Name: 低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学ぶ 低酸素条件下での新規RNA合成をクリックケミストリー標識と蛍光顕微鏡で単一細胞レベルで可視化・定量化する手法。細胞応答の異質性を解析する強力なツールです。

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JBは、ウェルカムトラスト博士課程の学生で、SRラボがCRUK主任研究フェローシップ（C99667/A12918）によって資金を供給されているされているように、CRUK臨床仲間です。この作品は、2ウェルカムトラスト戦略アワード（097945/B/11/Zと095931/Z/11/Z）によってサポートされていました。

1。細胞培養および治療<ol><li>培養ヒト骨肉腫（U2OS）細胞に、表1に挙げた試薬や機器を収集します。全ての試薬を調製し、無菌性を保証するために、層流フード内のすべての組織培養技術を実施</li><li>以下のように培養培地を準備し、10％（FCS）の最終濃度を達成するために、DMEM、50ミリリットルFCSを5mlのL-グルタミン、5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを追加し、2 mMの（L-グルタミン）、50 U / mlの（ペニシリン）および50 U / mlの（ストレプトマイシン）。水浴中で37℃で培養液を温める。 </li><li>治療用の細胞を準備します。 <ol><li> 70％エタノール中でいくつかのカバースリップを殺菌、乾燥空気と6台の3.5 10cmプレートの底に1を配置することができます。 </li><li> 2ミリリットル中のカバーガラスを、彼らはウェルの底に付着したままであることを確実にするためにカバースリップピンセットで押し下げ、完全DMEM（37℃）を温め浸す。 </li><li>それらの組織カルトからのU2OS細胞を切り離す4ミリリットルを印加3mlのPBSで一回洗浄することによりウレアプレートを0.05％トリプシン-EDTA（1％）を加温し、7分間37℃でインキュベートする。 </li><li> 6ミリリットルに再懸濁細胞を、トリプシン-EDTAを不活性化し、血球計数器を用いてカウントする完全DMEMを温めた。 </li><li> 1.3.1点で調製が3.5cmプレートの各プレートに2×10 5細胞。穏やかにさえ細胞分布を確実にするためにプレートを揺する。細胞が治療前に一晩を付着させる。 </li></ol></li><li>低酸素ワークステーションに4台の3.5 10cmプレートを配置することで細胞を処理し、通常の酸素条件下で、37℃のインキュベーター内で、他の2台の3.5 10cmプレートを残す。低酸素処理が終了する前に（低酸素処理された細胞のための低酸素室で）1時間処置した条件の下でRNA標識アッセイを開始する準備ができて。 </li><li> 1時間15分、1時間30分、2時間、および24時間低酸素状態に細胞​​を公開します。これらの時点は、柔軟でユーザーが決定している。 </li><li> normoを使う陽性対照および陰性対照として4時間アクチノマイシンD（10μg/ mlの最終濃度）で処理した正常酸素3.5センチメートル板としてXIC 3.5センチメートルプレート。アクチノマイシンDは、グローバルなRNA合成の阻害剤である。 </li></ol>注意： ヘキスト33342は、既知の変異原物質である。 DMSOは、組織への有機分子の進入を容易にすることが知られている。 NaOHが腐食性である。 HClが腐食性である。 ホルムアルデヒドは、すべての動物に非常に毒性であり、ヒトに死を引き起こす可能性があります。 TRITON X-100は、直接接触後の皮膚刺激を引き起こす可能性があります。 皮膚に接触したり飲み込んだときアクチノマイシンDは有毒である。 すべての有害化学物質を取り扱う場合は、適切な予防措置をとる。 2。クリックイットアッセイ<ol><li> - 7.6、PBS中の3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）、1％トリトンXリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2で：文脈イットアッセイキットに加えて必要とされている以下の試薬を収集PBS、脱イオン水（のdH 2 O）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、10 M水 ​​酸化ナトリウム（NaOH）、および37％塩酸（HCl）-100;オプション - pH指示薬ストリップ。 </li><li>次のようにクリックし、それを反応を行う前に、新鮮なPFA原液を準備します。 <ol><li> 1.85グラムのPFA、50ミリリットルファルコンチューブに3.5ミリリットルのdH 2 OとのNaOH OF10 10μLを入れてください。水浴を行い、ドラフト内でこれを放置する電子レンジで大きなビーカー中のH 2 Oを400ミリリットル- 300を沸かす。 </li><li>水浴中の50mlファルコンを置き、静かにPFAが溶解するまで定期的に蓋を解放する、10分間攪拌する。 </li><li> 37％の溶液が得られ、別の50mlのFalconチューブに0.2μmのフィルターを通してPFA溶液をシリンジ。 </li><li> PBSを追加することで、この10倍希釈し、濃塩​​酸12μL程度添加することにより、6.8にpHを。