低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

この手順の全体的な目的は、定量的イメージング解析を用いて、処理条件下で生成された新生RNAを蛍光標識し、その量を定量することです。カバーガラス上に播種した培養細胞に、アルキン修飾塩基である5-エチニルウリジン（以下、5-EUと表記）を添加し、低酸素条件下でインキュベートします。

インキュベーション中、細胞の転写機構を妨げることなく、RNA合成時に5-EUが取り込まれます。次に、取り込まれた5-EUを、銅触媒によるアジド・アルキン環化付加反応（クリック反応）を用いて蛍光ラベル化します。その後、蛍光ラベル化された新生RNAを蛍光顕微鏡で撮影し、得られた画像を解析することで、処理群と対照群の間で生成されたRNA量の比較を行います。

得られたデータの統計解析により、5つのEU取り込みの定量化と蛍光顕微鏡による検出を通じて、低酸素状態に応答した新生RNA生成の変化が示されます。定量PCRなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単一細胞レベルで細胞内のRNA産生を直接可視化できることです。ここでは低酸素に対する細胞の応答を研究するためにこの手法を用いていますが、化学療法剤に対する応答の研究にも利用可能です。

追加のストレス応答に対する反応の手順は、私の研究室の大学院生であるJohn Lestonが、同じく大学院生のish KovaおよびポストドクターのHumana Drukerの協力を得て実演します。最後に、Gus Fergusonが画像可視化ソフトの使用方法について実演します。まず、いくつかのカバーガラスを70% ethanolに浸して滅菌し、この実験を開始してください。

組織培養フード内のプレートの端にカバーガラスを置き、層流下で自然乾燥させます。カバーガラスが乾いたら、6枚の3.5 centimeter ディッシュにそれぞれ1枚ずつ入れます。各ディッシュに、温めた完全DMEMを2 milliliters 加えます。

ピンセットで軽く押し、各カバーガラスがウェルの底に密着していることを確認します。次に、組織培養皿からU2 OS細胞を剥離させるため、3 mLのPBSで1回洗浄します。その後、温めた0.05% trypsin、1% EDTAを4 mL加え、37 °Cで7分間インキュベートします。

Resusの処理から7分後、細胞を6 mLの温めた完全DMEMに懸濁し、トリプシンEDTAを不活化させます。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、カバーガラスを入れた3.5 cmディッシュそれぞれに2×10⁵個の細胞を播種します。ディッシュを静かに揺らして細胞を均一に分散させ、37 °C、21% oxygen、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートし、細胞を接着させます。

翌日、インキュベーターから5枚のディッシュを取り出します。残りの1枚はそのままにしておきます。これは常酸素状態のポジティブコントロールとして使用します。

ディッシュを4枚、低酸素ワークステーションに入れます。細胞を75分、90分、2時間、および24時間の低酸素条件に曝露させます。もう一方のディッシュについては。

培地にアクチノマイシン D を最終濃度 10 µg/mL となるように添加し、通常の酸素条件下で 37 °C のインキュベーターに 4 時間戻します。このディッシュは常酸素性陰性対照として機能します。細胞をインキュベートしている間に、クリック反応アッセイに備えて以下の試薬を調製し、準備してください。

Click-itアッセイキット、pH 7.2～7.6のPBS、PBSに含まれる3.7%パラホルムアルデヒド、PBSに含まれる1%Triton X 100、脱イオン水、ジメチルスルホキシド、10 M水酸化ナトリウム、37%塩酸、およびpH指示紙を用意します。処理条件下でラベル化アッセイを開始できるよう準備してください。低酸素処理が終了する1時間前に、100 mMストック溶液を用いて、あらかじめ温めておいた完全培地で2倍濃度のEU作業溶液を調製し、細胞をラベル化します。

次に、アクチノマイシンD処理した細胞を含むディッシュの培地に、2X EUと同量の培地を加え、EUを作業濃度まで希釈します。その後、低酸素チャンバー内で、低酸素処理した細胞にEUストックを添加します。低酸素処理後は処理細胞の培養条件下で1時間、コントロール群については4時間インキュベートします。

各ディッシュをPBSで1回洗浄し、処理条件下で3.7% Paraformaldehydeストック溶液を1 mL加え、処理条件下で15分間インキュベートします。固定後、細胞を低酸素チャンバーから取り出し、ドラフトチャンバー内に移動させます。固定液を捨て、パラホルムアルデヒド廃棄物を適切に処理してください。

