Name: タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 学ぶ単一分子レベルでのタンパク質-DNA相互作用の観察法。二重光トラップと蛍光顕微鏡を組み合わせたカスタム顕微鏡システムを用いて、DNA結合タンパク質の動的挙動を詳細に解析する手法です。

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私たちは、サンプル調製のヘルプのためのマイクロ流体とアレッシアTempestiniのヘルプはハイス·Wuite、アーウィンJGピーターマン、ピーターグロスに感謝します。本研究は、n 284464を°とRicerca 2013 RBFR13V4M2教育、大学·研究FIRB 2011 RBAP11X42L006、フトゥロイタリア省から、との枠組みの中でグラント契約の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（FP7 / 2007年から2013年）によって賄われていたフラッグシップ·プロジェクトNANOMAX。

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去10年間で、単一分子マニピュレーションとイメージング技術は、空間および時間解像度の面で大きな進歩を見てきました。操作およびイメージング技術の組み合わせは、現在では、DNA、RNA、または細胞骨格フィラメントとして単一の生物学的ポリマーの機械的条件の制御を可能にする強力な器具のベースと、同じポリマーと相互作用する単一のタンパク質の同時局在化である。閉じ込められたポリマーの機械的条件を制御することが特に重要である。実際に、生細胞における、核酸は、連続的に酵素と相互作用するタンパク質によって引き起こされる機械的応力を受けている。同様に、相互作用するタンパク質や分子モーターの複雑なネットワークは、細胞骨格フィラメントの張力を調節する。一方、検出および正確に核酸と相互作用するタンパク質を局在化する可能性は、それらの経口の関数としての分子相互作用の測定を可能にするDNAまたはRNA配列に沿っsition。 単一分子操作とイメージング技術を組み合わせることにより、実験装置の慎重な設計と生物学的構造物を必要とします。光トラップは中断ポリマーのナノメートルレベルの安定性を確保し、安定した支持を提...

単一分子（SM）の技術が大幅に伝統的な、バルク溶液の測定1-3のいくつかの制限を克服する必要性に対応するために、過去30年にわたって開発してきた。単一の生物学的分子の操作は、バイオポリマー4の機械的特性を測定し、タンパク質-タンパク質5およびタンパク質-DNA相互作用6,7の機械的パラメータを制御する機会を作成した。 SMの蛍光検出は、一方で、ナノメートルの精度で単一分子を局在化および追跡の可能性をもたらす、 インビトロおよびインビボでのタンパク質活性を研究するための驚くほど用途の広いツールを表す。 SM画像に器具点広がり関数のフィッティングを介して、実際には、一方が信号対雑音比（SNR）に主に依存し、約1ナノメートル8,9の限界に達し精度で局在化を達成することができる。これらの方法論は強力見つけるモータータンパク質のダイナミクスの研究においてだけでなく、DNA結合タンパク質におけるターゲット探索の基礎となる拡散プロセスのアプリケーションに最適です。ターゲット上のDNA配列の機能、滞留時間などの拡散定数を決定し、正確に一次元拡散イベント中探求DNAの長さを測定する能力は、タンパク質-DNA相互作用の動力学の研究のための調査のための強力なツールを表す特定のターゲット探索のメカニズム。 最近では、これら2つの技術の組み合わせは、例えば、生物学的基質（例えば、アクチンフィラメント又はDNA分子）と相互作用パートナー酵素の検出/局在化（同時操作を可能にする実験装置10-14の新世代を生産しているミオシンまたはDNA結合タンパク質）。これらの技術の利点は、主にENAしたがって、捕捉されたポリマー上の機械制御を発揮する可能性に載る力又はトルクに対する相互作用のダイナミクスの研究をブリンブリン。また、方法は、古典的なSM方式、 すなわち、表面上の研究中の分子の固定化のための必要性（ガラススライドまたはマイクロスフェア）の主な制限の一つを避け、表面から遠い生化学的反応を測定することができる。 2単一分子技術の組み合わせは、15（nmの精度でローカライズが必要な場合は特に）は、主に機械的安定性および十分なSNRの要件に起因する、いくつかの技術的困難を克服する必要があります。特に、ノイズの低減を光ピンセットとSMの蛍光検出を結合し、捕捉赤外線レーザー16および生物学的複合体11が最重要である実験的測定の性能の組み立てのための生化学的なバッファのコントロールから光退色する。ここでは、正常に実行するための方法を記載デュアルトラップ/ SM蛍光ローカライズセットアップでの測定値。方法は、（Atto532付き）ラクトースリプレッサータンパク質（LacIリ）蛍光標識の例に示されており、それは、特定のLacI結合配列（ すなわち、オペレータ）を含有する（二つの光ピンセットの間に閉じ込められた）DNA分子に結合するとして検出される。私たちは、ターゲット検索処理においてその輪郭に沿ってDNAと拡散のLacIの結合を検出する方法の有効性を示す。この方法は、DNA配列およびDNA結合タンパク質の任意の組み合わせの、並びに他のシステム（または微小管アクチンフィラメント及びそれらと相互作用するモータータンパク質）にも適用可能である。

