Name: 蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単かつ迅速なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ ナイルレッド蛍光染色法を用いた藻類細胞の中性脂肪定量プロトコル。エタノール処理と530nm励起・604nm蛍光測定により、バイオプロセスの迅速なモニタリングが可能となる。

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著者らは、このプロジェクトのための財政支援を提供するための自​​然科学とカナダの工学研究評議会に感謝したいと思います。

1。乾燥藻類バイオマスの分離は、蛍光読み取りのための基準として使用されるように<ol><li>乾燥バイオマスの少なくとも200ミリグラムを提供する成長藻類培養物からの試料体積を取り外し、400〜600 mgのが好ましい。 </li><li>万X gで10分間4℃で遠心分離サンプル。上澄み液を捨て、増殖培地と同じpHに策定リン酸緩衝液等容量のペレットを洗浄。 </li><li> 3回の洗浄工程の全体について、手順1.2。 </li><li>再懸濁脱イオン水でペレットを皿の重量を量る予め秤量しに転送。 48時間50℃で乾燥させます。 NOTE：真空下で乾燥すると、乾燥時間を減少し、50°C以上の温度で培養物を乾燥させて再懸濁が困難になることができる。 </li><li>将来の使用のために室温で保存して乾燥させ、藻類培養。 </li></ol>ヘキサン抽出による中性脂質の2。重量測定定量（ブライとダイアー4より） <ol><li>量る皿に乾燥藻類バイオマスの約50ミリグラムを測定します。 NOTE：40〜80 mgの範囲の質量は、再現性を失うことなく使用することができる。 </li><li>ヘキサンで予め洗浄乳鉢にバイオマスを転送します。必要であれば、完全に乳鉢にバイオマスを転送するために、パスツールピペットを用いて少量のヘキサン（1ml）で秤量皿を洗浄する。注：ヘキサン揮発性の高い有毒物質である。それは適切な防護服とドラフト内で処理する必要があります。 </li><li>乳棒を用いて5分間藻類バイオマスを挽く。穏やかな研削で始まり、徐々に強度を増加させる。 5分間で、微細で滑らかなペースト状にバイオマスを挽く。乳鉢にバイオマスを転送する際に、過剰のヘキサンを使用する場合は、ヘキサン、研削前に蒸発するのを待つのが最善である。 </li><li>それが均質化されるまで、乳鉢にヘキサン数mlを加え、乳棒で得られたスラリーを混合する。すべての細胞破片がMORの壁に付着していることを確認してくださいタールは、遊離ノックして、液体中に懸濁する。 </li><li>遠心管にヘキサン細胞量混合物を転送します。注：遠心管は、ガラスやテフロンなどヘキサンと互換性の適切なポリマーのいずれかである必要があります。 </li><li>すべてのバイオマスが遠心管（3-5X）に転送されるまで繰り返します2.4と2.5を繰り返します。 </li><li>遠心10,000倍gで20分間4℃で試料。 </li><li>慎重に、予め秤量した金属の皿の重さに、上清をピペットで。ドラフト内で保管してください。 </li><li>ペレットにヘキサンの3ミリリットルを加えて、1分間激しくボルテックスして2 回目のヘキサン抽出を行う。 </li><li>繰り返します2.7と2.8を繰り返します。必要に応じて、すべての細胞破片が完全に安定することを確認するために第二の抽出の際に遠心分離器で30分間のサンプルを実行します。ヘキサンが完全に蒸発した後に重量測定抽出された油の質量を決定する。 </li></ol>ナイルレッドを使用した中性脂質の3。蛍光定量（Reporとしてテッド·デ·ラ·HOZまちがいなくら 11による） 注：5グラム/ Lの藻類懸濁液のみ10μlの蛍光読み取りのために必要とされる。一般的には、培養液の1.5ミリリットルから乾燥藻バイオマスの分離は十分ではありません。また、分光光度計でのランプの光強度は経時的に分解することができる。これは、機器の変化が測定値に不必要なエラーを追加しないことを保証するためにすべての実験で基準を含めることをお勧めします。 <ol><li>アルコール試薬グレードのエタノールに溶解した10μgの/ mlの濃度でナイルレッド溶液を調製する。 4℃の暗所でこのソリューションを保存する</li><li> 4℃の脱イオン水およびストア内の30％（v / v）エタノール溶液を調製</li><li>同じバイオマス濃度全く藻類のサンプルを準備します（5グラム/ Lをお勧めします）と測定で使用される規格と同様に。