Name: マウスの膀胱痛に対するモデルとしての膀胱膨満誘発内臓運動応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学ぶマウスの膀胱膨満誘発内臓運動応答モデルによる疼痛生理学研究。カテーテル挿入と電極配置を用いて間質性膀胱炎の神経機構を解明し、治療法開発に寄与する実験手法を習得できます。

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私たちは、博士に感謝し。このシステムを設定する際に有益な支援のためのロバートGereau、ヘンリー·ライ、そしてララ廃人。我々はまた、この仕事のための資金調達源に感謝し（BJK - スキャンで痛み早いキャリア研究助成の研究のための国際協会|インガー＆JENSブルーンとデュケイン大学Hunkele恐ろしい病気基金によるデザイン財団）。

次のプロトコルは、デュケーヌ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所からのガイドラインと一致しているされています。 無菌テクニックを用いたワイヤ電極と膀胱カテーテルの1。外科的移植（総時間5〜10分） <ol><li>以下の項目は、手術前の開始に準備する必要があります。 <ol><li>積極的にバッテリ駆動の加熱パッドおよび動物の体温プローブを用いて温度監視システムを使用して、C（材料リスト）体温の追加の制御のための低ワット数加熱ランプへの自動システムを接続して37.5±0.5℃の体温を監視し、調整する。 </li><li>イソフルラン麻酔のために必要な機器は、圧縮空気（ 例えば 100％O 2）、イソフルラン気化器、イソフルラン（初期ノックダウン）、イソフルラン誘導チャンバー、ノーズコーン、および排気システムを含む。 </li><li>目を組み立てるE適切な手術器具、IVカテーテル、電極（材料リスト） </li></ol></li><li> 2〜3％イソフルランで誘導チャンバーで麻酔状態を誘導。正向反射が失われたときにチャンバーからマウスを取り外します（0-1分）。 </li><li> 2から2.5パーセントイソフルランでノーズコーンにマウスを置きます。フル麻酔をチェックするためにつま先を挟ま。動物からの応答があってはならない。タイマーを開始する。 </li><li>マウスのそれぞれの眼に眼軟膏1滴を配置します。 </li><li>その背側を下にしている上にマウスをオンにします。 </li><li>尿道から膀胱にカテーテルを挿入します。 </li><li>カテーテルを潤滑する潤滑油の手術でカテーテルを浸します。 <ol><li>優しく動物の体に垂直に先の尖ったピンセットで尿道口を開催しています。鉗子の2 番目のセットでカテーテルを保持して、ゆっくりと動物の体に対して垂直な角度で尿道にカテーテル端部を挿入します。 </li><li>カテーテルを尿道に約1〜2ミリメートル行っているときに、それが今の体と平行になるように静かにカテーテルを調整頭に向かって目指しています。この動きは、恥骨を回避するために必要である。 </li><li>優しくマウスの体に向かってカテーテルを押してください。カテーテルがスムーズに抵抗なく、体腔内にスライドするはずです。カテーテルを強制しないでください。カテーテルがスムーズに入らない場合は、垂直にカテーテルの位置に戻り、再び起動してください。 </li><li>完全に膀胱内に挿入されたカテーテルを使用すると、静かに膀胱内容を排出するために、マウスの腹部を押し下げ。カテーテル開口部に、ペーパータオルの小片を押して、カテーテルからすべての尿を除去します。紙タオルを尿に浸している場合、交換してください。 （以下のプロトコル3を参照してください）​​。膀胱膨満実験中を含む残りのプロトコルを通して継続的に尿を削除する</li></ol></li><li> （グランドとして。）の左腹部の筋肉と胸に1銀線に2銀線を挿入する<ol><li>カテーテルの右側の領域の側方を消毒するアルコールやヨウ素を使用します（体の動物の左側） </li><li>左の腹筋を公開します。 <ol><li>ピンセットで左の腹筋に近い肌を保持する。メディア外科ハサミで小さな1〜2センチメートル切開を加えます。 </li><li>切開にはさみの先を差し込んで、静かに2センチメートルに切開を展開します。 </li><li>上斜腹筋を公開するために、上層筋膜を移動するために鉗子を使用してください。この領域に位置する主要な血管のいずれかをリッピング/切らないように注意してください。 </li></ol></li><li>半分に3銀線を曲げます。筋肉の小さな一口を取るために、鋭い21 G針を使用してください。その後、筋肉に針を押してください。筋肉中に挿入する際に任意の内臓を穿刺や筋肉への不必要な損傷を誘発しないように注意してください。 </li><li> 21 Gの針の開口部に1銀線の自由端を貼り付けます。優しく筋肉咬まれることで銀線を描画するために戻って筋肉に針を引っ張る。針は筋肉のない場合には、ワイヤのループがと同じ高さになるまで、ゆっくりと筋肉を通して銀線を引く筋肉の一口。 </li><li>の手順を繰り返し1.7.3-1.7.4二筋線用。このワイヤーは、最初の筋線から約0.5センチに配置する必要があります。これは、2つのワイヤが挿入後には触れないことが重要です。 </li><li>心より劣っ胸に三銀線（グランド）を挿入します。 <ol><li>皮膚の小さな一口を取る（それは切開するか、皮膚を剃る必要はありません）、皮膚に針をプッシュするために、鋭い21 G針を使用してください。 </li><li>上記のように銀ワイヤを挿入し、皮膚を介して引き出します。 </li></ol></li></ol></li><li>湿ったそれらを維持し、可能な限り公開される筋肉上の皮膚を引っ張って公開される筋肉の上に37.5℃で滅菌した鉱物油を少量入れます。 </li><li>その後の工程中に流体のレベルを維持するために生理食塩水を皮下0.5ミリリットルを注入。 </li><li>体温が容易に維持できるように、そっと側に動物をロールバックします。 </li></ol> 2。部分麻酔降圧手順（踏太L時間〜75分） 次の麻酔プロトコルは、デュケーヌ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所からのガイドラインと一致しているされています。 <ol><li>すぐにセクションの後に、私は（上記の）1.5％イソフルラン低く、完了です。 15分間のこのレベルで保持します。 </li><li>下イソフルラン動物が部分的に麻酔をかけられるように。 <ol><li>動物まで、15分ごとに0.125％低いイソフルランは、つま先のピンチに屈曲応答を示すが、発声または別の方法で移動することはない。 </li><li>一般的には、0.8から1.0パーセントイソフルランのレベルは、レベルによる麻酔のセットアップの違いにより異なりますが、最適である。麻酔が適切なレベルである場合に発声及び/または歩行は非常にまれな事象である。 </li></ol></li></ol> 。傾斜圧力（15〜75 mmHgの）（ - 実験に応じて可変合計時間）と膀胱膨満の間に3電図（EMG）記録<ol&gt; <li>セットアップ筋電図記録と膀胱拡張のため、以下の項目： <ol><li>セットアップ、アンプ、デジタイザ、および録音ソフトウェア。この設定では、デジタイザは（圧力と刺激マーカ入力、セクション3.1.2以下を参照）圧力調整器のためのアンプと2入力の1つの入力を持っています。正確なハードウェアおよびソフトウェアのセットアップが（具体的な手順のための材料のリストを参照）にカスタマイズ可能です。 </li><li>動物に空気圧の特定のバーストを送達するためのシステムセットアップ。このシステムは、以下のプロトコルの「時限圧力調整器」と呼ばれる。なお、空気圧のデジタル化、試験長の制御、試行間間隔オートメーション、試行回数の制御を含む自動化された圧力送達を可能にし、発症デジタル信号（時限圧力調整器の概略ために、Anderson ら 14を参照されたい）刺激。 </li></ol></li><li>アンプにマウス（2腹部ワイヤー+ 1アース線）からすべてのリード線を接続し、デジタイザデジタイザソフトウェアで記録EMG信号を開始する。デジタイザソフトウェアで選択されている時間が「書き込み」に注意してください。 </li><li>膀胱カテーテルから紙タオルを取り除きます。 （時限圧力調整器から。）エアチューブにカテーテルを接続</li><li> 60 mmHgのの膨満圧力で、単一の20秒のトライアルを提供します。 <ol><li> （アナログ血圧計を使用して圧力を確認してください。）60 mmHgのに流量調整弁を設定</li><li> 20秒圧力膨満パルスに続いて20秒の予圧間隔（これはデジタイザソフトウェアで記録された2Vの刺激信号となります）を提供するために、時限圧力調整器を設定します。 </li><li>トライアル（予圧間隔+圧力膨満トライアル）を開始します。実際の圧力試験が開始されると、システムに接続された3血圧計を使用して、圧力を再確認。 </li><li>圧力膨満トライアル中は、強いEMG信号（&gt; 0.5 V）が20秒膨満の間に、おそらく後に観察する必要があります。動物はabdomiを示すことができるNALの動きが、動物は発声、あるいは移動しないでください。まれですが、異常な動きや発声が認められた場合に、イソフルランレベルを上げる。 </li></ol></li><li> 1 番目の 60 mmHgでの膨満は、1〜2分の試行間間隔で適切なEMG信号は、手順3.4 2回以上生成する場合。 </li><li> 3 60 mmHgの試験から強い信号を受信すると、実験distentionsを行う。 <ol><li>多くの研究では、低圧（10〜15 mmHgの）から始まり、10〜15 mmHgの単位で有害な圧力（75〜80 mmHgの）までの作業段階的な膨満を使用しています。異なる圧力での例のトレースの下の代表的な結果を参照してください。 </li><li>典型的な試験は20秒の予圧間隔、20秒圧力膨満トライアル、1〜2分の試行間の間隔が含まれています。 </li><li>各圧力で3 distentionsを実行し、（各圧力のための単一の内臓運動応答を得るために）3試験全体の平均。別の方法、P IN各圧力で5膨満をerformハイとローの裁判を破棄し、残りの3つの応答を平均。 </li></ol></li><li>一回の実験膨満は、記録を停止する実験ファイルを保存して、承認された方法を用いて動物を犠牲に、完了している。 </li></ol>生のEMGトレースの4。分析<ol><li>内臓運動応答（ すなわち筋電図の記録）の分析を簡単にオンボードデジタイザソフトウェアを使用したり、サードパーティ製のプログラム（物質一覧）を介して行われている次の手順では、複数のプログラムを使用するか、手動分析を使用してこのデータを分析するために使用することができる一般的な手順である。 </li><li> EMGをエクスポートするには、デジタイザソフトウェアからの圧力、および刺激信号データは、次の手順を実行します。 <ol><li>実験ファイルを開きます。 </li><li> 「ファイル」「エクスポート]をクリックします。 &quot; </li><li>ファイルに名前をクリックし、「表計算テキスト（。TXT）」に、ファイルの種類を変更し、「保存します。 &quot; </li><li> PO中P·ウィンドウに出力サンプルレート変更「1000」を開始した瞬間にデータ収集を開始時間を変更しての終了時間変更」MAXTIME（）」を「タイムシフト出力をマークするボックスをオンにしますので、最初の行がある0.0秒」、および「OK」をクリックします。 </li><li>データは、現在、さまざまなプログラムで開くことができるテキストフ​​ァイルとしてエクスポートされます。ファイルには、4つの列（タイマ、VMR（EMG）、圧力、刺激）が含まれている必要があります。 </li></ol></li><li>試験した各実験動物については、以下の数学的演算を実行。 <ol><li>各時点の絶対値を計算することによってデータセット全体のためのEMG信号を整流する。 </li><li>実験の背景の項中の平均EMG応答を決定します。 </li><li>バックグラウンド補正されたデータセットを取得するための実験ではすべての整流のデータポイントからこの平均背景EMG応答を引きます。 </li><li>各20秒の予備の曲線下面積（AUC）を決定するバックグラウンド補正済みのデータセット内の圧力間隔。 </li><li>バックグラウンド補正されたデータセット内の各20秒間圧力膨満トライアルのAUCを決定します。 </li><li>実験全体から最低の予圧間隔AUCで（ステップ4.3.5で得られた）各圧力膨満トライアルAUCを分割する（ステップ4.3.4で得られた。）。これは、正規化された背景がそれぞれの完全な圧力膨満トライアルのAUCを補正する。 </li></ol></li><li>各実験動物の場合は、単一の圧力からの平均の複数の正規化された試験では、ボルトでの正規化されたVMR *秒（V·秒）を得た。 </li><li>実験計画に応じて、データを適切な統計を行う。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ヒトでは、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / BPS）の患者は、多くの場合、定期的な疼痛治療15に反応しない痛みを衰弱しているので、重要な臨床的問題である。理解し、最終的に慢性膀胱痛の治療の主要な課題の一つは、有害な膀胱拡張に応じて関与している正常な神経プロセスを理解することです。この課題を克服するために、膀胱痛の動物モデルが必要である。このモデルは、再現性のある安定した、かつ簡単に測定する必要があります。幸いなことに、ネスと同僚10は、有害な膀胱膨満に対する生理的反応を調査するために使用することができるシステムを開発しました。 システムのセットアップは簡単であり、主に市販のハードウェア及びソフトウェアを使用して行うことができる。 UBD VMR系に関与する機器の主要なカスタム作品は、時限圧力調整器です。このマシンは、アナログを提供しています空気圧のデジタル変換デジタイザハードウェアに刺激開始マーカーを送信する。時限圧力調整器の使用が大幅に自動的にVMRは、必ずしも膀胱が最初膨張している正確ときに開始せず、VMRはしばしば維持されるので...

