生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

次の実験の全体的な目標は、2つのタンパク質と生きた培養細胞との間の相互作用を観察することです。これは、目的の2つのタンパク質のCDNAを、ルシフェラーゼまたは黄色蛍光タンパク質(YFPと略される)のコーティング配列を含むプラスミドにサブクローニングして、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現のベクターを作成することによって達成されます。第2のステップとして、プラスミドを培養細胞にトランスフェクションし、YFPおよびルシフェラーゼ融合タンパク質の発現につながります。

次に、ルシフェラーゼからの発光を開始するために、ルシフェラーゼ基質を細胞に添加します。ルシフェラーゼからYFPへのエネルギー移動に基づく2つの融合タンパク質間の相互作用を示す結果が得られました。この手法がカウン沈殿法などの既存の方法よりも優れている点は、生きた細胞でタンパク質タンパク質の相互作用を観察できることです。

この方法は、患者に見つかった突然変異がタンパク質タンパク質の相互作用に影響を与えるかどうかを判断することにより、機能ゲノミクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。手順の最初のステップを示すのは、私の研究室の博士課程の学生であるRAB tricです テキストプロトコルに記載されているようにプラスミドを作成します。260ナノメートルの吸光度に基づいてそれらの濃度を推定します。

各プラスミドの分子量は、塩基対の数に650.Daltonsを掛けて求めます。濃度と分子量を使用して、各プラスミド調製物のモル濃度を計算します。プラスミドDNA調製物を36ナノモルの濃度に希釈します。

これらは、DNAミックスを調製するために使用されるワーキングストックになります。トランスフェクション用。この手順の最も難しい側面は、DNAミックスの設定です 成功を確実にするために、各コンポーネントの正しい量を事前に計算するためのスプレッドシートを作成し、細心の注意を払います。

DNミックスの設定にあたって。最終容量の20マイクロリットルの水に1800ナノグラムのフィラープラスミドを含む最初のコントロールDNAミックスを調製します。次に、5マイクロリットルのP lookコントロールコンストラクトを調製することにより、第2の制御DNAミックスを調製する。

フィラープラスミドを添加して、総DNA質量を1800ナノグラムにします。水を加えて、最終的な容量を20マイクロリットルにします。5マイクロリットルのPルックコントロールコンストラクトと5マイクロリットルのPYFPコントロールコンストラクトを含む第3のコントロールDNAミックスを調製する。

前回と同様にフィラープラスミドと水を加えます。最後に、5マイクロリットルのポジティブコントロールコンストラクトを含む第4のコントロールDNAミックスをセットする。再度、同じ方法でフィラー、プラスミド、水を加えます。

次に、目的のタンパク質xのホモ二量体化をテストするための3D NAミックスを準備します。各DNAミックスについて、関連するP lookコンストラクトの5マイクロリットルとPYFPコンストラクトのマイクロリットル5マイクロリットルを組み合わせ、フィラープラスミドと水を加えます。次に、関心のあるタンパク質のペアXとY.For each DNAミックスの間の相互作用をテストするためにDNAミックスを準備します、関連するPルックコンストラクトの5マイクロリットルとPYFPコンストラクトの5マイクロリットルをフィラープラスミドと水収穫サブコンフルエントHEC 2 9 3細胞と組み合わせて、75平方センチメートルのフラスコから全細胞の10%を13ミリリットルの培養培地に希釈します。

次に、細胞を24時間培養する前に、白色の透明な底の96ウェル組織培養プレートの各ウェルに130マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。次に、DNAミックスの数に3を掛けて、トランスフェクションするウェルの数を計算します。ボルテックスで混合したウェルあたり6.3マイクロリットルの室温、無血清培地、および0.18マイクロリットルのトランスフェクション試薬を含むマスターミックスを調製し、室温で5分間インキュベートします。

次に、20マイクロリットルの無血清培地トランスフェクション試薬マスターミックスを必要な数のチューブに分注しました。対応するDNAミックスを2マイクロリットルずつ各チューブに加え、室温で10分間インキュベートします。最後に、各トランスフェクションミックスで3つのウェルをトランスフェクションします。

ウェルあたり6.5マイクロリットルのトランスフェクションミックスを分注してから、細胞をさらに36〜48時間培養します。BRET信号を測定するため。まず、生細胞ルシフェラーゼ基質をDMSOに34ミリグラム/ミリリットルでボルテックスにより溶解します。