適切な量​​のいずれかで中断予備乾燥したサンプルでこれを行うリン酸緩衝液（0.6グラム/ Lのリン酸カリウム二塩基、1.4グラム/ Lのリン酸二水素カリウム）、または濁度を測定した後、リン酸緩衝液では5g / Lまで成長藻類培養物の濃度を調整する。注：ライブ藻類培養物に対して実行される測定は、多くの場合、濁度検量線の精度によって、それらに関連する大きな誤差を持つことになります。乾燥サンプルを再懸濁する完全にバイオマスを分散させるホモジナイザの使用を必要とし得る。 </li><li>各サンプルについて、96ウェルプレートの単一のウェル中の30％エタノール溶液80μL、ナイルレッド溶液10μl、および藻類懸濁液10μlを混ぜて。適切に蛍光測定のばらつきを考慮するために、各試料の5回の反復を実行する。 </li><li>楽器と準備中の日々の変動を考慮するために、以前に調製した標準との2点較正曲線を実行します。秒を用いた蛍光測定のための標準を調製サンプルとしてAME手順。注：一般的に2つの点が、機器の再校正のために十分である、3点が直線性を検証するために実行することができます。 </li><li>マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行う。以下の条件が最も安定した結果11が得られることが分かった。 <ol><li> 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。 </li><li> 10分間40℃でインキュベートする。 </li><li> 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。 </li><li>レコード蛍光、530nmでの励起、604 nmでの発光。 </li></ol></li><li>蛍光測定は、内部標準からの結果を使用して、油含有量へ変換する。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡法 NOTE：項3に記載の染色プロトコルは、定量分析のために設計され、それはまた、教育、例示puのための染色に基づいた技術の視覚表現を提供するのに有用であり得るrposes。サンプルの蛍光1の画像を生成するためには、従来の伝送および追加の落射蛍光照明光源と光学顕微鏡を必要とします。 530ナノメートル（緑）、604ナノメートル（赤）の範囲内の励起および発光光フィルターは、それぞれ、ナイルレッド染色だけでなく、関連するソフトウェアを有する顕微鏡に取り付けられたカメラのために必要とされる。この研究（ 図1）に示す画像は、RGB変換部にモノクロカメラとを備えた明視野顕微鏡を用いて取得した。これらのツールを使用してナイルレッド蛍光画像を生成するための手順を以下に概説する。 <ol><li>プロトコルのセクション3に係るナイルレッド染色で培養試料を準備します。 NOTE：5g / Lの濃度範囲の試料が過密することなく、適切な細胞密度のスライドを生成する。 </li><li>染色プロトコールのステップ3.6を完了した後、標準的な実験手順に従って処理された試料の顕微鏡スライドを準備する。 </li><li>透過モードで顕微鏡を皮切りに、顕微鏡にプレパラートをロードし、（この記事に示されている画像は、100Xの目的で取得された）所望の倍率で細胞を探します。 </li><li>集中すると、落射蛍光照明モードへの送信から顕微鏡を切り替える。光源は、現在の対物レンズ（このスライドと対物レンズとの間の空間を観察することによって視覚的に確認することができる）から直接来るべきである。 </li><li>観察光路に、光源と、赤色発光フィルタに緑色励起フィルターを挿入する;染色された細胞の蛍光は、今接眼レンズを介して直接表示されるはずです。 </li><li>車載カメラに接眼から顕微鏡観察モードを切り替えて蛍光を発する細胞の画像をキャプチャするために閲覧ソフトウェアを使用しています。カメラの感度に応じて、サンプルが最初に（ つまり画面の意志プレビューウィンドウに表示されない場合があります）黒;これを改善するために、細胞が見えるレベルまで露出時間やカメラのゲインを調整します。具体的な設定は、機器·設備、および細胞型によって変化するであろう。 </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
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<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