慢性疼痛は、正式には約3カ月間、または正常組織の治癒時間1よりも長く持続する痛みとして定義されています。痛みのこのタイプの人は、医師の診察2を求めるように駆動される主な理由の一つであり、毎年36350億ドルドルまでの費用がかかる。古風な考えられている対処戦略、現在の慢性疼痛;医療の進歩、のNSAID（非ステロイド性抗炎症薬）およびオピオイドの数十年後に医師によって処方主な治療法はまだです。しかしこれらの治療法は、具体的にその正確な痛みの事件の原因に焦点を当てたとは対照的に、全身に鎮痛効果を提供し、同じように痛みのすべての異なる種類を対象としています。よりよい慢性疼痛で苦しむ人々を助けるために、研究上の注目は、慢性疼痛の最も一般的な原因に関連する病因と可能な痛みの特定の処理に向かってシフトする必要があります。このmanuscriの目標PTは、より良い間質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / BPS）として知られている状態を理解するために使用されるモデルを記述することである。 IC / BPSは40 4歳以上の、主に女性が、何百万人もの人々に影響を与える衰弱状態が知られている。IC / BPSの正確な原因は、しかし、有病率は、遺伝学5、具体的な食事療法、高応力レベル6にリンクされているされていません。 IC / BPSの症状が挙げられるが、これらに限定されないが、排尿に増加した緊急性、排尿頻度の増加、痛み、ピアス、または膀胱充填および排尿時に痛みを燃焼し、夜間頻尿7。これらの条件を経験した患者は、より高いストレスレベルを持っており、8より心配している。これは、元のストレスレベルを強化増加し、痛み、ストレスの結果増加した。研究では、うつ病や不安のレベルは、尿中の痛みを和らげる以下の処置、従って効果的にこの正のフィードバックサイクルを破壊を減少させることが示されている<sup&gt; 9。 IC / BPSのための新しい治療法を発見する際の課題の一つは、膀胱痛の基礎科学の理解が不足してきた。 条件神経系の寄与を検討するために、多くの動物モデルは、IC / BPSに関連する疼痛および症状を模倣するために開発されている。伝統的に、膀胱炎は、からし油、アセトン、リポ多糖、塩酸、膀胱にシクロホスファミドなどの様々な化学物質の導入により、動物で再作成されています。しかし、外来の薬剤は、したがって、これらのモデルの妥当性に疑問を、IC / BPS患者の無菌の尿中に存在しない。泌尿器痛みの別のマウスモデルは、膀胱膨満（UBD）10です。このモデルでは、特定の圧力の圧縮空気を、一定期間にわたってアウェイクまたは軽く麻酔した動物の膀胱に送達される。手順では、上斜腹筋の配線は、電気ACTIVを記録（電図（EMG）との）筋肉からITY。この活性は、内臓運動応答（VMR）として知られており、痛覚10の信頼性、再現性の尺度である。健康なヒトボランティアで同様の管腔臓器の膨満（ 例えば膀胱、直腸）は、不快感の気持ちと報告された痛み11,12の大幅な増加、多くの場合、IC / BPSを診断するために使用される特性を生成します。従って、刺激または阻害の電気薬理学的、およびoptogenetic方法と共に、UBDは、膀胱侵害受容および疼痛の両方末梢および中枢神経系の構成要素を理解するのに有用かつ有効なモデルである。 現在、一般的なマウス系統、C57BL/6Jの女性会員の中に我々の研究室で使用されているようにここでは、UBDための手順を説明します。男性のカテーテル法による処理が困難であるため、この手順は、主に、雌のマウスにおいて行われる。このプロトコルは、&lt;ネスによって開発されたものから適応されていEM&gt;ら10および以前の研究室13から出版した。 （1）膀胱カテーテルと記録電極の手術（2）部分的な麻酔導入（3）膀胱膨満とVMR記録、および生VMR / EMGトレースの（4）データ分析：次のプロトコルは、麻酔をかけた動物では、このモデルの4つの主要コンポーネントについて説明します。原因生物の選択、麻酔の深さと誘導し、体温にUBD-VMR手続きの微妙な違いを以下に説明します。

<table><tbody><tr><td>赤外線加熱ブランケットと監視システム</td><td>Kent Scientific</td><td>Right-Temp System&nbsp;</td><td>このシステムは、2つの別々の温度を監視するように設定されています。&nbsp;これには、動物と暖房用毛布を含める必要があります。&nbsp;また、設定温度を維持するために、システムが自動的に温度を調整することができます。ただし、この自動機能はEMG記録中に電気的干渉を引き起こすため、オフにする必要があります。&nbsp;Kentは、実験のriEMG記録部分で使用するための加熱パッド用のバッテリーパックを提供できます。</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>Draeger</td><td>Vapor 19.1</td><td>どのイソフルラン気化器でも機能しますが、0〜2%のイソフルランの間に複数のノッチがあるものがあると便利です。