薄層クロマトグラフィー（TLC）分離および植物抽出物のバイオアッセイは、抗菌化合物を同定するために

本手順の目的は、嫌気性細菌に対して抗菌活性を持つ植物代謝物を特定することです。まず、植物抽出物を薄層クロマトグラフィー（TLC）で分離し、次に、クロマトグラムを1つ以上の化合物を含むゾーンに切り分けることでこれを達成します。

その後、これらのゾーンを嫌気性細菌を接種したアガー上に配置し、培養します。培養後、ゾーンを取り除き、プレートを染色して細菌の増殖を抑制する化合物を特定します。得られたデータにより、抗菌性植物メタボライトの有無が明らかになります。

この手法は、植物二次代謝物が特定の微生物による栄養素利用にどのような影響を与えるかなど、反芻動物の栄養学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法では、ルーメン細菌に対して抑制的に作用する植物化合物を明らかにできますが、他の細菌や真菌に対して抑制的に作用する化合物の特定にも適用可能です。

本プロトコルでは、レッドクローバー由来のフェノール化合物を使い、コンタクトバイオグラフィー法による抗菌化合物の同定を実演します。まず、ドラフトチャンバー内で薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートの洗浄を行います。TLC展開槽の底部およびTLCプレートの下端を十分に覆う量の洗浄溶媒を準備してください。

チャンバー内にセットするため、酢酸エチルとメタノールの2:1混合液を調製します。次に、手袋を着用し、ドラフトチャンバー内で作業を行います。ハサミを使用して、アルミまたはプラスチック支持のフレキシブルシリカプレートを展開槽に合うサイズに切り出します。

プレートの上端をチャンバーの壁に立てかけるようにして、プレートをチャンバー内に挿入します。この際、プレート同士が接触しないようにしてください。チャンバーに蓋をし、毛細管現象によって溶媒がプレートを上昇するようにします。

溶媒がプレートの上端まで到達したら、チャンバーからプレートを取り出し、溶媒が蒸発するまでドラフト内で立てた状態で保持します。プレートが乾いたら、TLCプレートの上端付近に不純物が移動していないか確認してください。不純物は、可視光下では黄色いバンドとして、また紫外線下では蛍光バンドとして現れます。

プレートの大部分にまだ黄色味がある場合は、同じTLCチャンバー内で同じ溶媒を用いて洗浄工程を繰り返します。TLCプレートをチャンバーから取り出した後、溶媒を廃棄してください。プロトコルの次のステップでチャンバーを使用する前に、残留溶媒を完全に蒸発させてください。

次に、シリカ上での化合物の移行に影響を及ぼす残留水分を除去するため、プレートを乾燥機に入れ、100 °Cで加熱します。加熱時間は、20 by 20 cmのプレートの場合は10〜15分、7 by 10 cmのプレートの場合は5分とし、プレートを直立させてください。プレートが乾燥したら、抽出物を負荷する前に室温まで冷却させます。抽出物分離用のチャンバーを準備するために、ハサミを使用して、フィルターペーパーをチャンバーの高さよりわずかに低く、幅がチャンバーの周囲の約半分になるように切り出します。

このペーパーは、溶媒をチャンバー壁面に吸い上げ、チャンバー内を溶媒で飽和させる芯の役割を果たし、分離の再現性を向上させます。ドラフト内で溶媒を混合してください。使用する溶媒は、酢酸エチルとメタノールの体積比4:1の混合液です。溶媒混合液をチャンバーに注ぎ、蓋をしてください。

鉛筆を使用して、展開槽内の展開溶媒の液面よりも上の位置に、TLCプレートの原点を軽く印してください。TLCプレートの吸着剤が柔らかく損傷しやすい場合は、ここに示すように端に印を付けます。次に、抽出物を十分な量の有機溶媒に溶解し、濁った懸濁液ではなく濃縮溶液の状態にします。

ここでは溶媒としてメタノールを使用します。キャピラリーマイクロピペットまたはマイクロリッターシリンジを使用して、プレートの両端に1 cmの余白を残しつつ、標準物質と試料を狭いバンド状にスポットします。プレートを扇ぐか、ドラフトチャンバー内で操作することで、バンドをより速く乾燥させることができます。バンドが乾燥した後、同じ箇所に再度試料をスポット（オーバースポット）します。

プレート上のサンプル濃度をより高くする必要がある場合は、TLCチャンバー内で必要に応じてこの操作を繰り返します。芯全体が溶媒で十分に飽和していることを確認してください。その後、ピンセットやトングを使用して、プレートをTLCチャンバー内に配置します。

