バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

この手順の全体的な目標は、システム生物学指向の推定のために、タバコの木の葉の材料からの代謝物とRNAシーケンシングデータを確立し、最適化することです。これは、最初に発生葉シリーズの生物学的材料を収集することによって達成されます。第2のステップは、その後の分析に依存する適切な溶媒を使用して材料の抽出を行うことです。

次に、ガスクロマトグラフィー、質量分析、またはGCMSを使用して代謝物と炭化水素を測定し、RNAシーケンシングデータ取得を使用して転写産物を分析します。最終的には、代謝物プロファイリングとRNAシーケンシングによる転写プロファイリングの組み合わせを使用して、タバコの木の葉が長鎖炭化水素やその他の重要な化合物をどのように発達させるかを示します。この方法は、タバコの木の葉で作られる重要な有用な代謝物を同定し、定量化するために使用できます。

この方法は、タバコの木のメタボロームについての洞察を提供することができます。また、タバコや近縁種などの他のシステムにも使用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、タバコの木の葉から良いRNAを抽出するのが難しいため、苦労するでしょう。

このマルチBioo PROビデオでは、FERNAグループのメンバーが抽出物とプロファイルを代謝する様子を見ることができます。GCMSを使用して、あなたはまた、フレイザーグループから炭化水素を抽出し、また、私自身のグループから1つのメンバーがRNAシーケンシングのためのRNAを抽出することがわかります 最初の30センチメートルの直径の鉢で猫Oceana Glauca植物を成長させることから始めます Mの2つの専門的な成長培地が含まれています 一次代謝産物を準備するためのテキストプロトコルに詳述されているように、 植物の葉と茎を収穫し、材料をすぐに凍結します 冷凍植物材料を凍結乾燥します 3日間凍結乾燥し、凍結乾燥サンプルを金属ボールでミキサーミルで粉砕し、得られた微粉砕乾燥材料を2ミリリットルの遠心分離管またはガラスバイアルに分注します。次に、10ミリグラムの葉または20ミリグラムの茎を粉砕した乾燥植物材料を2ミリリットルのスクリューキャップ丸底チューブにアリコートします。

1.4ミリリットルの100%メタノールを加え、10秒間渦巻きます。次に、ボルテックスする前に、内部定量標準として60マイクロリットルのリブアトールを追加します。さらに10秒間、1つのステンレス鋼ボールを追加し、10分間の遠心分離後、ミキサーミルで25ヘルツで2分間材料を均質化します。

重力の11, 000倍で、上清をガラス瓶に移します。750マイクロリットルのクロロホルムと1.5ミリリットルの水を加えてから、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、上相から150マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

次に、スピードバキュームを使用してサンプルを乾燥させます。サンプルは、残留液がなくなるまで3時間から24時間乾燥させることが不可欠です。乾いたら、40マイクロリットルの塩酸メスチンを追加します。

次に、水平ヒートブロックシェーカーで37°Cで2時間ミックスを振とうします。70マイクロリットルのM-S-T-F-Aミックスを加え、再び摂氏37度で2時間振とうします。GC MS分析に適したガラスバイアルに液体を移す前に、カバー上の液滴を短時間の遠心分離でスピンダウンします。

GCMSに続いて、質量分析データの解析用ソフトウェアの設定や、処理するデータ解析の選定により、データの解析を行います。化合物クラスに従って検出された対象ピークの表を調製します。標準化合物の連合によってピークを同定し、その後、質量分析、構造特性評価アルゴリズム、文献調査、および炭化水素抽出のための代謝物データベース検索を使用して、検出されたピークに注釈を付けます。

収穫したばかりのncoa glaucoの葉を約200ミリグラム浸し、2〜20分間溶媒にし、葉を取り除き、ロータリー蒸発によって溶媒を完全に乾燥させます。次に、サンプルを1ミリリットルのHPLCグレードのヘキサンに再懸濁します。テキストプロトコルに詳述されているパラメータを使用して、サンプルのGCMs分析の実行に進みます。

最初に、自動MSを使用してクロマトグラム成分を解析します。デコンボリューションおよび同定システムと NIST 98 MS.図書館。飽和長鎖acan炭化水素の同定は、保持時間および古典的なフラグメンテーションパターンを既知の真正標準と比較することにより、確認します。次に、積分ピーク面積と線量反応曲線を比較することにより、炭化水素を定量的に決定します。

本物の標準から構築され、Excelソフトウェアを使用して平均と平均の標準誤差を計算します。このプロトコルは、TRIOL RNA抽出とRNイージーキットを組み合わせて、ミキサーミルによる金属ボールを使用して、2ミリリットルの遠心分離チューブで100ミリグラムの凍結植物材料を高品質に粉砕します。サンプルの均質化に続いて、材料を12, 000倍の重力と摂氏4度で10分間遠心分離した後、1ミリリットルのトリオールを加えます。

上清を新しい反応チューブに移します。200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを数回反転させてから、室温で3分間インキュベートします。混合物を15分間遠心分離した後。

前回と同様に、上部水相を新しい反応チューブに移します。約2.5容量のエタノールを加えます。チューブを数回反転させ、マイナス80°Cで30分間インキュベートします。

次に、任意の沈殿物を含むサンプルをスピンカラムに移します。重力の8, 000倍で15秒間カラムを遠心分離し、流れを捨てます。抽出キットに付属の700マイクロリットルの洗浄バッファーRW oneをスピンカラムに加え、遠心分離機にかけます。

再度、フロースルーを廃棄した後、500マイクロリットルの第2の洗浄バッファー、キットによっても提供されるRPEをスピンカラムに加える。カラムを再度遠心分離し、フロースルーを廃棄してから、バッファーRPEを追加して遠心分離します。前と同様に、スピンカラムを新しい1.5ミリリットルの反応チューブに入れ、50マイクロリットルのRNAフリー水遠心分離機、8,000倍の重力で1分間のカラムを追加して溶出させます。

製造元の指示に従って、DNAフリーキットを使用して残留DNAを除去します。最後のステップとして、RNAの品質を決定します。RNAは、次世代シーケンシングのためにRNAを送信する前に、RNAインテグリティ数が8を超える必要があります。

HPLCプロファイルは、ncoa glauca葉抽出物のイソプレノイド分析の代表的な結果を示しています。C 40以上の異なるイソプレノイドは、フォトダイオードアレイ検出器を使用して検出されました。ピークには、コードクロマトグラフィーと真正標準間のスペクトル比較に基づいてアノテーションが付けられました。

2 つの MS クロマトグラムは、ncoa、グラウコの葉、および茎の材料からの主要な代謝物分析の結果です。セリンに対応するピークのMSスペクトルも示されており、例として、RNAの品質を決定するために使用されるバイオアナライザーの代表的な出力が示されています。クロマトグラムの 2 つの主要なピークは 18 s および 25 s リボソームに対応しており、このサンプルの RNA は無傷の RNA を示しています。

断片化されたリボソームRNAの追加のピークは、マスターされると部分的または重度に分解されたRNAの場合に現れます。この技術は迅速に実行することができ、この手順に従う他の代謝産物の分析と互換性があります。リアルタイムPCRなどの他の方法やRNAを分析する他の方法を使用して、低分子RNAの産生や特定の遺伝子の発現などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見た後、タバコの木から代謝物データを抽出して評価する方法について非常によく理解しているはずです。