</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>複数の供給源</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>100% 酸素 エアタンク</td><td>複数の供給源</td><td>n/a</td><td>動物の換気用</td></tr><tr><td>空気呼吸グレード</td><td>複数の供給源</td><td>n/a</td><td>膀胱の膨張用</td></tr><tr><td>24 G 0.56 in IV カテーテル</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>381411</td><td>膀胱カテーテル法</td></tr><tr><td>用 サージルーブ(無菌)</td><td>サベージラボラトリーズ</td><td>0281-0205-02</td><td>どんな外科用グレードの潤滑剤でも問題なく動作します。</td></tr><tr><td>鉱油(無菌)</td><td>複数の供給源</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水(滅菌)</td><td>複数の供給源</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>AG8W銀線、2 m、0.20 mm(.008 in)D、L、絶縁体なし&nbsp;</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>W4 64-1318&nbsp;</td><td>これらの仕様の銀線であれば、どれでも機能します。&nbsp;</td></tr><tr><td>眼科用軟膏</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>小型手術用ハサミ</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>シャープな鉗子</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>21 G 針</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>グラスアンプ P511 3リード線入力ケーブル付き</td><td>グラスインスツルメンツ</td><td>P511 (F-P5IC3/REV1)</td><td>プロトコルで使用している「アンプ」です。次の設定のアンプ:キャリブレーター= 1 mV;低周波数 = 300 Hz;増幅= 20;高周波数= 10 kHz;ラインフィルタ = 入力</td></tr><tr><td>Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (または同等品)</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>1401 Plus</td><td>これは、プロトコルで使用される「デジタイザー」です。&nbsp;WINDAQや他の企業の他のデジタイザーシステムは問題なく動作します。圧力信号、EMG、および刺激信号の入力が必要です。</td></tr><tr><td>CED Spike2ソフトウェア</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike 2</td><td>これは、プロトコルで使用される「デジタイザーソフトウェア」です。&nbsp;デジタイザと同じメーカーのものである必要があります。&nbsp;プログラムは、圧力(0〜100 mmHgスケール)、EMG信号(通常は-5〜 + 5 Vの範囲)、および刺激マーカー(0〜2 V)の範囲の3つのチャネルで設定する必要があります。</td></tr><tr><td>エアタンクから膀胱カテーテルへのフローチャート</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>加圧エアタンクから動物の膀胱への接続順序:&nbsp;エアタンクから1/4インチチューブ、ギルモント流量計、yコネクタへ。&nbsp;yコネクタのブランチ1は血圧計に接続されています。&nbsp;分岐 2 を 4 方向ギャング バルブの 1 つの入力に 4 方向バルブから 4 方向バルブに出力し、時限圧力調整器から 3/32 チューブに、タイミング圧力調整器から 2 番目の y コネクタ (分岐 1 から血圧計へ) と分岐 2 から 3/32 チューブ&nbsp;3番目のYコネクタへ。&nbsp;分岐 1 の y コネクタは 3 番目の血圧計に、分岐 2 は動物の膀胱カテーテルに接続します。</td></tr><tr><td>ギルモント流量計&nbsp;</td><td>Gilmont</td><td>GF8321-1401</td><td>複数のブランドの流量計が機能します。&nbsp;膀胱膨張空気の場合、流量計は高圧を処理できる必要があります(このギルモントメーターなど)。