オプション：ヒュームフード内のインジケーターストリップで正しいpHを確認してください。 </li><li>すぐに使用したり、店舗O4℃でvernight </li></ol></li><li>以下のように、RNAイメージングキットのストック溶液を準備します。 <ol><li> EUの100 mMのストック溶液を得コンポーネントAに373μlののdH 2 Oを追加します。最長1ヶ月間-20℃で保存してください。 </li><li>コンポーネントB（アレクサフルーア594）に、DMSOの85μlを加え、ピペッティングまたはボルテックスで混和。最長1年間-20℃での両方を格納します。 </li><li> RNAイメージングキットの反応バッファー添加剤の10倍液を作成するために、コンポーネントEに2ミリリットルのdH 2 Oを追加します。最長1年間-20℃で保存、溶液が褐色を開発する際に廃棄します。 </li></ol></li><li> EUとの細胞の標識：温めておいた完全培地（37℃）のステップ2.3で作成100 mMストックから、EUの2倍使用液を準備し、低酸素で処理した細胞のための低酸素室でこのステップとステップ2.5の残りの部分を実行します 。 メディア CONTにこの2倍使用液を等量加えることで1Xに希釈する細胞をaining。処理細胞培養条件下で1時間インキュベートする。 </li><li>細胞固定：ウェルのPBSで一回ずつ洗浄し、処理条件の下で、上記のステップ2.2で作成3.7％PFAの株式の1ミリリットルを加える。処理条件の下で15分間インキュベートする。 低酸素状態で処理された試料は、この時点で、低酸素チャンバから除去することができる 。固定液を除去して（ 責任を持って、PFAの廃棄物を処分するように注意してください ）PBSで一回各ウェルを洗浄します。室温で次の手順を実行します。 </li><li>透過処理：洗浄溶液を除去し、各ウェルにPBS中の1％のTriton X-100の1ミリリットルを加える。室温で15分間インキュベートする。透過化緩衝液を除去し、PBSで一回各ウェルを洗浄します。 </li><li>標識されたRNA検出： <ol><li>のdH 2 Oで1:10（ステップ2.3で調製された）10倍液で希釈することにより、RNAイメージングキット反応緩衝添加物の新鮮な1Xワーキング溶液を調製します</li><li> RNAイメージングキットを調製調製直後の使用のため、表2に従った反応カクテル。 </li><li>洗浄溶液を除去し、各サンプルにRNAイメージングキットの反応カクテルを500μlを加える。室温で30分間インキュベートし、 光から保護します 。 </li><li> RNAイメージングキットの反応カクテルを削除し、RNAイメージングキット反応リンス液（成分F）の1ミリリットルで1回洗浄し、RNAイメージングキットの反応リンスバッファを削除します。 </li></ol></li><li>オプションのマルチプレックス反応：製造業者の推奨に従って、この時点で、サンプルの追加の抗体標識を実行します。 </li><li> DNA染色：PBSで洗浄サンプルはその後、洗浄溶液を除去。ヘキスト33342（成分G）PBS中で1:1,000に希釈します。各ウェルに希釈したヘキスト33342 1 mLを加え、室温で15分間インキュベートし、 光から保護する 。ヘキスト33342溶液を除去し、PBSで2回細胞を洗浄。洗浄solutioを削除Nおよび光学顕微鏡に進みます。 </li></ol> 3。光学顕微鏡<ol><li>マウントカバーガラス： <ol><li>標準的な顕微鏡スライドの中央に封入液10μlを置きます。 </li><li>封入剤の一定量をカバーするために顕微鏡スライドの中央に細胞側でカバースリップを下に置きます。これは、後続の画像収集を不明瞭になるように封入剤中の気泡の発生を回避するように注意してください。 </li><li>その周囲に明確なマニキュアを適用することにより、顕微鏡スライドにカバーガラスを貼り付けます。室温で5分間乾燥させます。 光から保護してください 。サンプルは、次の実装-20℃で保存してもよい。 </li></ol></li><li>画像取得：蛍光検出が可能な広視野顕微鏡を用いて画像を取得する。 DNAに結合したアレクサフルーア染料ヘキスト33342のおおよその蛍光/励起発光最大値を表3に示す。 </li><li>パフォーマンスm個のイメージング40X/1.30 NA油浸レンズを使用して、冷却したCCDカメラで画像を取り込む。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>従来OMEROクライアントにインポートする画像処理ソフトを用いてデコンボリューション画像（材料の表を参照）。他の全ての条件を制御正常酸素細胞からレンダリング設定を適用することによって、顕微鏡画像の可視化および解析ソフトウェアの同じ実験における全画像のレンダリングの設定を正規化する。 </li><li>各画像から核を選択するには（材料の表を参照）顕微鏡画像の可視化と解析ソフトウェアにおける関心領域（ROI）ツールを使用します。各ROIのための平均強度を取得し、30〜50細胞との間の番号を含む、強度解析オプションを選択すると、各条件の平均値と標準偏差を計算します。 </li><li>ステップ4.2トンで得られたすべての個々の平均強度値をプロットしたデータのグラフ作成ソフトウェア（材料表を参照）を使用して散布図を構築O各条件下で細胞間の変動を反映している。代替的に、平均強度の平均プラス新生RNAの標準偏差を表すための棒グラフを構成する。 </li></ol>

