生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデルインビボ

この手順の全体的な目標は、組織工学的構築物内の血管を視覚化することです。これは、マウスの背中に標準化された完全な皮膚の欠陥を作成することによって達成されます。次に、組織工学材料のサンプルを皮膚欠損部に移植します。

その後、観察時間の終わりに、材料を埋め込み、トランス照明装置に入れます。最後に、血管網の高解像度写真を標準のデジタルカメラで取得します。最終的に、容器ネットワークは、Vest eggツールソフトウェアを使用したデジタルセグメンテーションと定量化によって分析されます。

この手法は、顕微鏡法、コンピューター断層撮影法、磁気共鳴画像法などの既存の方法に比べて、すべての新しい機能血管に焦点を当てて、生体材料内の血管プロセスの時間と原因を効果的に視覚化および定量化できるという点が主な点です。この方法は、真皮置換材料の血管新生に関する洞察を提供します。また、他のモデル生物に適用したり、他の臓器の血管新生を研究するために適用することもできます。

まず、12ミリメートルの生検パンチを使用して、ウシなどの足場のサンプルを生成し、コラーゲンベースの皮膚置換材料を直径14ミリメートルの丸いテチンメッシュピースにカットして各足場の下に配置します。マウスに麻酔をかけた後、つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、テキストプロトコルに従って背中の毛皮を取り除きます。動物を腹臥位に置き、細い先端のパーマネントペンを使用してマウスの背中の正中線に印を付けます。

動物が足場を取り外すのを防ぐために、大きすぎない切除領域を定義します。10ミリメートルの生検パンチを使用して、パンチを皮膚に慎重に押し付けて、丸い両側の欠陥を作成します。鉗子で切除領域を描写するには、マークされた皮膚をそっと持ち上げ、手術用ハサミを使用してマークされた円に沿って切開します。

出血が発生した場合は、滅菌ガーゼを使用して領域を慎重に圧縮し、タイタニック号のメッシュ用のスペースを確保します。創傷の境界で皮膚とその下にある組織の分離をさらに2〜4ミリメートル延長します。メッシュを創傷床の欠陥に直接配置し、創傷縁の下に配置します。

次に、スキャフォールドをメッシュの真上に配置します。4〜6個のシングルノットを使用して足場を縫合し、隣接する創傷の端が足場の少し上に離れるようにします。次に、欠損部の上に透明な創傷被覆材を縫合して、足場を保護しながら創傷領域を監視できるようにします。

運動活動、体重、痛みの兆候、ドレッシングへの耐性、および自動切断を監視することにより、動物の一般的な状態を毎日評価し、評価します。また、創傷領域の出血、局所的および全身的な感染の兆候、およびドレッシングの位置を監視します。希望の時点で動物を安楽死させた後。

テキストプロトコルに従って、足場を含む切除部位をマークするために油性マーカーを使用します。はさみまたはメスを使用して、鈍い切除によってマークされた線に沿って皮膚を切開し、足場とメッシュを含む皮膚全体を下にある組織から切り離し、逆さまに伸ばした組織をペトリ皿に入れます。サンプルを可視化するには、サンプルをトランス照明装置の上に置きます。

マクロモードでは、完全な足場と正常な皮膚の同じサイズの領域の写真を撮り、画像をTIFF形式で保存して、さらにデジタル分析します。ves EQツールソフトウェアをダウンロードした後、画像を開き、バックスペースキーを押して分析する関心領域を選択します。次に、invertを押します。

血管ネットワークを白で視覚化するには、画像、血管増強、フィルター、ヒステリシス、しきい値、トップハット変換を選択し、前のすべてのステップで血管増強を計算します。スクロールして画像をズームインおよびズームアウトします。最初のしきい値または船舶カバレッジを選択して船舶マップをセグメント化し、遠隔地から船舶のようなピクセルであっても船舶としてラベル付け

[計算]を押します。選択内容をプレビューするには、2 番目のしきい値または背景カバレッジを選択して、特にベッセルのようなピクセルのみがベッセルとしてラベル付けされるようにします。船舶の長さとそれらがカバーする全体的な面積を計算するには、画像、画像統計、およびバイナリ画像統計をクリックします。

血管の長さは、血管ネットワークを事前に 1 ピクセル幅に薄くすることで最適に推定できます。このためには、計算の前に画像形態学的フィルターとスケルトン化に進みます。船舶の面積と船舶の長さの比率は、関心領域の船舶サイズの値を示します。

必要に応じて、目的の容器のみを選択してアーティファクトを排除します。選択モードの下をクリックして、Backspaceキーを押して、選択した容器を新しい画像にコピーします。最後に、スキャフォールドと同じパラメーターでネイティブの皮膚領域を分析し、ネイティブ組織に100%の値を割り当て、スキャフォールドをその値に関連付けます。

たとえば、白色ピクセルの割合が正常組織で 30%、スキャフォールドで 15% の場合、これはスキャフォールドの全領域の 50% の血管新生を表します。値は画像領域全体に対応していることに注意してください。そのため、ここに示すように選択した領域の領域に修正する必要があります。

組織移植の2週間後、トランス照明により、天然組織と移植された足場の両方を含む全組織サンプルで、幅30マイクロメートルまでの血管構造を鮮明に視覚化することができました。デジタルセグメンテーションを使用して、外植された組織の血管新生レベルを分析すると、ネイティブの皮膚と比較して、足場で62.28±8.6%が観察されました。この手順を試みる際には、再現可能な完全な皮膚の欠陥を作成し、生体材料を傷口に確実に固定することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、拡張した組織を組織学やRNAおよびタンパク質発現などのさらなる分析に使用できます。