&nbsp;呼吸用空気の場合、流量は100 ml / minまで調整可能である必要があります(一般的なマウス速度は500〜1,000 ml / min)。</td></tr><tr><td>4ウェイギャングバルブ</td><td>エリート</td><td></td><td>これは特定の機器です。&nbsp;エリートギャングバルブは、低空気圧の水槽用に設計されています。&nbsp;膀胱膨張のセットアップでは、このバルブは圧力が急上昇した場合の安全弁として機能します。&nbsp;タンクの初期電源投入時に圧力が高すぎると、時限圧力調整器および/または血圧計の圧力トランスデューサーが台無しになります。さらに、システムに少量の漏れを提供することにより、このバルブは10〜80 mmHgの間の圧力を調整するのを容易にします。&nbsp;</td></tr><tr><td>1/4インチ チューブ</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>3/32インチ チューブ</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>「Y」コネクタ (1/4 および 3/32 インチ)</td><td>複数のソース</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>血圧計</td><td>CVS</td><td></td><td>このアプリケーションには、ドラッグストアのアナログ血圧計が使用できます。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>時限圧力調整器</td><td>カスタム</td><td></td><td>空気圧のデジタル化、試行時間の制御、試行間隔の自動化、試行回数の制御、刺激開始デジタル信号を含む自動圧力供給を可能にするカスタムビルドの機械(ワシントン大学セントルイス機械工場)です。&nbsp;ただし、システムの基本コンポーネント(特定の試用期間中の圧力のオンとオフ)は、簡単なオン/オフインラインスイッチで制御できます。&nbsp;このようなアナログ制御の試験には、追加の分析パラメータが必要になります(プロトコル4を参照)。さらに、データ分析中にアナログ血圧計に基づいて手動で圧力を割り当てる必要があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>n/a</td><td>EMG信号の解析用。これらの実験では、データ解析にさまざまな種類のソフトウェアを使用できます。</td></tr></tbody></table>

マウスの膀胱痛に対するモデルとしての膀胱膨満誘発内臓運動応答

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

約3から8000000、米国の人々は、特に、膀胱充填時、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / BPS）、増加緊急性と周波数排尿のほか、夜間頻尿および一般的な骨盤痛が特徴衰弱状態に苦しむか、排尿。長年の研究にもかかわらず、IC / BPSの原因はとらえどころのないままで、治療戦略は、患者への完全な救済を提供することができない。条件神経系の寄与を検討するために、多くの動物モデルは、IC / BPSに関連する疼痛および症状を模倣するために開発されている。一つのこのようなマウスモデルは、膀胱膨満（UBD）です。このモデルでは、特定の圧力の圧縮空気を、一定期間にわたって軽く麻酔した動物の膀胱に送達される。手順では、上斜腹筋中のワイヤは筋肉からの電気的活動を記録します。この活動は、内臓運動応答（VMR）とIとして知られています痛覚のSA信頼性と再現性の尺度。ここでは、外科的な操作、生理的記録、およびデータ分析など、マウスでは、この手法を実行するために必要な手順について説明します。このモデルを用いることにより、一次感覚ニューロン、脊髄の二次求心性、および膀胱痛に関与上位中枢神経系領域の間の調整を解明することができます。この基本的な科学知識は、その後、臨床的にIC / BPSに罹患している患者を治療するために翻訳することができる。

全体的なUBD-VMRセットアップの図は、 図1Aに見ることができる。圧力の増加工程は、生VMR（ 即ち EMG）（ 図1B）デジタイザソフトウェアを用いて、記録の間に観察されるべき生VMR、圧力、および刺激マーカ信号は、 図2に見られるの増加を誘導する。に見られるトップチャンネル図2は （V IN）EMGトレースです。 EMGトレースのバックグラウンド信号は、安定的かつ低振幅（&lt;0.2 V）である必要があります。バックグラウンドが高い場合や散発大きなスパイク（&gt; 0.5 V）が含まれている場合、ワイヤ、増幅器の設定を調整する必要があるかもしれない。ホイルで（マウスからデジタイザ、増幅器、および/またはアンプへの）線を包むいくつかの状況では、いくつかのノイズを低減することができます。 mmHgの中の時限圧力調整器で定量した図2の中央のチャンネルは、圧力信号を示しています。信号発症が曲線であることに注意してください。これは完全な膨満ために発生...