標準曲線に使用される藻類は測定されているものと同じ実験条件下で栽培し、同じ種でなければなりません。有意な培地組成の変化、栽培技術、および染色プロトコルが蛍光読み取りの強度に影響を与えることができる。 （セクション1および2に記載されている）ヘキサン抽出は、標準曲線に使用した試料の中性脂質含量を測定した。正確な蛍光強度測定のために、すべてのサンプルが同じバイオマス濃度（5g / Lのは、この研究で使用した）で分析しなければならない。油含有量は、次に簡単に標準曲線と比較することによって決定することができる。このプロトコルについては、藻類は、窒素源（0.2〜2.0グラム/ L）等の炭素源（30グラム/ L）及びグリシンなどのグルコースを含む従属栄養条件（28℃、100rpmで）の下で振盪フラスコ中で培養した。詳細なメディアのレシピについては、 表1を参照してください。 実施する際の重要な考慮事項プロトコルは、標準曲線を調製する際にウェット藻類バイオマスを乾燥するための条件である。 45℃の真空オーブンを推奨します。 45〜50℃で、従来のオーブンもあれば...

による一定のストレス条件下で脂質体を格納するためのそれらの能力のために、藻類は、潜在的な再生可能な燃料源1,2として近年注目を集めている。中性脂質は、適切な成長条件3の下で細胞乾燥重量の60％以上を占めることができます。しかし業界では、適切にバイオプロセスのパフォーマンスを監視するために、藻類の細胞の脂質含有量を定量文化を分析し、新しい株をスクリーニングするために、シンプルなきれいな、迅速で、信頼性の高い標準化されたプロトコルを持っていません。 ブライ·ダイアー重量法は、いくつかの50年前に開発、現在4,5使用される最も一般的な技術の中に残っている。この手順は、単純で信頼性が高く、実施が容易であるが、それは時間がかかり、大量の試料を必要とし、有毒な溶媒を使用する。これは、発酵実行から多くのサンプルを分析したり、新しい油を多く含む株をスクリーニングするための実用的ではありません。他の方法は、bは有するEENを開発するが、通常は先進的な設備を必要とし、6を標準化されていない。 大きな関心を集めている選択肢は、ナイルレッド染色である。ナイルレッド、非極性環境で優先的蛍光を発する染料は、線虫7、8、酵母、細菌9、10-19および藻類を含む様々な生物における脂質体を同定または定量するために使用されている。ナイルレッドを含む初期の技術は、単一キュベット分光光度法、またはフローサイトメトリー染色を組み合わせて、主に定性的または半定量的であった。また、このような緑藻類などの藻類のいくつかのクラスは、技術10の範囲が制限されて染料に大部分が不透過性で厚い細胞井戸を持っている。 ナイルレッド染色法への最近の改善は、プロトコル10,11の初期の欠点をバイパスすることが報告されている。カーの存在下で細胞を染色するIERは、DMSOの10系溶媒またはエタノール10,11は、信頼性の高い定量的な測定を可能にし、油含有量と吸光度との関係を線形化する。溶媒は、ナイルレッド分子が通過できるように、細胞膜を透過性にするのに役立ちます。さらに、マイクロプレート読み取り機能を備えた分光光度計を組み込むこと定量分析に適した高スループットプロトコルを可能にする。 この記事の我々の詳細にエタノール、穏やかな溶媒の存在下でナイルレッドと文化を染色することにより、藻の油含有量を測定するための簡単​​な方法。最も正確にするために、測定におけるバックグラウンドノイズを考慮し、油含有量を蛍光強度を相関させる標準曲線は、既知油組成物の藻類細胞を用いて現像される。この方法は、以前公開されたプロトコル10,11から採用されている。 96ウェル分光光度計を使用することにより、時間の股関節内のサンプルと同じ量を分析することができるTは、重量法により監視するために何日もかかるでしょう。さらに、所望藻類種の代表的なサンプルを使用して校正することにより、このメソッドを直接解釈可能である比較的正確な測定値を生成します。異なる株およびアプリケーション向けに最適化されたナイルレッドで藻類を染色する方法を概説し、多くのプロトコルが存在する;ここで紹介するプロトコルは、もともとデラHOZまちがいなくらによって開発されました。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスのdimorphus、及びセネデスムス斜ための11を 、それがより多くの種やクラスのための可能性が適しているが。これは、監視、バイオプロセスのパフォーマンスの特定のアプリケーションで設計されており、それが成長している培養物から、以前に乾燥した試料と湿潤試料でも同様に動作します。

