は増加し続け、その後、炎症の消退期に入ります。24時間までには、肺内に相当数の好中球が出現し、分染後の肺胞内で観察することが可能です。弁細胞性の評価は、肺における宿主免疫応答に関連する細胞を特徴付けるための、堅牢で定量可能な手法を提供します。この増加は、気道、血管、および肺実質への好中球の著しい浸潤と一致しています。肺の組織病理学的な評価は、画像で示されているような半定量的なスコアリングシステムを用いて効果的に行うことができます。LPSは、血管周囲、細気管支周囲および肺実質の炎症を有意に増加させます。LPS投与は、ELISAで検出される自然免疫応答に関連する複数のサイトカインを含む、高レベルの局所的および全身的な前炎症性メディエーターを誘導します。LPS投与後に肺で発現が上昇する一般的なサイトカインには、TNF-α、IL-1β、およびIL-6が含まれます。全身のサイトカインレベルは、腸管評価で示されたものと同様の手法を用いて血清中で評価することが可能です。重力置換固定法は、膨張させていない肺や、重力を利用して手動で膨張させた肺に比べ、最適な組織病理学的評価条件を可能にします。膨張させることで均一な特徴が得られ、正確なスコアリング、肺胞損傷の低減、可視化の向上、および炎症評価における高解像度が実現します。肺の手動膨張では、通常、膨張が不均一な領域が生じます。これらの領域は部分的にしか膨張せず、組織の虚脱が起こることが多く、経験の浅い査読者によって病理学的特徴と誤認されることがよくあります。手動での送気は、肺の一部に過剰膨張を引き起こし、その結果、肺胞腔に広範な損傷を与えます。一方、送気されていない肺では肺胞腔が虚脱しており、高度なトレーニングなしにそれらを判別し評価することは困難です。同様に、臓器が虚脱しているため、この手法ではin situでの肺の外観を可視化することはできません。このビデオを視聴することで、外科的手術を必要としない簡便な口腔咽頭および気管投与の手順と組織採取を用いて、マウスにLPS介在性急性肺炎症を誘導し、評価する方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

げっ歯類の呼吸の生理学と気道炎症細胞のサンプリングの繰り返し測定が望ましいですが、一般的には不可能。ここでは、気道過敏性と気道炎症細胞のサンプリングの繰り返し測定を可能に経口挿管マウスの反復可能な方法を説明します。...

気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法

我々は気管を経由して麻酔したマウスの肺に試験物質の非外科的配信を示しています。このメソッドは、肺の細菌やウイルス性病原体への曝露、サイトカイン、抗体、ビーズ、化学物質、または染料を許可します。我々は、さらにフローサイトメトリーのために肺および肺リンパ節（LDLNs）の収穫と処理を説明します。...

フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

私たちは、2.0ミリメートルの鏡と耳鏡を使用して直接喉頭鏡検査を介したマウスでは、気管内挿管のための、シンプルな信頼性が高く、比較的安価な方法を開発した。この技術は、非外傷性であり、慢性の実験において反復測定のために使用することができる。私たちは、優れた気管切開または以前に非外科的手法を報告したために見つける。...

マウスの気管内挿管<em&gt;経由</emオトスコープの使用&gt;直接喉頭鏡検査

試薬の挿管媒介気管内（IMIT）点滴は、呼吸器疾患を研究するための優れた、非侵襲的な方法だけでな​​く、肺に直接治療薬を浸透させるための方法である。これは前臨床試験のために適して迅速かつ高度に再現可能な方法である。...

挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

宿主と病原体の相互作用に関するin vitro研究は特定の免疫応答の特性評価を可能にしますが、複雑な反応の影響を観察するにはin...

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

マウスの下気道へのインフルエンザ菌の気管内接種手順を実演します。これは、マウスモデルで気道の炎症を調節するシグナル伝達経路を研究するための非常に有用なツールです。...

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

ここでは、マウスモデルにおけるBCGによる鼻腔内および皮下免疫によって誘発される防御効果と肺免疫応答を比較するための方法論について詳しく説明します。私たちの結果は、肺ワクチン接種の利点を示しており、ワクチン誘発性防御におけるIL17媒介反応の役割を示唆しています。...

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

いくつかの方法は、マウスにおける細菌性肺炎をモデル化するための文献に記載されています。ここで、我々は、中咽頭にピペット細菌接種の吸引（ すなわち 、吸入）を介して肺炎を誘導するための非侵襲性の、安価で迅速な方法を記載します。肺の先天性免疫応答を評価するための下流の方法も詳しく説明されています。...

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

肺の健康状態は、肺の細気管支に存在する免疫細胞のタイプおよび数によって反映される。私たちは、気管支肺胞洗浄技術を説明し、非接着性細胞およびマウスの下気道からの可溶性因子の単離および研究を可能にする。...

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

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マウスにおける非侵襲的気管内リポ多糖点滴

学ぶマウスにおけるLPS経口咽頭気管内投与と気管支肺胞洗浄を用いた宿主免疫応答評価法。この技術は局所炎症反応と組織病理学的変化を高解像度で評価し、病原体応答メカニズムの解明に有用です。

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

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