米国では約3から8000000人が間質性膀胱炎/膀胱痛症候群（IC / BPS）、骨盤痛によって部分的に特徴づけられる衰弱状態に苦しんでいます。条件神経系の寄与を検討するために、膀胱痛の生理学的モデルは、マウスおよびラットにおいて使用される。

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

この手順の全体的な目的は、マウスにおいて有害な膀胱痛の生理学的モデルを確立することです。処置全体を通して、ヒートパッドと上部放射ヒーターを用いて体温を維持します。手術の最初のステップは、麻酔下にあるマウスの尿道にカテーテルを挿入することです。第2ステップは、切開を行い左腹筋を露出させることです。第3ステップは、21ゲージの針を用いて筋肉を採取することです。その後、曲げた銀線電極を針の中に挿入します。その後、針を筋肉から引き抜き、ワイヤーを筋肉内に留まらせます。この工程を2本目の銀ワイヤー電極に対しても繰り返します。第4のステップは、マウスの胸部に接地用ワイヤーを配置することです。手術が完了した後の第5ステップは、膀胱を拡張させ、EMG反応を記録することです。まず、3本の銀線電極をアンプとデジタイザーに接続し、内臓運動反応（VMR）を記録します。次に、膀胱カテーテルを時間圧力レギュレーターとエアタンクに接続し、15 mmHgごとの異なる圧力で膀胱を拡張させる特定の刺激を与えます。VMRは記録されません。しかし、30、45、60 mmHgにおいて、圧力が上昇するにつれてVMRは増加します。プロットすると、圧力の上昇に伴い、正規化されたVMRが段階的に増加していることがわかります。この手順は、内臓性膀胱痛の理解を深めるのに役立ちます。特に、尿路膀胱拡張モデルを用いることで、有害な内臓刺激という状況下における神経系全体を調査することが可能です。これには、末梢神経そのもの、脊髄の二次ニューロン、および脳幹や脳の高次ニューロンからの記録および調査が含まれます。さらに、ヒトの膀胱痛治療のための新規治療薬を、この膀胱痛の生理学的モデルを用いて試験することが可能です。2～3%のisof fluorineを含む導入チャンバーにマウスを入れ、麻酔状態を誘導します。右反射が消失した後、マウスを導入チャンバーから取り出します。2～2.5%のイソフルランを用いて、マウスをノーズコーンに入れます。次に、マウスの背側が下になるように反転させます。反転後、鉗子で足指を挟み、麻酔深度を確認してください。動物に反応がないことを確認します。次に、ピンセットで尿道口をマウスの体に対して垂直に軽く保持し、カテーテルの先端を尿道に挿入します。カテーテルをマウスの体と平行になるように下げ、ゆっくりとマウスの体内に挿入します。腹部を軽く押して、膀胱内の尿をすべて排出させます。これをペーパータオルで吸い取ります。腹部にアルコールを塗布し、患部を消毒します。滅菌領域に1〜2 cmの切開を加え、左腹筋を露出させます。はさみを使用して皮膚を広げ、筋膜を緩めて、外腹斜筋を露出させます。この画像では、腹筋が手術開口部の上方に、肋間筋が下方に位置しています。21ゲージの針を用いて、筋肉のごく少量を採取します。針を筋肉に貫通させてください。この際、血管を避けることが重要です。次に、銀線の端を針に通します。針を筋肉の中へ引き戻して銀線を筋肉内に導き、銀線が筋肉の噛み合わせ部分と面になるようにします。この工程を繰り返します。1本目のワイヤーから約0.5cm離れた位置に、2本目の銀線を植え込みます。次に、3本目の銀線を胸部に植え込みます。このワイヤーを接地（グランド）として使用します。露出した腹筋に温かいミネラルオイルを塗布し、湿潤状態を維持します。マウスを側臥位にし、安定した快適な姿勢に調整します。