次に、細胞をPBSで1回洗浄します。以降の手順は室温で実施し、すべての溶液は2〜6 °Cの氷上で保持してください。次に、細胞を透過させるため、洗浄液を除去し、各ウェルにPBSで調製した1% Triton X-100溶液を1 mL加え、室温で15分間インキュベートします。

透過緩衝液を除去し、各ウェルをPBSで1回洗浄します。細胞から洗浄液を除去し、新鮮に調製したRNAイメージングキット反応カクテルを500 µLずつ各サンプルに添加します。細胞を遮光し、室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、RNAイメージングキットの反応液、カクテル液、および洗浄液を除去します。RNAイメージングキットの反応バッファー 1 mL で1回すすぎます。追加の抗体ラベル付けを行う場合は、このタイミングで実施してください。DNAを染色するには、サンプルをPBSで洗浄し、次にHoechst 33342を1:1000に希釈します。

PBS中で、希釈したHERC溶液を各ウェルに1 mLずつ加えます。遮光し、室温で15分間インキュベートします。インキュベート後、HERC溶液を除去し、細胞をPBSで2回洗浄してカバーガラスを封入します。

標準的な顕微鏡スライドの中央に、封入剤を 10 µL 点滴します。カバーガラスの細胞側を下にして、封入剤の滴の上に載せます。気泡が生じると後の画像取得の妨げになるため、気泡が入らないように注意してください。

カバーガラスの周囲に透明なネイル varnish を塗り、顕微鏡スライドに固定します。室温で 5 分間、varnish を乾燥させます。遮光したサンプルは -20 °C で保存可能です。

封入後、蛍光検出が可能な広視野顕微鏡を用いて画像を撮影します。40倍 1.30 NA 油浸レンズを使用し、冷却CCDカメラで画像をキャプチャします。画像取得後、最低30個の細胞を解析対象とします。

画像処理ソフトウェアを使用して、画像のデコンボリューション（deconvolution）を行ってください。これにより、キャプチャされた画像にソフトウェアベースの数式を適用し、光学的な歪みを補正します。その結果、より鮮明な画像が得られ、以降の解析が撮影された細胞のみに限定されることが保証されます。

次に、画像をOmer Oクライアントにインポートします。同一実験内のすべての画像のレンダリング設定を正規化するため、取得したすべての画像のサムネイルが表示されます。解析ソフトウェアのROI（関心領域）ツールを使用して、コントロールの正常酸素細胞のレンダリング設定を他のすべての条件に適用します。

ソフトウェアを用いて、各画像から核を選択します。強度解析オプションを選択し、30〜50個の細胞について、各ROIの平均強度を求めます。データを保存し、各条件の平均値と標準偏差を算出します。

最後に、データグラフ作成ソフトを使用して、各条件下での細胞間の変動を反映させるため、すべての個々の平均強度値の散布図を作成します。強度データをこのようにプロットすることは、処理結果を迅速に比較でき、標準的なデータ表示では隠れてしまいがちな処理細胞集団内の顕著な不均一性を明確に示せるため有用です。あるいは、新生RNAの平均強度と標準偏差を表す棒グラフを作成し、U2 OS細胞における総RNA合成量を定量的に決定します。低酸素状態で処理し、5-エチニルウリジン（EU）存在下で培養したU2 OS細胞を用いて、処理および解析を行いました。

このビデオで示したように、各処理集団内のすべての細胞からの蛍光強度を平均し、プロットしました。この棒グラフでは、スチューデントのt検定を用いて、各処理群がコントロールと有意に異なる統計的確率を算出しました。興味深いことに、これらのデータは、時間の経過とともに全般的なRNA合成が統計的に有意に増加することを示しています。

予想通り、U2 OS細胞を1時間半以上にわたって低酸素処理し、続いてACTOmycin D処理を行うと、蛍光強度が完全に消失します。これらのデータは、長期間の低酸素処理後、細胞がこの過酷な低酸素環境下にあってもRNAの産生に注力していることを示唆しています。このビデオを視聴することで、低酸素および常酸素条件下における単一細胞レベルでの新生RNAの標識および定量方法について十分に理解できるはずです。この手順を習得すれば、本手法は2時間で完了させることができます。

RNAポリメラーゼレベルが変動しているか、およびHIFが活性化しているかを確認するために、RNAポリメラーゼおよびHIFに対する抗体を用いた共染色のなどの他の手法を実施することも可能です。本手順の遂行中、ホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であることに留意してください。必ず手袋を着用し、ドラフトチャンバー内で作業してください。