<table><tbody><tr><td>乾燥重量</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml 使い捨てピペット</td><td>フィッシャー</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>ピペット バルブ</td><td>フィッシャー</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml ナルゲン テフロン 遠心分離チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-562-16A</td><td>ヘキサンに必要なテフロン</td></tr><tr><td>計量皿 (ポリプロピレン)</td> <td>フィッシャー</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心機チューブフィ</td><td></td><td>ッシャー05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ソルバル</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>乾燥オーブン(フィッシャー625D)</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>ストレージバイアルフィ</td><td></td><td>ッシャー0337-4</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップマイクロ遠心分離機(エッペンドルフ5415D)</td><td>フィ</td><td>ッシャー05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>重量定量化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁器モルタル(クアーズテック)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-961A</td><td></td></tr><tr><td>磁器乳棒(クアーズテック)</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40ml遠心分離管(FEP)</td><td>フィ</td><td>ッシャー05-562-16A</td><td>ガラス管も使用できますパス</td></tr><tr><td>ツールガラスピペットフィ</td><td></td><td>ッシャー13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>アルミ計量皿</td><td>フィ</td><td>ッシャー08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>油分</td><td></td><td></td><td></td>濃度の蛍光定量</tr><tr><td>蛍光マルチウェルプレートリーダー</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>蛍光リーダーソフトウェア</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent ソフトウェア 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR 96 丸底の</td><td>ウェルプレート Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>ナイルレッド</td><td>シグマ</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(アルコール試薬グレード)</td><td>フィッシャー</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>イメージング 蛍光細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ DMRXA2(または同等品) 顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバー スリップ</td><td>フィッシャー</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

藻類は、彼らの自然な脂質貯蔵能力による再生可能な燃料源のための優れた候補と考えられている。藻類発酵プロセスと新しいオイルが豊富な株をスクリーニングするための堅牢なモニタリングは、細胞内の脂質含有量の測定のための高速かつ信頼性の高いプロトコルが必要です。現在の慣行は、油含有量を決定するために、重量法に大きく、時間がかかり、大量の試料を必要とする数十年前に開発された技術に頼る。本稿では、ナイルレッド、多数のタイプの生物における脂質体の存在を同定するために使用されている蛍光色素は、緑色、Auxenochlorellaのprotothecoidesの中性脂質含量を測定するための、簡単、迅速、かつ信頼性の高いプロトコルに組み込まれている藻類。この方法は、染色前に細胞膜と蛍光強度測定中に試料容量を増加させる96ウェルマイクロプレートを透過性にするために、エタノール、比較的穏やかな溶媒を使用する。それがデザインされているバイオプロセスのパフォーマンスを監視する特定のアプリケーションに編成長している培養物から、以前に乾燥されたサンプルやライブのサンプルをアッセイに使用することができます。

ナイルレッド染料で染色した代表的な藻体を図1に示されている。A. 図1の表示画像のパーツA及びB protothecoidesは非常に低い細胞内脂質の蓄積につながる、過剰窒素中で増殖させた。部品CとD、Aのサンプルにおける窒素制限下で増殖させprotothecoidesが示されている。透過照明の下では、細胞の脂質体は、それらが光沢のある円形の構造として表示され、細胞容積の大部分を構成し、図1C、注意深く検査して視覚化することができる。過剰の窒素中で増殖させた図1Aに示す細胞は、乾燥重量で5％の油であり、脂質体の有意なレベルを含んでいない。 適切な光条件下で示す場合には、これらのサンプルの差が拡大される。油の少ない細胞石油が豊富な細胞は、彼らが脂...

ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単​​なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

本実験の目的は、ナイルレッド蛍光染料を用いて藻類細胞の中性脂質含有量を測定することです。まず、細胞をエタノール溶液に懸濁させて細胞壁と細胞膜を透過性にした後、ナイルレッド蛍光染料を添加します。この染料は細胞内に浸入し、中性脂質滴を含む細胞内の非極性領域に蓄積します。次に、試料に530ナノメートルの励起光を照射し、中性脂質体に吸収されたナイルレッドを604ナノメートルで蛍光させます。個々の試験をマイクロウェルマルチプレートで行い、分光光度計を用いて迅速に蛍光値を測定することで、大量の結果を得ることができます。測定値は、藻類細胞の中性脂質含有量と蛍光測定強度の間に線形関係があることを示しています。蛍光測定値からオイル含有量への変換は、既知のオイル組成を持つ細胞を用いて作成した検量線により行うことができます。Blydire重量法などの既存のプロトコルに対する本手法の主な利点は、ほとんどの研究室で利用可能な資材を用いて、中性脂質含有量を迅速に決定できることです。この方法は、藻類の培養中におけるバイオプロセスの性能について、即時のフィードバックを提供します。また、96ウェルプレートリーダーによるハイスループット性は、スクリーニング研究や要因実験に最適です。この手法はchlorellaおよびS. desus用に最適化されていますが、他の藻類種の解析に向けて容易に修正可能です。まず、少なくとも200 mgの乾燥バイオマス量に相当するサンプル量を、増殖中の藻類培養液から採取します。400から600 mgが好ましい。サンプルを4 °Cで10,000 ×g、10分間遠心分離し、上清を除去した後、培地と同じpHに調整したリン酸緩衝液と同量でペレットを洗浄する。この工程を合計3回の洗浄ステップまで繰り返します。ペレットを脱イオン水で再懸濁し、あらかじめ重量を測定した称量皿に移します。サンプルを50 °Cで48時間乾燥させます。乾燥させた藻類培養物は、今後の使用のために室温で保存することができます。ホエイ皿に約50 milligramsの乾燥藻類バイオマスを量り取ります。バイオマスを、必要に応じてヘキサンで事前洗浄した乳鉢に移します。その際、バイオマスを完全に乳鉢へ移すために、パストピペットを用いてホエイ皿を少量のヘキサンで洗浄してください。次に、乳鉢と乳棒を用いて、藻類バイオマスを5分間すり潰します。最初は軽くすり潰し始め、徐々に強度を上げてください。バイオマスを細かく滑らかなペースト状になるまですり潰します。5分間のうちに、乳鉢にヘキサンを数mL加え、すりこぎで均質になるまで得られたスラリーを混合します。乳鉢の壁面に付着したすべての細胞残渣をかき出し、液体中に懸濁させてください。次に、ヘキサンと細胞質塊の混合物を、適合する遠心管に移します。すべてのバイオマスが遠心管に移されるまで、この操作を3〜5回繰り返します。サンプルを4 °Cで20分間、10,000 ×gで遠心分離します。遠心分離後、上清をあらかじめ重量を量った金属製秤量皿に慎重にピペッティングし、ドラフトチャンバー内で保存します。ペレットに3 mLのヘキサンを加え、激しくボルテックスすることで、2回目のヘキサン抽出を行います。遠心分離と上清の回収を1分間繰り返します。ヘキサンが完全に蒸発した後、重量法により抽出されたオイルの質量を測定します。蛍光定量を行う際は、すべての藻類サンプルを、測定に使用する標準試料と同じバイオマス濃度で、かつ同様の方法で調製してください。あらかじめ乾燥させたサンプルを、適切な量のリン酸緩衝液に懸濁させてこれを行います。必要に応じて、ホモジナイザーを使用して乾燥した藻類細胞の再懸濁を促進してください。各サンプルについて、調製済みの30%エタノール溶液80 µL、調製済みのナイルレッド溶液10 µL、および藻類懸濁液10 µLを、96ウェルプレートの1ウェルに混合します。