次に、電極クリップを銀線電極に接続します。ワイヤーが接触しないように3つのクリップを配置します。手術完了後、麻酔濃度を1.5%に下げます。次に、マウスが足指への屈曲反応を示すまで、15分ごとに麻酔濃度を0.125%ずつ下げてください。発声や歩行を伴わずにピンチを行います。膀胱カテーテルを、時間圧力レギュレーターに接続されたエアチューブに接続します。これにより、前圧力間隔、圧力拡張試験、および後圧力試験間間隔の時間を制御します。マウスの拡張反応をテストするため、60 mmHgで拡張を行います。0.5 Vを超える強力なEMG信号が確認されるはずです。これが確認できれば、さらに2回拡張を行い、反応を確認してください。適切な反応が見られない場合は、イソフルランの濃度を下げなければなりません。拡張試験中にマウスが鳴き声を上げたり、歩き始めたりした場合は、イソフルランの濃度を上げる必要があります。今回の例では、強いEMG反応が見られます。これは膀胱伸展に対する良好なbimo反応であると考えられ、イソフルラン濃度の変更は必要ありません。多くの研究では、15 mmHgなどの低圧から開始し、より有害な圧力まで段階的に上昇させる伸展法が用いられています。これでデータの収集が完了しました。処理および解析を行う必要があります。最初のステップは、各点の絶対値を取ることにより、データセット全体を整流することです。これはデータ解析ソフトウェアを使用することで最も簡単に実行できますが、手動で行うことも可能です。データの補正が完了したら、実験のバックグラウンドセクションにおける平均EMG応答を決定します。各データポイントからこのバックグラウンドEMG応答を差し引き、バックグラウンド補正後のデータセットを得ます。次に、加圧前区間の曲線下面積を算出し、続いて加圧拡張試行の曲線下面積を算出します。この工程を、すべての前圧間隔および圧力拡張試行について繰り返します。以下は、解析済みデータセットのスクリーンショットです。グラフは上から順に、未処理のEMG、圧力トランスデューサーで記録された圧力、刺激信号、そして最後に曲線下面積（AUC）グラフとなっています。この例では、最初の圧力拡張試験における非正規化VMRを決定するために、試験終了時の曲線下面積から試験開始時の曲線下面積を単純に差し引きます。最後に、各圧力拡張試験の曲線下面積を、測定された最小の圧力前間隔試験で正規化します。これは、各圧力拡張試験の値を最小の圧力前間隔試験の値で除することで行い、電圧×秒単位で正規化されたVMRを算出します。こちらは、15から75 mmHgの範囲での1セットの拡張における正規化されたVMRを示すグラフです。x軸の圧力が上昇するにつれて、y軸のVMRが段階的に増加していることがわかります。さらに、15から75 mmHgの範囲での3セットの段階的拡張にわたって、このマウスの全体的なVMRがセット間で一貫していることが確認できます。この手法の安定性により、数時間に及ぶ操作を行うことが可能です。最後に、膀胱拡張VMR処置中に体温を注意深くモニタリングすることの重要性について説明します。ここに示す一連のデータは、体温が37.5 °Cから33.5 °Cに低下すると、60 mmHgの膀胱拡張に対するVMRが有意に低下することを示しています。このビデオを視聴することで、内臓痛の尿路膀胱拡張モデルに使用する電極線および尿路膀胱カテーテルの外科的留置方法について十分に理解できたはずです。また、このアッセイによって生成されたデータの解析方法についても、より深く理解できたことでしょう。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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