<table><tbody><tr><td>エラストマーアイソレータ</td><td>ニューポート</td><td>ニューダンプ</td><td>顕微鏡の重量と共振周波数に応じて適切なニューダンプエラストマーを選択してください</td></tr><tr><td>研究用</td><td>光学アイソレータ</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAGレーザー、波長1,064nm</td><td>スペクトル物理学</td><td>ミレニアニア赤外線</td><td></td></tr>光学<tr><td>デフレクター(AOD)</td><td>A&オプトエレクトロニクス</td>、<td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>、ダイレクトデジタルシンセサイザ、</td><td>アナログデバイセ</td><td></td><td></td>ズ、</tr><tr><td>クアドラント検出器、フォトダイオード、</td><td>OSI、オプトエレクトロニクス</td><td>、SPOT-15-YAG</td><td></td></tr>、<tr><td>DIO、FPGAボード</td><td>、ナショナルインスツルメンツ</td><td>、NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>、ハロゲンランプ</td><td>、ショット</td><td>、KL 1500、LCD</td><td></td></tr><tr><td>コンデンサ、</td><td>オリンパス</td><td>、U-AAC、1.4NAアプラナート、アプクロマー</td><td></td>ト</tr><tr><td>、対物レンズ</td><td>、ニコン</td><td>CFI、プラン、アポクロマート、60x、1.2NA、水浸、</td><td></td></tr><tr><td>532nm、レーザー</td>、<td>コヒーレント</td><td>、サファイア</td><td></td></tr><tr><td>、CCD、2000X、浜松&</td><td>nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>電子増倍型CCD</td><td>浜松&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾステージ、nm精度</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Emission Filter</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>シリカビーズ (1.54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Pentyl acetate&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>46022</td>可燃性<td>液体および蒸気(No1272/2008)</td></tr><tr><td>ニトロセルロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>N8267-5EA</td><td>可燃性固体&nbsp;(No.1272/2008)</td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>(取り外し可能なブロック 2 個付き); 120 °C で予熱;C</td></tr><tr><td>NanoPortアセンブリ</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>ポリエーテルエーテルケトンチューブ&nbsp;</td><td>アップチャーチサイエンティフィック株式会社</td><td>1535</td><td></td></tr><tr>プレキシガラス<td></td><td></td><td></td>製の<td>フローチャンバー圧力リザーバーの組み立て用自家製金属ホルダー</td></tr>ル<tr><td>アーロックチップシリンジ2.5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>シャットオフバルブ&nbsp;</td><td>アップチャーチサイエンティフィック株式会社</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>フランジレス継手&nbsp;</td><td>アップチャーチサイエンティフィック株式会社</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>フッ素化エチレンプロピレンチューブ&nbsp;</td><td>アップチャーチサイエンティフィック株式会社</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>2つのコンピュータ制御ソレノイドバルブ</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>圧力トランスデューサ</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>227056</td><td>可燃性液体、皮膚吸収により有害です。刺激性、催奇形性。H226;H303;H312;H316;H319;H331;H360;P201;P261;P280;P305;P351;P338;P311</td></tr><tr><td>トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタチオン還元型(GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>急性毒性、経口(カテゴリー5)、H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15、PLQK Ultracel-PL メンブレン、10&nbsp;kDaカットオフスピン濃縮器</td>メル<td>クミリポアUFC901024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンコーティングポリスチレンビーズ1.87&micro;m</td><td>Spherotech, Inc. (英語)</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質-dna相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