プレートが芯に触れないようにしてください。チャンバーに蓋をし、溶媒前線がプレート上端に達する前に展開を終了させます。TLCタンクからプレートを取り出し、溶媒前線の高さを鉛筆でマークします。

プレートを乾燥させます。ドラフト内で、残りのTLCプレートを同じTLCチャンバーで展開します。このチャンバーは、蓋を閉めておけば通常1日中 사용할ことができます。プレートの乾燥後、チャンバー内の溶媒量が著しく減少している場合は、溶媒混合物を追加で調製してください。

可視光またはUV光の下でバンドを可視化します。ポータブルUVランプを備えた観察装置が便利であり、特にランプが254 nanometerの短波長UVと365 nanometerの長波長UVの両方で化合物を検出できる場合に有効です。鉛筆を使用してバンドの輪郭を描き、オーバーヘッドライト、UVライト、および／または可視光を備えたゲル写真記録システムを用いてプレートの画像を取得します。

最後に、バンドの特性評価を容易にするため、まず化合物の移動距離を測定し、次に溶媒の移動距離を測定して、前者を後者で除することで、保持係数（RF値）を算出します。バンドの位置をマークした後、プレートは後で使用するために保存することができます。バイオアッセイに使用してください。

プレートをプラスチックで包み、アルミホイルで覆います。プレートを-20 °Cで保存してください。シリカは中性ではないため、最大保存期間は化合物の安定性に依存します。

一部の化合物はTLCプレート上で分解する可能性があります。コンタクトバイオグラフィーアッセイの準備として、嫌気条件下で高アンモニア産生菌（HAB）またはHAB培地を調製し、接種します。本例で使用する菌株はClostridium sticklandii strain sr.です。

培養物を39 °Cで対数増殖期または定常期まで増殖させます。厭気性微生物を扱う際は、滅菌的な厭気操作を行ってください。0.75% w/vで調製します。

細菌の培養に使用したのと同じ培地の寒天を、60 °C未満まで冷却します。溶融した寒天に培養液を1% (v/v) 添加して穏やかに混ぜ、直ちに嫌気チャンバー内に移し、プラスチック製の15 × 100 mmペトリ皿に分注します。TLCプレートを、目的のバンドが含まれる領域で切り出します。

油性マジックを使用して、プレートの裏面に印を付けます。コントロールとして、未使用のTLCストリップをアガープレート上に配置します。次に、バンドの面を下にしてアガープレート上に配置します。

プレートを、ピンセットを用いて嫌気チャンバー内のインキュベーターに、寒天面を下にして39 °Cで24時間培養します。嫌気チャンバー内で、寒天プレートからTLCバンドを回収します。

テトラオレウムレッドをアガールプレートの表面に滴下します。色が発色するまで、少なくとも20分間待ちます。コントロールプレートが完全に赤くなったことを確認し、プレートを嫌気チャンバーから取り出します。

Clostridium stick Landiは嫌気性細菌であるため、嫌気チャンバーから出した直後から生存率が低下し始めますが、色は24時間以上にわたって安定しています。デジタルカメラを用いて、十分なコントラストが得られる背景の下、可視光でプレートを撮影してください。生細胞が染色されると、鮮やかな赤色に観察されます。

死細胞は染色されません。フェノール化合物を含有するレッドクローバー抽出物の代表的なシリカTLC分離図をここに示します。酢酸エチルとヘキサンの9:1混合溶媒を用い、8.5 cmで分離させた結果、5本のバンドが得られ、そのうち1本は原点から完全に分離していました。

ロードした標準物質はFormin Bio Canon AおよびGenineであった。このプレートの4つのバンドを、反芻動物由来の高アンモニア産生菌であるClostridium stick Landiの培養物に24時間適用し、ここに示す方法に従ってtetra oleum redで染色した。細菌を播種したアガー上で、バンド1のBio Canon Aおよびバンド2の一部であるfour Monon neinと共にインキュベートしたところ、明確な阻止円が認められた。

しかしながら、バンド2の残りとバンド3および4を共にインキュベートしても、細菌の増殖を抑制しませんでした。これらの結果は、bio Canon Aはsee stickland eyeの増殖を抑制したが、form aone Neinは抑制しなかったことを示しています。この手順を試みる際は、この手法に柔軟性があることを忘れないことが重要です。

適切な培地を選択し、本手順に従った分離化学および検出方法との適合性を確認するためのコントロールを含めるのであれば、他の試験微生物を使用することも可能です。バイオアッセイで同定された抗菌化合物の特性解析には、高速液体クロマトグラフィーや質量分析などの他の手法を併用できます。