共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

細胞内pHの測定にはいくつかの方法がありますが、細胞質と細胞小器官のpHを同時に測定できる方法はほとんどありません。ここでは、生細胞のレシオメトリックイメージングにより、細胞質と小胞のpHを同時に測定するための迅速かつ正確な方法論について詳しく説明します。

次の実験の全体的な目標は、共焦点顕微鏡法によって生細胞の小胞と細胞質のpHを同時に測定することです。これは、まず、エンドソームコンパートメントとリソソームコンパートメント、およびサイトゾルをそれぞれ標識するpHセンシングプローブHPTSおよびSNF F1で細胞をインキュベートすることによって達成されます。次に、細胞を環境制御されたチャンバーに共焦点顕微鏡で配置し、チャンバー内のプローブの蛍光を測定するようにソフトウェアを設定します。

細胞は、異なるpH較正溶液でインキュベートされます。pH標準曲線は、非線形回帰を使用して作成されます。指数方程式は両方のプローブで決定され、その後、サンプルの蛍光強度をpH値に変換するために使用されます。

この方法により、さまざまな処理後のサンプルから小胞および細胞質のpHを決定することができ、生物学的プロセス中の細胞内pHの調節の研究が可能になります。この技術の主な利点は、細胞内pH測定のための既存の方法よりも、私たちの方法が生細胞内の細胞内pHダイナミクスの測定を可能にすることです 人工物やバックグラウンドノイズを排除しながら イメージング中、手順を実証するのは、この方法を開発した博士課程の学生です 細胞pH校正用。pH 5.5から7.5までの50ミリリットル溶液を0.5刻みで5個連続で作製する必要があります。

通常の水酸化カリウムまたは塩酸を1つ追加して、pH値を設定します。次に、各pH較正溶液に0.05ミリリットルのIORゲルシンを加えます。10マイクロモルの最終濃度の10ミリモルで、リシンは、フードの下の細胞外カリウムの脱分極濃度の存在下で細胞膜透過性を増加させます フードシード細胞 10%のウシ胎児血清と抗生物質を含む2ミリリットルの培地で、摂氏37度でのインキュベーションの24時間で50%のコンフルエンスを達成することを目標

実験に必要なすべてのプレートを播種した後、キャリブレーション用にさらに5枚のプレートを播種します。これらのプレートを24時間、24時間後、およびイメージングの16時間前にインキュベートします。オルガネララベルHPTSを1モルで2マイクロリットル加え、翌朝、約3時間で溶液中の1ミリモルHPTSの最終濃度を得る。

イメージングする前に。PBSで2回の洗浄を行い、HPTSを取り外します。次に、2ミリリットルの無血清培地を加え、細胞をさらに少なくとも2時間インキュベートします。

イメージングの直前に、細胞を5マイクロモルのsnfでインキュベートし、1つは10マイクロリットルの1ミリモルsnfを添加し、1つはSNFの1インキュベーション期間の後です。細胞をPBSで2回洗浄し、2ミリリットルの無血清培地を加えてから、イメージングを進めます。細胞。

細胞のイメージングは、電動ステージと環境チャンバーを備えたスペクトル倒立型走査型共焦点顕微鏡で行う必要があります。プラスチック製のシャーレを使用する場合は、40倍の対物レンズが最適です。ソフトウェアは、ソフトウェア内の2つの仮想チャネルセットに合わせて調整し、励起波長と発光波長を調整する必要があります。

HPTSとSNF Oneの場合、共焦点絞りはデフォルトで175ミクロンに設定されており、最適な絞りは手動で300ミクロンに設定する必要があります。チャンバーが摂氏37度に温まったら、キャリブレーションを開始し、PBSを使用して細胞のプレートをさらに2回洗浄し、培地を最初のキャリブレーション溶液と交換します。次に、細胞をチャンバーにセットし、両方のpH感受性色素をキャリブレーションし、1分間隔で最大30枚のタイムラプス画像を取得します。

各画像スタックは、厚さ0.4ミクロン、800平方ピクセルで収集できます。また、画像間では、シャッターを閉じたままにするようにプログラムする必要があります。毎分、蛍光強度に注意してください、これは通常約20分で安定します。

蛍光が安定したら、15〜20個の細胞を含む4つまたは5つのフィールドと両方のプローブから画像を撮影します。これらの画像は、曲線の計算に使用されます。各キャリブレーション溶液についてこのプロセスを繰り返します。

次に、洗浄が不要な実験条件プレートのイメージングに進みます 各画像の解析では、まず、バックグラウンドの細胞外蛍光をデジタルで差し引きます。次に、バイナリマスクを使用して、保存された画像から標識された小胞とサイトゾルを選択します。各pHセンシングプローブについて、蛍光強度はゼロから4, 095までのスケールで測定されます。

オルガネラまたは細胞質内のすべてのピクセルの平均強度を計算します。これらの値を使用して、HPTS と snf の蛍光比を計算します。1つは検量線用で、各検量線で得られた蛍光比をpHの関数としてプロットし、検量線のフィッティングは指数方程式を使用して行う必要があります。

最後に、検量線を使用して比率をpH値に変換し、実験条件下で生細胞の細胞質および細胞小器官のpH値を取得します。HPTSは、Alexa 5 46標識トランスフェリンでコス染色してエンドソームを染色するか、蛍光性萎縮プローブで染色することにより、エンドソームコンパートメントとリソソームコンパートメントの両方を標識するという明確な証拠が得られました。Lyoトラッカー。

深紅のタイムラプス画像は、HT 10 80細胞に記載されているように、各プローブについて収集されました。5つの較正溶液は、所定のpHの検量線でpH 6およびpH 7.5溶液などの溶液で15分後に蛍光アプローチの安定性をテストした、データは、HPTSの558〜405ナノメートルまたはSNFの644〜584ナノメートルの蛍光強度の比を表している。両方の曲線には指数方程式が適合しました。

生HT 10 80におけるこの分析法の効率は、細胞内pHを上昇させる弱塩基である塩化アンモニウムを使用して評価しました。塩基は、サイトゾルと小胞の両方のpHを上昇させました。この方法は、Bマイシン、A、vaa a TPAsbamyの阻害剤、Aワンを使用しても評価され、エンドソームおよびリソソームコンパートメントの両方のアルカリ化が誘導されましたが、細胞質のpHは変化しませんでした。

最後に、NHEの阻害剤であるEIPAが試験されました。サイトゾルをpH6.62まで酸性化しましたが、pHには影響しませんでした。今までに。

細胞のpHホメオスタシスの研究は、細胞内で起こる急激なpH変化と、細胞内のpHを研究するためのツールの欠如の両方によって制限されてきました。今日は、単一生細胞の細胞質pHとエンドソームpHの両方を同時に測定するための簡単なステップバイステップのアプローチについて説明します。これは、突然変異や薬物がエンドソームコンパートメント内のプロトンの流入と流入に影響を与える可能性のある細胞の細胞pH恒常性の研究にとって特に重要です。