蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

次の実験の全体的な目標は、ナイル赤色蛍光色素を使用して藻類細胞の中性脂質含有量を測定することです。これは、まず細胞をエタノール溶液に懸濁して細胞壁と細胞膜を透過させることによって達成されます。第2のステップとして、ナイル川の赤色蛍光色素を添加し、これが細胞に入り、中性脂質体を含む細胞の非極性領域に蓄積します。

次に、サンプルを530ナノメートルの励起光源にさらすと、中性脂質体に吸収されたナイルレッドが604ナノメートルで蛍光を発します。結果は、マイクロウェルマルチプルで個々のテストを実施し、分光光度計を使用して迅速な蛍光測定値を生成することにより、大規模で得られます。測定値は、lgal細胞の中性脂質含有量と蛍光測定の強度との間に線形関係があることを示しています。

蛍光測定値の油分への変換は、既知の油組成の細胞で調製した検量線で達成できます。この技術が既存のプロトコル(Bly dire gravimetric法など)よりも優れている点は、ほとんどのラボで利用可能な材料を使用して中性脂質含有量を迅速に測定できることです。この方法は、藻類培養中のバイオプロセス性能に関する即時フィードバックを提供します。

また、96ウェルプレートリーダーによるハイスループットは、スクリーニング研究や要因実験に最適です。この手法はクロレラとDesusに最適化されていますが、他のlgal種の分析のために簡単に変更することができます。大丈夫です。まず、成長中の藻類培養物からサンプル量を取り出し、少なくとも200ミリグラムの乾燥バイオマスを提供します。

400〜600ミリグラムが好ましいです。サンプルを摂氏4度で10分間、10, 000回遠心分離します。G、上清を捨て、成長培地と同じpHに配合された同量のリン酸緩衝液でペレットを洗浄します。

このプロセスを合計3つの洗浄ステップで繰り返します。ペレットを脱イオン水に再懸濁し、事前に計量した計量皿に移します。サンプルを摂氏50度で48時間乾燥させます。

乾燥した藻類培養物は、将来の使用のために室温で保存することができます。ホエー皿で約50ミリグラムの乾燥藻類バイオマスを測定します。必要に応じて、ヘキサンで事前に洗浄したモルタルにバイオマスを移し、過去のピペットを使用して少量のヘキサンでホエイディッシュを洗浄し、バイオマスをモルタルの順序に完全に移します。

次に、乳棒を使用して藻類バイオマスを5分間粉砕します。穏やかな粉砕から始めて、徐々に強度を上げていきます。バイオマスを細かく滑らかなペーストに粉砕します。

5分間の間に、数ミリリットルのヘキサンを乳鉢に加え、得られたスラリーを乳棒と混合して均質化します。モルタルの壁に付着したすべてのセルの破片がノックフリーになり、液体に浮遊していることを確認します。次に、ヘキサン細胞質量混合物を適合する遠心分離チューブに移します。

すべてのバイオマスが遠心分離管に移されるまで、3〜5回繰り返します。サンプルを摂氏4度で20分間、10, 000回遠心分離します。G.遠心分離後、上清を慎重にピペットで秤量した金属製のウェイディッシュに入れ、ヒュームフードに保管します。

ペレットに3ミリリットルのヘキサンを加え、激しくボルテックスすることにより、2回目のヘキサン抽出を行います。1分間、遠心分離と上清の移送を繰り返します。ヘキサンが完全に蒸発した後に抽出された油の質量を重量測定で決定します。

蛍光測定法の定量では、測定に使用した標準試料と同じ方法で、すべての藻類サンプルを同じバイオマス濃度で調製します。これを行うには、事前に乾燥させたサンプルを適切な量のリン酸緩衝液に懸濁します。必要に応じて、ホモジナイザーを使用して、乾燥したlgal細胞の蘇生懸濁を促進します。

各サンプルについて、調製した30%エタノール溶液の80マイクロリットル、調製したナイルレッド溶液の10マイクロリットル、および96ウェルプレートの1つのウェルに10マイクロリットルの藻類懸濁液を混合します。蛍光測定のばらつきを適切に考慮するために、各サンプルを5回繰り返します。次に、事前に準備した標準試料を使用して2点検量線を実行します。

装置の日々の変動を考慮し、マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行うための準備を行うには、パラメータを1, 200 RPMで振とうし、3ミリメートルを30秒間周回し、続いて摂氏40度で10分間インキュベートするように設定します。1, 200 RPMで別の振れ、30秒間3ミリメートルを周回し、530ナノメートルでの励起と604ナノメートルでの発光で蛍光を記録します。次に、最後のステップとして実行を開始します。

内部標準からの結果を使用して蛍光測定値を油分に変換し、蛍光顕微鏡検査を実施します。ナイルレッドステインで調製したサンプルを使用して、標準的な実験室の手順に従ってプロセスサンプルの顕微鏡スライドを調製します。透過モードの顕微鏡から始めて、準備したスライドを顕微鏡にロードし、希望の倍率で細胞を見つけます。

ピントを合わせたら、顕微鏡を透過モードから落射蛍光照明モードに切り替えます。光源は対物レンズから直接来るようになり、スライドと対物レンズの間の空間を観察することで視覚的に確認できます。光源に緑色の励起フィルターを挿入し、観測光路に赤色の発光フィルターを挿入します。

染色された細胞の蛍光は、接眼レンズを通して直接見えるはずです。顕微鏡観察モードを接眼レンズから取り付けられたカメラに切り替え、 viewソフトウェアを使用して蛍光を発する細胞の画像をキャプチャします。具体的な設定は、機器、機器、細胞の種類によって異なります。

ナイルレッド色素で染色した代表的な藻類細胞は、過剰な窒素で増殖したプロテの画像を示し、細胞内脂質の蓄積が非常に少ないことを示しています。これは、窒素制限下で増殖したOIDのサンプルとは対照的です。透過照明下では、細胞の脂質体を、光沢のある円形構造として現れ、細胞体積の大部分を構成する場所を注意深く観察して視覚化できます。ここに示されている細胞は、乾燥重量でわずか5%の油分であり、適切な光条件で示された場合、有意なレベルの脂質体を含んでいません。

これらのサンプルの違いは拡大されています。油脂が豊富な細胞は、暗い体を持つ蛍光リングとして現れますが、油が豊富な細胞は、脂質体が蓄積した場所に明るいオレンジ色の赤い輝きを示します。ナイルレッドは、中性脂質、細胞壁にあるリン脂質、および非極性細胞タンパク質の存在に応じて異なる波長で蛍光を発するため、油性細胞は暗い体を持つ蛍光リングとして現れます。

この非特異性は、アッセイの最適化された条件下での中性脂質の分光光度計測定中に蛍光のバックグラウンドレベルを引き起こすものでもあり、0.980を超えるR二乗値の検量線は容易に達成可能です。細胞油分と蛍光の関係は、エタノールなどのキャリア溶媒を含まない溶液で細胞を染色すると非線形になります。ここに示すデータのR二乗は0.395で、0%エタノール溶液中でプロトコールを実施することによって得られたものです。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば15〜20分で実行できます。この手順を実行する際には、すべてのサンプルが同じバイオマス濃度で調製されていることを確認することが重要です。このビデオを見れば、従来のヘキサン抽出プロトコルとより単純なNAL赤色蛍光染色手順の両方を使用して、lgal細胞の中性脂質含有量を測定する方法について十分に理解できるはずです。