再構成した生細胞ルシフェラーゼ基質を、摂氏37度に予温した基質希釈培地で1〜1000で希釈します。ウェルボルテックスあたり50マイクロリットルの基質希釈媒体を混合します。沈殿物が形成されることがありますが、アッセイに干渉することはありません。

96ウェルプレートから培地を吸引し、細胞を少なくとも2時間培養した後、希釈した生細胞ルシフェラーゼ基質50マイクロリットルを各ウェルに分注します。96ウェルプレートから蓋を取り外し、プレートをルミノメーター内で室温で10分間インキュベートします。LUCIFERASEとYFPからの放出を、テキストプロトコルの詳細に従って一度に1ウェルずつ測定し、10秒かけて放出信号を積分します。

転写抑制因子のFox Pファミリーのメンバーは、脳の発達に役割を果たします。突然変異は、言語障害や自閉症スペクトラム障害に関与しています。FOX P 2は、Foxの検出のためのBrettアッセイを検証するためにホモ二量体を形成することが知られています。

P 2 Homodimers細胞に、ドナーとしてのルシフェラーゼの発現のためのコンストラクトを、またはアクセプターとしてのYFPをトランスフェクションして、Fox P 2または核局在シグナルのいずれかに融合させた。核を標的とするルシフェラーゼタンパク質とYFPタンパク質は、ブレットの検出に対するポジティブコントロールとしてネガティブコントロールとして機能します。シグナル細胞は、ルシフェラーゼYFP融合タンパク質の発現のためのコンストラクトでもトランスフェクションされました。

BRETシグナルの増加は、BRETアッセイがFox P 2ホモダイマーの蛍光顕微鏡画像を検出するのに有効であることを示しています。ここには、核局在化シグナルに融合したYFPをトランスフェクトした細胞、またはFOX Pに融合したYFPをトランスフェクトした細胞の画像が示されています。この相互作用の特異性は、二量体化を阻害することが知られているFOX P twoに変異を導入することで実証されました。ルシフェラーゼFox P 2デルタE400とYFP Fox B2融合タンパク質を共発現させたところ、

Fox B 2とYFP Fox B 2を共発現した場合と比較して、呼吸信号の減少が観察されました。このシグナルの減少は、典型的な相互作用の検出におけるBretアッセイの有効性を評価するための変異タンパク質の細胞内局在の変化によるものではなく、Fox P twoとFox P oneとの相互作用を試験し、アッセイの両方の可能な構成でBretシグナルを観察した。さらに、ブレットアッセイの適合性、またはFox P 2と非FOX Pタンパク質との相互作用の検出は、転写共抑制因子であり、既知のFox P 2相互作用パートナーであるCT BP oneとの相互作用を調べることによって試験されました。

Fox P 2 CT BP 1 の相互作用は、Fox P 2 がドナー融合タンパク質で CT P 1 がアクセプターである場合に Brett アッセイによって検出されましたが、逆の配置では検出されませんでした。FOX P 2とCT P 1との間の相互作用は、CT BP 1のごく一部のみが核に局在していたにもかかわらず観察され、このアッセイの感度を強調しています。最後に、Bretアッセイを使用して、Fox P 2の病原性突然変異がタンパク質タンパク質相互作用に及ぼす影響を調べました。

Fox P の 2 つの点変異 2 つは、言語と言語に影響を与えるまれな常染色体優性障害を引き起こすと報告されています。変異タンパク質が野生型キツネP 2と二量体化する能力を、BRETアッセイを用いて評価した。R 3 28 Xは、R 5 53 H変異ではなく、野生型Fox B 2をドナーとして、変異Fox B 2をドナーとして使用した結果の二量体化を妨害します。

アクセプタが示されているように、逆の構成でも同じ結果が観察されました。このビデオを見れば、パンアッセイを適用してタンパク質タンパク質の相互作用をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。この技術は、細胞生物学の分野の研究者が生細胞におけるタンパク質間相互作用を探求する道を開きました。

この手順に続いて、観察されたタンパク質タンパク質相互作用の機能的影響を評価するために、目的のタンパク質の活性をアッセイするための追加の手法を実行できます。