<ol><li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li>
<li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1%2C+PHD2%2C+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li>
<li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+%28FIH%29+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li>
<li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+under+low+oxygen%3A+holding+your+breath+for+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li>
<li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide-alkyne+coupling%3A+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+copper%28I%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li>
<li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis%3A+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+%22click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li>
</ol>

JRSはグレンコー·ソフトウェア株式会社、OMEROに貢献するオープンソースの米国を拠点とする営利企業の創設者である。

我々は、骨肉腫（U2OS）細胞におけるRNA合成に対する低酸素の効果を調べるためにRNA撮像キットの私達の使用を記載している。この技術は、比較的簡単であり、単一細胞レベルでの包括的な転写に関するデータを提供する。我々は、低酸素室でのラベリングを組み込むために、このキットのための従来のプロトコルを変更しました。我々の知る限り、これは低酸素状態でのRNA合成の変化を測定するこの技術の使用の最初の報告である。それは、放射性同位元素を必要とせず、制御された雰囲気のワークステーションでの作業の制限が技術的に互換性があるので、我々が使用するRNAイメージングキットは、低酸素状態での実験に適しています。この手法の問題、効率的な固定とサンプルのラベリングに関する一般的な問題。それは、PFAが新鮮で説明したように「クリック」反応を追跡の洗浄工程は、試料の低いバックグラウンド染色を確保するために実施されているサンプルを固定するために使用されることが非常に重要です。 Bの場合ackground蛍光は、ステップ2.7.4の後に1ミリリットルセンスRNAイメージングキットの反応リンス緩衝液で1回以上洗浄することをお勧めし問題となる。 ここでいうRNAイメージングキットは、使用および反応の特異性及び速度の容易さの観点からRNAイメージング技術の著しい進歩を表す。この技術は、主に、試料を標識するのにかかる時間によって制限される。 RNAイメージングキットは通常、この期間内に発生するグローバルRNAの急速な変化の検査を妨げる1時間の​​標識期間を必要とします。それは私たちの最初の時点で1時間と15分に制限されているのはこのためである。技術は、主に、たとえば、このRNAイメージングキットはファロイジン染色と互換性がありません、他の蛍光マーカーとの互換性を試薬に関連するいくつかの他の制限に関連している。 細胞内のRNA合成を研究するすべての既存のアプローチはに修飾されたヌクレオシドの取り込みに基づいている新生RNAと異なる手段によって援用標識の検出。先駆的なアプローチは、オートラジオグラフィーによる検出が続く放射性標識されたRNA前駆体を使用してに基づいていた。この方法は、細胞周期の段階および他の重要な知見の発見につながった。しかしながら、そのような放射能作業、長時間露光時間およびオートラジオグラフィー6の低解像度画像の面倒な性質の欠点の多くを有する。フィールド内の次の進歩は、放射能の必要性を排除するために免疫化学の手段を利用した。 RNAは、免疫化学検出が続くのBrUの取り込みにより標識した。しかしながら、効率的な抗体は、細胞形態の喪失を引き起こし、多くのタンパク質のエピトープを損傷し、蛍光標識抗体13とそれらのさらなる検出を防止DNAまたはRNAへのアクセスを向上させるために必要な核酸変性の結合。 「クリックケミストリー」技術の導入は、検出ステップとTを簡素化彼手続きオートラジオグラフィーおよび免疫化学と比較。技術は5-ethyniluridineの末端アルキンは、Cu（I）の存在下で蛍光団と接合し、アジと特異的に結合するアジド - アルキン付加環の環化反応に基づいています。反応は、急速に、固有のもので、追加の手順を必要とせず、他の細胞成分の免疫化学的検出と簡単に互換性があります。 このRNAイメージング技術を用いて、我々は、細胞は、同じ単層集団で、低酸素に応答して異なるRNA合成のレベルを有することを示した。我々は、RNAの生産のみの影響を調べるために我々の実験を制限し;しかし、RNA産生のより複雑な分析を可能に変更され、追加の多重反応を実行するには、このRNAイメージングキットで完全に可能です。例えば、リン酸化RNAポリメラーゼII又は換算は偶数成分のレベルとしての活性、転写のマーカーに特異的な抗体を用いた二次染色タンパク質に変換され、この新たに生成したRNAの量の指標を得たTiON機構が可能である。このようなアクチン、低酸素症によって大きく変化してはならないタンパク質などの追加のタンパク質は、追加のコントロールとしてテストすることができる。それは、異なるセルが異なるRNA合成速度および低酸素症にさえ異なる応答を有する可能性が非常に高いようにさらに、異なる細胞型は、テストすることができる。 このRNAイメージングキットの使用が記載されるようにステップが実行される設け非常に簡単である。プロトコルにおける重要なステップは、細胞播種、細胞の固定および染色および画像取得を伴う。それが大幅に結果に影響を与えるであろう実験で上や合流点の下に防ぐために説明した密度で細胞をプレートすることが重要です。これは、セルの最高の &quot;スナップショット&quot;を確保することがBACを低減するために取得され、細胞を洗浄したときに染色した後、世話をするために、新鮮な固定液を使用することも重要である効率的な解析のための許容可能なレベルまでkground。最後に、画像取得の方法は、その後の分析のために十分によい品質である画像を実現するために極めて重要である。私たちは、光学的にこのような世界的にほとんどの研究集約的なセンターで提供されています。このプロトコルで使用される顕微鏡などの試料を検査するために利用可能な最良の光学顕微鏡を使用することをお勧めします。

