ヒト血清から小非コードRNAの分離

本手順の全体的な目的は、血清サンプルから高品質なRNAを単離することです。これは、一般的なMRC try試薬RTLSプロトコルを最適化したバージョンを用いて行われます。まず、タンパク質による汚染を軽減させるため、血清をヌクレアーゼフリー水で1:5の比率で希釈することでこれを達成します。

第2のステップは、最初の遠心分離ステップのために2 mLのフェーズロックチューブを導入することです。これにより、フェノールやタンパク質などの不純物の大部分が有機相にトラップされます。次に、第3の最終的な最適化ステップとして、12,000 ×gでのフラッシュ遠心分離を行い、エタノール洗浄前にRNAペレットから残留汚染物を除去します。

より高い全RNA収量を必要とする場合は、最終ステップとして、同一患者から得られた2つの修飾RNA調製物を合わせてプールします。最終的に、核酸分解酵素フリーの水で血清を溶解させ、フェーズロックチューブを用いて主要な不純物をトラップし、フラッシュスピンを導入したこの修飾法を用いることで、血清からのRNA単離において小型の非コーティングRNAの回収率を最大化できることを示します。

標準的なトリオールRNA抽出プロトコルのような既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、簡単な修正を加えることで血清からのRNA収量を最大化できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、血清中のスモールRNAが低濃度であるため、抽出に苦慮することがあります。最適化された手法と各ステップの可視化により、これらのRNAの回収率が向上し、初心者が抽出を成功させるためのガイドとなります。

まず、あらかじめ調製した凍結血清試料を氷上で解凍し、解凍直後の血清400 µLをラベル付きのマイクロ遠心チューブに移します。次に、血清を100 µLのRNaseフリー水で希釈し、濃度1 mg/mLのProteinase Kを50 µL加えます。その後、希釈した血清を37 °Cで20分間インキュベートし、十分なタンパク質消化を行い、TRI Reagent RTL-S 1.5 mLおよび4-promo anole 100 µLによる完全な可溶化を確実にします。

ホモジネートを軽く反転させ、5秒間繰り返しピペッティングします。次に、混合物をラベル付けした2 mLのヘビーフェーズロックチューブに移します。ホモジネートを4 °Cで20分間、12,000 GSで遠心分離します。

次に、得られた水層1 mLを注意深くデカンテーションし、新しいDNAローバインドチューブに移します。有機層と界面層は、フェーズロックチューブの白いゲル層の下に保持されるはずです。その後、水層に5 µLのグリコーゲンと500 µLの100%isopropanolを加えます。

溶液を転倒混和し、-20 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、4 °Cに設定した遠心分離機を用いて、サンプルを12,000 ×gで20分間遠心分離します。次に、透明な上清を捨て、4 °Cの遠心分離機で16,000 ×gにて2分間のフラッシュスピンを行います。

ピペットを使用して、ペレット周囲の透明な溶液を注意深く取り除きます。次に、1 mLの70% ethanolでペレットを洗浄し、サンプルを10,000 gで10分間遠心分離します。ペレットを確認するために、チューブを暗い背景の前で傾け、洗浄液を捨てます。

洗浄を繰り返します。次に、ペレットを10 µLのRNaseフリー水に懸濁させます。

サンプルを55 °Cで5分間加熱し、ペレットが完全に溶解していることを確認します。この間に、ピペッティングを繰り返してサンプルを混合し、トータルRNAの収量を高めるため、同一患者からの2つのRNA調製物をプールします。再懸濁したRNAをUV分光光度計を用いて定量します。

分光光度計を用い、2100 bioanalyzerを使用してRNAの品質を評価します。その後、プールしたRNAサンプルを、後続のアプリケーションで使用するために-80°Cで保存します。ヒト血清から抽出したRNAの分光光度プロファイルは、従来のChomsky法にいくつかのステップを追加したことで、RNAの収量が向上したことを示しています。

ヒト血清から単離したRNAの典型的なUVプロファイルと、グリコゲンの添加や追加のスピンなどの最適化ステップを導入した際のプロファイルを比較すると、これらの手法を組み合わせることで不純物が減少し、全RNA回収量が増加することがわかります。さらに、フェノールやタンパク質を捕捉するフェーズロックゲルの使用により、RNAサンプルの純度が向上しました。加えて、血清の量を増やすことも、RNA回収量に顕著な影響を与えます。

サンプルの品質をさらに分析するために、バイオアナライザーによるトレースを実施しました。約21ヌクレオチドに現れた単一のスパイクは、マイクロRNA分画を示しています。その後、手順に従ってアレイプロファイリングおよびQPCRを実施しました。3例の頭頸部癌と1例の正常組織のこのアレイプロファイルは、マイクロRNAの発現を示しており、階層的クラスター分析を用いて分析し、マイクロRNAのアップレギュレーション（発現上昇）とダウンレギュレーション（発現低下）が確認できるヒートマップとして提示しました。

特定のmicroRNAについて、以下のようなqPCR増幅曲線が作成されました。その後、このデータを用いて正常血清の生のCT値をプロットしました。この技術を習得すれば、手順に従って適切に実施することで、多数の患者から高品質なRNAを最大限に抽出することが可能です。バイオマーカーの探索や検証といった追加の課題を解決するために、定量PCRや次世代シーケンシングなどの他の手法を用いることもできます。