この論文は、タンパク質-DNA相互作用の研究のための光ピンセットと単一分子蛍光検出の組み合わせについて説明しています。この方法は、溶液中で発生する相互作用を調査し(したがって、他の単一分子法のように表面が近接していることによる問題を回避し)、DNA伸長を制御し、機械的パラメータとDNA配列の両方の関数として相互作用ダイナミクスを追跡する機会を提供します。光トラップの成功と単一分子のナノメートル局在を確立する方法が示されています。Atto532で標識されたラクトースリプレッサー(lacI)と、LacI結合の特定の標的配列(オペレーター)を含むDNA分子との相互作用の研究を可能にする実験条件を示します。この方法により、オペレーターでの特異的な相互作用の観察や、ターゲット探索の過程でのタンパク質の一次元拡散が可能になります。この方法は、タンパク質-DNA相互作用の研究に広く適用できますが、パートナートラックポリマー(アクチンや微小管など)に加えられる張力の制御が望ましい分子モーターにも適用できます。

成功した実験では、一つ（または複数）の標識タンパク質は、DNA分子（ 図3A）に沿っ/アンバインドおよび/ ​​または一次元拡散結合受ける。 DNA分子に沿ったタンパク質の局在化は、DNA配列の関数として動力学的パラメータの定量化を可能にする。 1次元拡散を引き起こすバッファー条件が適用されると、それは、拡散係数D 1D例えば、タンパク質の軌跡に従い、決定することが可能である。 単一のスポットの正確な位置は、各フレームにおいて、大きなデータセットを扱う場合に、より迅速な、最近発表されたアルゴリズム（ラジアルで、あるいは、二次元ガウス関数と点広がり関数（PSF）をフィッティング等により決定することができるシンメトリーセンター、RSC）26,27。後者の方法は、一般的にガウシアンフィッティングに匹敵する定位精度を達成すると、画像の最大半径方向の対称点を決定する。 BOで番目の場合は、追跡が自由に27アクセスできるMATLABルーチンを介して達成することができる。 <p class...