低酸素（低酸素圧）は、組織への通常の酸素供給が乱れた場合に発生します。環境酸素が多くの細胞型のための重要な手がかりを提供し、栄養素およびシグナル伝達分子の両方である。酸素環境の変化は、低酸素誘導因子（HIFS）として知られている必須の転写因子ファミリーの活性を制御するジオキシゲナーゼのグループによって感知される。 HIFSは2つのサブユニットαとβから構成されている。 3つの既知のHIF-αのアイソフォーム（1,2、および3）およびHIF-1βの多数のスプライスバリアントが存在する。 HIF-1βは、構成的に発現し、環境の酸素レベル1によって調節されない。 HIF-αファミリーのメンバーを動的にプロリル-ヒドロキシラーゼ（PHDは）および因子阻害HIF（FIH）のクラスによって制御されている。 HIF-αのヒドロキシル化2,3を触媒する補因子として酸素を必要とし、どちらも。酸素正常状態におけるHIF-αファミリーのメンバーは、ヒドロキシル化され、proteosomのためにタグ付けされたE3-リガーゼ、フォン·ヒッペル·リンドウ（VHL）アラバマ劣化。低酸素ではPHDはとFIHは非アクティブであるか、減少した活性を有する。 HIF-αアイソフォームは、安定するHIF-1βとヘテロダイマーを形成し、低酸素環境（ 図1A）に対する細胞応答を提供する遺伝子の転写をもたらす4。 RNA解析のための現在の技術は、所定の細胞集団全体の平均値の定量化に焦点を当てています。細胞は、彼らの厳しい環境5に適応することができ、遺伝子の無数の転写を開始することにより、低酸素刺激に応答します。しかし、低酸素症は、多くの場合、グラデーションのように存在し、低酸素環境下で細胞が均一な低酸素刺激を受けない。我々は、低酸素状態での単一細胞レベルでグローバルなRNA合成を調べるために、酸素制御ステーション内をクリックイットRNAイメージングキットの実装について説明します。 RNAイメージングキットは、αを使用してlkyne修飾ヌクレオシド、5 -エチニルウリジン（EU）、細胞および組織6に時間的かつ空間的にグローバルなRNA合成の検出を可能にする化学選択的ライゲーション。簡単に述べると、細胞を、EUの存在下で低酸素培養で処理される。次いで、それらを固定し、透過性にし、新生RNAへのEUの取り込みは、染料を含有するアジ化、EUの化学選択的連結反応によって検出されています。この反応のための一般的なワークフローは、 図1Bに示されている。我々は、低酸素状態での治療から生じた単一細胞レベルでのRNA合成を調べるためにRNA撮像キットを使用した。 アルキンタグのサイズが小さいので、特にRNAに修飾ヌクレオシドの効率的な取り込みを可能にします。化学選択的連結または「クリック」反応は非常に効率的、高速で7月10日 、特定のです。反応成分のすべては、生体不活性であり、反応は極端な温度または溶媒を必要としない。クリック反応は否定従来の放射性標識し、出力が軽いので、結果を直接可視化を可能にするための要件。また、検出分子が容易にRNA-インタラクティブタンパク質の検出のための抗体を含む多重分析を可能にする複雑なサンプルに浸透することができる。このRNAイメージングアッセイは、アレクサフルーアとフルオレセイン（FITC）を含む有機染料と互換性があります。 私たちは、リモートオブジェクトのオープン顕微鏡環境（OMERO）の実装を使用して我々の細胞の治療後のRNA合成の変化を測定した。 OMEROは、利用可能なオープンソースのソフトウェアです<a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> 。この顕微鏡画像の可視化と解析ソフトウェアへのアクセス、および多次元、異種のデータセットの管理を含む生物学的データ、広い範囲の使用を可能にします。クライアント·アプリケーションは、複雑な生物学的画像データ11の遠隔可視化および分析を可能にする;我々は、グローバルな単一細胞RNA合成の視覚的変化を定量化するためにそれを使用した。この顕微鏡画像の可視化および解析ソフトウェアを使用して、これらのデータは、我々のRNAイメージング実験を解析するために必要な手順を以下に示す。 私たちは、最大24時間のための低酸素症にヒト骨肉腫（U2OS）細胞の処理は、次のグローバルRNA合成の変化を見た。全ての条件では、RNA産生のレベルにおける細胞間の変動を検出した。低酸素暴露の短い時間は、細胞内の新生RNAのレベルに大幅な変更をもたらさなかった。しかしながら、低酸素状態の24時間の曝露は、細胞内で産生されるRNAの量の有意な増加をもたらした。低酸素に対する細胞応答の大部分は、例えば、4〜24時間である露光長期間、続いて測定される。しかし、いくつかの機構が、例えば、かなり早い場所に置かれる; NF-κB活性化は、低酸素曝露12の5〜15分以内に発生します。短いハイポを調査夏の露光時間が保証され、したがって、そのような細胞周期およびアポトーシスのようなより複雑な応答を損なう可能性がある。