蛍光測定のばらつきを適切に考慮するため、各サンプルについて5回の繰り返し測定を行ってください。次に、事前に調製した標準試料を用いて2点校正曲線を作成します。マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行う際、機器のおよび調製の日次変動を考慮するため、パラメータを1,200 RPMで30秒間、振幅3 mmで振盪させ、続いて40 °Cで10分間インキュベートするように設定します。その後、再び1,200 RPMで30秒間、振幅3 mmで振盪させ、励起波長530 nm、蛍光波長604 nmで蛍光を記録します。最後に、ランを開始します。内部標準の結果を用いて、蛍光測定値をオイル含有量に変換し、蛍光顕微鏡観察を行います。ナイルレッド染色で調製した試料を用い、標準的な実験手順に従ってプロセス試料の顕微鏡スライドを作成します。顕微鏡を透過モードに設定した状態で、作成したスライドをセットし、目的の倍率で細胞を探索します。ピントを合わせた後、顕微鏡を透過照明モードからエピ蛍光照明モードに切り替えます。光源が対物レンズから直接照射されている必要があります。これは、スライドと対物レンズの間の空間を視覚的に観察することで確認できます。光源に緑色励起フィルターを、観察光路に赤色透過フィルターを挿入してください。染色された細胞の蛍光が接眼レンズを通して直接観察できるはずです。顕微鏡の観察モードを接眼レンズから搭載カメラに切り替え、ビューイングソフトウェアを使用して蛍光細胞の画像をキャプチャします。具体的な設定は、使用する機器、装置、および細胞の種類によって異なります。Nile redで染色した代表的な藻類細胞の画像を示します。窒素過剰条件下で培養されたプロテ（prothe）では細胞内脂質の蓄積が非常に低く、これは窒素制限下で培養されたOIDsのサンプルとは対照的です。透過光照明下で注意深く観察すると、細胞の脂質体が光沢のある円形の構造として視認でき、細胞体積の大部分を占めていることがわかります。ここで示している細胞の乾重量あたりのオイル含有量はわずか5%であり、適切な光条件下で観察しても、有意なレベルの脂質体は含まれていません。これらの試料間の差異が拡大されています。油分が少ない細胞は、内部が暗い蛍光リング状に見えますが、油分が多い細胞は、脂質体が蓄積している部分に明るいオレンジレッドの輝きが見られます。ナイルレッドは、中性脂質、細胞壁に存在するリン脂質、および非極性細胞タンパク質の有無に応じて異なる波長で蛍光を発するため、油分が少ない細胞は内部が暗い蛍光リング状に観察されます。この非特異性が、最適化されたアッセイ条件下での中性脂質の分光光度計測定時における蛍光のバックグラウンドレベルの原因となります。一方、最適条件下では、R二乗値が0.980以上の検量線を容易に得ることができます。エタノールのようなキャリア溶媒を含まない溶液で細胞を染色した場合、細胞のオイル含有量と蛍光の相関は非線形になります。ここに提示したデータはR二乗値が0.395であり、0%エタノール溶液でプロトコルを実施して得られたものです。この手法を習得すれば、適切に実施することで15分から20分で完了できます。この手順を行う際は、すべての試料を同一のバイオマス濃度で調製することが極めて重要です。このビデオを視聴することで、従来のヘキサン抽出プロトコルと、より簡便なNALレッド蛍光染色手順の両方を用いて、lgal細胞の中性脂質含量を測定する方法について十分に理解できるはずです。

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学ぶ ナイルレッド蛍光染色法を用いた藻類細胞の中性脂肪定量プロトコル。エタノール処理と530nm励起・604nm蛍光測定により、バイオプロセスの迅速なモニタリングが可能となる。

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

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