<table><tbody><tr><td>U2OS初代細胞</td><td>ヨーロッパ細胞培養コレクション</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>DE17-603E</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td> ロン<td>ザ</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1%)</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>低酸素チャンバー</td><td>Ruskinn</td><td>InVivo2 300</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Core Microscope</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td>テキストでは画像処理ソフトウェアと呼ばれています。</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD カメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO)</td><td>OME</td><td>N/A</td><td>テキストでは顕微鏡画像の視覚化および分析ソフトウェアと呼ばれています。</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>Systatソフトウェア株式会社</td><td>N/A</td><td>本文ではデータグラフ作成ソフトウェアと呼ばれます。</td></tr></tbody></table>

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのrna合成の分析

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

低酸素または酸素利用の低下は、多くの生理学的および病理学的過程に関与している。分子レベルでは、細胞は、適切かつ協調的な細胞応答をマウントするために、特定の転写プログラムを開始する。細胞は、それらの活性のための補因子として分子状酸素を必要とする複数の酸素センサ酵素を有する。プロリル-ヒドロキシラーゼからヒストン脱メチル化酵素に対するこれらの範囲。低酸素に対する細胞応答を解析する研究の大部分は、細胞集団の平均的研究に基づいており、低酸素細胞のような単一細胞解析などめったに行われません。ここでは、顕微鏡分析および定量に続く酸素制御ワークステーション、クリック·イットRNAイメージング用キットを用いて、低酸素状態での単一細胞レベルでグローバルなRNA合成の分析の方法について説明します。異なる長さの時間、低酸素に曝露された癌細胞を用いて、RNAを、各セルに標識し、測定される。この分析はできます低酸素ストレス次のグローバルRNA合成における時間的および細胞間の変化の可視化。

RNAイメージングキットの反応の概略を、 図1Bに示されている。私たちは、定量的に、個々の（単セル）およびグローバルレベル（細胞の集団）の両方に低酸素で処理した後のU2OS細胞の総RNA合成を決定するために、この反応を使用していました。細胞が低酸素症とEUの存在下で培養して処理した。そして、彼らは、固定、膜透過し、EUの取り込みは、アジド含有する染料と、EUの化学選択的連結反応により検出されたされた。これは、検出された蛍光顕微鏡を用いて定量化することができる蛍光発光の反応結果を「クリック」。 図2Aは、この実験からの典型的な結果を示している。蛍光標識された細胞が赤く疑似カラーされ、画像は、リモートオブジェクト（OMERO）オープン顕微鏡環境で開かれている。この顕微鏡画像の可視化および分析ソフトウェアが内蔵しており、個々の細胞下構造を選択するために使用することができるROIツール量的トゥーレス、選択した領域内の画像強度を解析する。クライアントプログラムでは、このツールを使用する次のデータ出力の典型的な例は図2Bに見られる;個々のセル強度は、データの妥当性を確保するための視覚的なチェックとして機能した実験からの代表的な画像と一緒に表示されます。 個々の細胞の蛍光強度は、処理された細胞集団内の個々の細胞の強度の分布を示す散布図としてプロットすることができる。このタイプのグラフの一例が図2Cに見られる。それは治療結果の迅速な比較を可能にし、明らかに他の標準的なデータ表現を使用して隠される処置細胞集団内に有意な異質性を実証するため、この方法で強度データをプロットすると便利である。応答の不均一性は、この実験で興味深い均一な低酸素刺激であったがために細胞にpplied、同じ単層集団からのすべての細胞がこの刺激に対して異なる応答することが明らかである。 図2Dは ​​、我々の実験からの全体的な結果を示している。治療集団内のすべてのセルからの蛍光強度を平均し、この棒グラフにプロットした。スチューデントt検定は、対照と有意に異なる各処置群の統計的な確率を計算するために使用されている。興味深いことに、これらのデータは、U2OS細胞を1時間30分を超える時間で（低酸素状態で処理される経時的なグローバルRNA合成の統計的に有意な増加があることを示す*はp &lt;0.01、**はp &lt;0.05と***のp &lt;0.001およびN&gt; 30）。これらのデータは、低酸素症の治療の長い期間後、細胞はさらに、この敵対的な低酸素環境におけるRNAの生産に力をフォーカスすることを示している。アクチノマイシンD処理は、完全に予想されるように蛍光強度を切除する。<img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> 図1。A.ザ·HIFシステムは、細胞の酸素の変化に応答します。この簡略化した回路の低酸素にフォン·ヒッペルリンダウタンパク質（VHL）でプロリルヒドロキシラーゼ酵素（PHDの）とその後のpolyubquitinationによって、HIF-αのヒドロキシル化（-OH）を防止することにより、HIFのヘテロ二量体を安定化させる。セルラー低酸素に対する細胞応答を助ける無数の遺伝子の活性化におけるHIF安定化をもたらすB. RNA合成は、文脈-ITアッセイを用いて検出することができ;細胞は、クリック反応は蛍光強度と光学顕微鏡により定量することができるRNA合成を検出し処理した後に、EUが付されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">大きなVERSを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図のイオン。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> 図2。OMEROからA.スクリーンショットは、RNA標識後の典型的なミクロな出力が表示されます。この顕微鏡画像の可視化および解析ソフトウェアは、迅速に作り付けのROIマクロを使用して個々の細胞レベルでの強度データを抽出することができる。このコマンドの出力のスクリーンショットは、B.グローバルRNA合成において示されている個々の細胞の強度から推測することができ、これらの集約データの散布図C. A正式な表現で見ることができるの範囲は、D. *はp見ることができる&lt;0.01; ** P &lt;0.05、***はP &lt;0.001であり、n&gt; 30。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <tablE国境= &quot;0&quot; CELLPADDING = &quot;0&quot; CellSpacingの= &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> 細胞培養試薬 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2から7.6まで</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS）濾過滅菌</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td></tr><tr><td> 0.05％トリプシン-EDTA（1％） </td></tr><tr><td> 70％エタノール</td></tr><tr><td>アクチノマイシンD（1μgの/μLストック） </td></tr><tr><td> 細胞培養器材 </td></tr><tr><td>無菌パスツールピペット</td></tr><tr><td>培養中の細胞の維持および治療に適​​した細胞培養処理したプラスチック製品の範囲</td></tr><tr><td>水浴は37℃に設定</td></tr><tr><td>層流フード</td></tr><tr><td> 37℃、5％CO 2に設定したインキュベータ</td></tr><tr><td>低酸素ワークステーションは、37℃、5％CO 2、1％O 2に設定</td></tr><tr><td>カバーガラス</td></tr><tr><td>精密ピンセット</td></tr><tr><td>血球計</td></tr></tbody></table> 表1。U2OS細胞の培養に必要な試薬および器具。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> 反応成分 </td><td colspan="6"> カバースリップの数 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>クリックイットのRNA反応バッファー（成分C） </td><td> 428μL </td><td> 856μL </td><td> 1.7ミリリットル</td><td> 2.1ミリリットル</td><td> 2.58ミリリットル</td><td> 4.3ミリリットル</td></tr><tr><td> 硫酸銅（成分D） </td><td> 20μL </td><td> 40μL </td><td> 80μL </td><td> 100μL </td><td> 120μL </td><td> 200μL </td></tr><tr><td>アレクサフルーアアジド（ステップ2.3で製造） </td><td> 1.8μL </td><td> 3.7μL </td><td> 7.4μL </td><td> 9.3μL </td><td> 11.28μL </td><td> 18.8μL </td></tr><tr><td> （ステップ2.3で作成）をクリックし、それを反応バッファー添加剤</td><td> 50μL </td><td> 100μL </td><td> 200μL </td><td> 250μL </td><td> 300μL </td><td> 500μL </td></tr><tr><td>おおよその総容積</td><td> 500μL </td><td> 1ミリリットル</td><td> 2ミリリットル</td><td> 2.5ミリリットル</td><td> 1.5ミリリットル</td><td> 5ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表2 RNAイメージングキットの反応カクテル：染色されるカバースリップの数に従ってRNAイメージングキットの反応のためのマスターミックス成 ​​分の比率を詳細に参照するテーブル。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 蛍光色素分子 </td><td> 励起（NM） </td><td> エミッション（NM） </td></tr><tr><td>アレクサフルーア488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> DNAに結合し、ヘキスト33342、 </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> 表3蛍光/励起発光極大：アレクサフルーア色素およびDNAに結合し、ヘキスト33342のためのおおよその蛍光/励起発光最大。

我々は、イメージングを用いて低酸素症のグローバルRNA合成の分析のための手法を記載している。 RNAのクリック化学標識は、以前は、低酸素下で実施し、単一細胞レベルでのグローバルRNAの変化の視覚化を可能にされていない。このアプローチは、世界的なRNA合成における細胞間の変更の直接可視化を可能にし、既存の平均化されたRNAの技術を補完します。

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

この手順の全体的な目的は、定量的イメージング解析を用いて、処理条件下で生成された新生RNAを蛍光標識し、その量を定量することです。カバーガラス上に播種した培養細胞に、アルキン修飾塩基である5-エチニルウリジン（以下、5-EUと表記）を添加し、低酸素条件下でインキュベートします。インキュベーション中、細胞の転写機構を妨げることなく、RNA合成時に5-EUが取り込まれます。次に、取り込まれた5-EUを、銅触媒によるアジド・アルキン環化付加反応（クリック反応）を用いて蛍光ラベル化します。その後、蛍光ラベル化された新生RNAを蛍光顕微鏡で撮影し、得られた画像を解析することで、処理群と対照群の間で生成されたRNA量の比較を行います。得られたデータの統計解析により、5つのEU取り込みの定量化と蛍光顕微鏡による検出を通じて、低酸素状態に応答した新生RNA生成の変化が示されます。定量PCRなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単一細胞レベルで細胞内のRNA産生を直接可視化できることです。ここでは低酸素に対する細胞の応答を研究するためにこの手法を用いていますが、化学療法剤に対する応答の研究にも利用可能です。追加のストレス応答に対する反応の手順は、私の研究室の大学院生であるJohn Lestonが、同じく大学院生のish KovaおよびポストドクターのHumana Drukerの協力を得て実演します。最後に、Gus Fergusonが画像可視化ソフトの使用方法について実演します。まず、いくつかのカバーガラスを70% ethanolに浸して滅菌し、この実験を開始してください。組織培養フード内のプレートの端にカバーガラスを置き、層流下で自然乾燥させます。カバーガラスが乾いたら、6枚の3.5 centimeter ディッシュにそれぞれ1枚ずつ入れます。各ディッシュに、温めた完全DMEMを2 milliliters 加えます。ピンセットで軽く押し、各カバーガラスがウェルの底に密着していることを確認します。次に、組織培養皿からU2 OS細胞を剥離させるため、3 mLのPBSで1回洗浄します。その後、温めた0.05% trypsin、1% EDTAを4 mL加え、37 °Cで7分間インキュベートします。Resusの処理から7分後、細胞を6 mLの温めた完全DMEMに懸濁し、トリプシンEDTAを不活化させます。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、カバーガラスを入れた3.5 cmディッシュそれぞれに2×10⁵個の細胞を播種します。ディッシュを静かに揺らして細胞を均一に分散させ、37 °C、21% oxygen、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートし、細胞を接着させます。翌日、インキュベーターから5枚のディッシュを取り出します。残りの1枚はそのままにしておきます。これは常酸素状態のポジティブコントロールとして使用します。ディッシュを4枚、低酸素ワークステーションに入れます。細胞を75分、90分、2時間、および24時間の低酸素条件に曝露させます。もう一方のディッシュについては。培地にアクチノマイシン D を最終濃度 10 µg/mL となるように添加し、通常の酸素条件下で 37 °C のインキュベーターに 4 時間戻します。このディッシュは常酸素性陰性対照として機能します。細胞をインキュベートしている間に、クリック反応アッセイに備えて以下の試薬を調製し、準備してください。Click-itアッセイキット、pH 7.2～7.6のPBS、PBSに含まれる3.7%パラホルムアルデヒド、PBSに含まれる1%Triton X 100、脱イオン水、ジメチルスルホキシド、10 M水酸化ナトリウム、37%塩酸、およびpH指示紙を用意します。処理条件下でラベル化アッセイを開始できるよう準備してください。低酸素処理が終了する1時間前に、100 mMストック溶液を用いて、あらかじめ温めておいた完全培地で2倍濃度のEU作業溶液を調製し、細胞をラベル化します。次に、アクチノマイシンD処理した細胞を含むディッシュの培地に、2X EUと同量の培地を加え、EUを作業濃度まで希釈します。その後、低酸素チャンバー内で、低酸素処理した細胞にEUストックを添加します。低酸素処理後は処理細胞の培養条件下で1時間、コントロール群については4時間インキュベートします。各ディッシュをPBSで1回洗浄し、処理条件下で3.7% Paraformaldehydeストック溶液を1 mL加え、処理条件下で15分間インキュベートします。固定後、細胞を低酸素チャンバーから取り出し、ドラフトチャンバー内に移動させます。固定液を捨て、パラホルムアルデヒド廃棄物を適切に処理してください。次に、細胞をPBSで1回洗浄します。以降の手順は室温で実施し、すべての溶液は2〜6 °Cの氷上で保持してください。次に、細胞を透過させるため、洗浄液を除去し、各ウェルにPBSで調製した1% Triton X-100溶液を1 mL加え、室温で15分間インキュベートします。透過緩衝液を除去し、各ウェルをPBSで1回洗浄します。細胞から洗浄液を除去し、新鮮に調製したRNAイメージングキット反応カクテルを500 µLずつ各サンプルに添加します。細胞を遮光し、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、RNAイメージングキットの反応液、カクテル液、および洗浄液を除去します。RNAイメージングキットの反応バッファー 1 mL で1回すすぎます。追加の抗体ラベル付けを行う場合は、このタイミングで実施してください。DNAを染色するには、サンプルをPBSで洗浄し、次にHoechst 33342を1:1000に希釈します。PBS中で、希釈したHERC溶液を各ウェルに1 mLずつ加えます。遮光し、室温で15分間インキュベートします。インキュベート後、HERC溶液を除去し、細胞をPBSで2回洗浄してカバーガラスを封入します。標準的な顕微鏡スライドの中央に、封入剤を 10 µL 点滴します。カバーガラスの細胞側を下にして、封入剤の滴の上に載せます。気泡が生じると後の画像取得の妨げになるため、気泡が入らないように注意してください。カバーガラスの周囲に透明なネイル varnish を塗り、顕微鏡スライドに固定します。室温で 5 分間、varnish を乾燥させます。遮光したサンプルは -20 °C で保存可能です。封入後、蛍光検出が可能な広視野顕微鏡を用いて画像を撮影します。40倍 1.30 NA 油浸レンズを使用し、冷却CCDカメラで画像をキャプチャします。画像取得後、最低30個の細胞を解析対象とします。画像処理ソフトウェアを使用して、画像のデコンボリューション（deconvolution）を行ってください。これにより、キャプチャされた画像にソフトウェアベースの数式を適用し、光学的な歪みを補正します。その結果、より鮮明な画像が得られ、以降の解析が撮影された細胞のみに限定されることが保証されます。次に、画像をOmer Oクライアントにインポートします。同一実験内のすべての画像のレンダリング設定を正規化するため、取得したすべての画像のサムネイルが表示されます。解析ソフトウェアのROI（関心領域）ツールを使用して、コントロールの正常酸素細胞のレンダリング設定を他のすべての条件に適用します。ソフトウェアを用いて、各画像から核を選択します。強度解析オプションを選択し、30〜50個の細胞について、各ROIの平均強度を求めます。データを保存し、各条件の平均値と標準偏差を算出します。最後に、データグラフ作成ソフトを使用して、各条件下での細胞間の変動を反映させるため、すべての個々の平均強度値の散布図を作成します。強度データをこのようにプロットすることは、処理結果を迅速に比較でき、標準的なデータ表示では隠れてしまいがちな処理細胞集団内の顕著な不均一性を明確に示せるため有用です。あるいは、新生RNAの平均強度と標準偏差を表す棒グラフを作成し、U2 OS細胞における総RNA合成量を定量的に決定します。低酸素状態で処理し、5-エチニルウリジン（EU）存在下で培養したU2 OS細胞を用いて、処理および解析を行いました。このビデオで示したように、各処理集団内のすべての細胞からの蛍光強度を平均し、プロットしました。この棒グラフでは、スチューデントのt検定を用いて、各処理群がコントロールと有意に異なる統計的確率を算出しました。興味深いことに、これらのデータは、時間の経過とともに全般的なRNA合成が統計的に有意に増加することを示しています。予想通り、U2 OS細胞を1時間半以上にわたって低酸素処理し、続いてACTOmycin D処理を行うと、蛍光強度が完全に消失します。これらのデータは、長期間の低酸素処理後、細胞がこの過酷な低酸素環境下にあってもRNAの産生に注力していることを示唆しています。このビデオを視聴することで、低酸素および常酸素条件下における単一細胞レベルでの新生RNAの標識および定量方法について十分に理解できるはずです。この手順を習得すれば、本手法は2時間で完了させることができます。RNAポリメラーゼレベルが変動しているか、およびHIFが活性化しているかを確認するために、RNAポリメラーゼおよびHIFに対する抗体を用いた共染色のなどの他の手法を実施することも可能です。本手順の遂行中、ホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であることに留意してください。必ず手袋を着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。

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サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

学ぶ 低酸素条件下での新規RNA合成をクリックケミストリー標識と蛍光顕微鏡で単一細胞レベルで可視化・定量化する手法。細胞応答の異質性を解析する強力なツールです。

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

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