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

本手順の総合的な目的は、単一のDNA結合タンパク質とDNA分子との間の動的な相互作用を観察することです。これは、カスタム設計の顕微鏡において、2つの単分子技術であるダブルオプティカルツイーザー（二光ピンセット）と蛍光顕微鏡を組み合わせることで実現されます。また、このセットアップには、視認のための明視野照明およびサンプルのナノメートル単位の安定化機能が備わっています。第2ステップとして、最大4つの層流により、実験に必要なすべてのコンポーネントを効率的に誘導し組み立てることができるよう、マイクロフローシステムに組み込まれたマルチチャンネルフローセルを構築します。次に、実験を実施するために、単分子構築物を組み立てます。まず、第1チャンネル内で、ストリップチチンをコーティングした2つのマイクロ球をデュアル光ピンセットで捕捉します。次に、捕捉された2つのビーズを第2チャネルに移動させ、両端にビオチン標識がなされたDNAテンプレートを付着させます。第3チャネルにおいて、DNAの力伸長解析を行い、単一のDNA分子が存在することを確認します。最後に、DNAダンベルと呼ばれるビーズ-DNA-ビーズ構築物を、蛍光標識されたラクトースリプレッサータンパク質が存在するタンパク質チャネルへ移動させます。単一の伸展DNA分子上における単一のLAC eye分子の拡散および特異的結合、ならびにLAC eyeの運動に関する速度論的パラメータの定量化の結果が得られました。既存の単一分子手法に対する本手法の主な利点は、分子に印加する張力を制御できること、結合タンパク質の動きをナノメートル単位で安定したスポット上で精密に追跡できること、そしてカバーガラス表面から十分に離れた位置で操作できることです。本手法は、タンパク質とDNAの相互作用に関する重要な問い、特に遺伝子発現調節のメカニクスや、標的探索メカニズムにおけるDNAに沿ったタンパク質拡散のダイナミクスを解明するのに役立ちます。本手法のデモンストレーションは、フローセルのサンプルハンドリングの構築およびDNAビーズ構築物のアセンブリに関する実践的な側面を示す上で非常に有用です。このビデオでは、まず、カバースリップ表面に付着させたマイクロビーズをリファレンスとして用い、2つのトラッピングレーザーのポインティング安定性を確認する方法を説明します。光ピンセット装置の設計と構築に関する詳細は、付随するプロトコルテキストで確認できます。24 × 60 mmのカバーガラスを使用して、2 µLのシリカビーズを24 × 32 mmのカバーガラスの表面に広げます。2枚の両面テープを用い、24 × 32 mmのカバーガラスを顕微鏡スライドガラスに貼り付けてフローセルを作成します。フローセルに50 millimolarのリン酸緩衝液を満たし、シリコングリースで密閉します。明視野顕微鏡を用いて、約2000倍の倍率でシリカビーズ1粒を観察します。視野は約7 $\mu$m $\times$ 5 $\mu$mとし、ビーズの画像直径が約190 pixelsになるよう688 $\times$ 576 pixelsで取得します。画像の中心からXY位置を、回折リングからZ位置を算出してドリフトを補正するフィードバックソフトウェアを用いて、熱ドリフトを補正します。ナノメートル精度またはそれ以上の精度でピエゾステージを移動させ、左側トラップの中心をビーズの中心に重ね合わせ、クアドラント検出器フォトダイオード（QDP）を用いて位置ノイズとその標準偏差を測定します。右側トラップについても同様に測定を繰り返します。フローセルの作製においてDNA結合タンパク質を精密に局在化させるためには、位置ノイズの標準偏差が数ナノメートル以内である必要があります。まずダイヤモンドチップを用いて、76 × 76 × 1 mmの顕微鏡スライドに直径1 mmの穴を開け、4つの入口と1つの出口を作成します。これにより、最大4本のバッファーを並行して流すことが可能になります。それぞれ、実験に必要な異なるコンポーネント（ビーズ、蛍光標識DNAタンパク質、イメージングバッファー）を含んでいます。顕微鏡スライドをエタノールで洗浄し、Oリングを挿入したポートを、アクセスホールを囲むスライド上の接着リングの中心に合わせます。指紋が付着すると接着工程に支障をきたすため、この手順では必ず手袋を着用してください。2つ目のスライドクランプを用いてナノポートをスライドに固定し、完全に接着させるために180 °Cに予熱したオーブンに1時間置きます。その間に、フローセルのアウトラインパターンを紙に描きます。チャンネルの幅は約3 mmとし、顕微鏡スライド上のホール位置と一致させてください。図面を2枚の perfil の上に置き、メスを用いて、描かれたアウトラインに沿って鋭く連続的に切断します。形成された突起物を除去し、クリーンな支持を保証するためだけに使用した下層の parfum 層を廃棄します。次に、ナノポートが取り付けられた顕微鏡スライドを、金属製サポートに逆さまに配置します。パラフィルムのチャンバーの外形を穴に慎重に合わせ、パラフィルムがチャンバーカバーの入口および出口からはみ出していないことを確認し、洗浄済みの顕微鏡カバーガラスを用いてチャンバー周囲の余分なパラフィルムを丁寧に除去します。フローセルに均一な圧力をかけるため、あらかじめ120 °Cに加熱しておいた2つのヒートブロックをフローセルの上に置きます。パラフィルムを約25分間加熱して溶かします。次のステップは、加圧リザーバーとバッファー容器を準備することです。加圧リザーバーはプレキシガラス製で、最大6つのバッファー容器を収容できます。まず、バッファー容器の出口にある遮断バルブを接続し、バルブレバーを垂直位置にするとバッファーの流れがオンになり、時計回りに回転させるとオフになるようにします。実験中、フローセルを顕微鏡ステージに固定します。次に、遮断弁をポリエーテルエーテルケトン（PEEK）チューブで接続し、フランジレススピニングをフローチャンバーの入口に接続します。PEEKチューブの内径は約150 µmであり、PEEKチューブとフローセルのナノポートアセンブリとの間の連結として、内径約500 µmのフッ素化エチレンプロピレンチューブを約3 cm使用します。これは、チャンバー入口でのバッファー流量を抑え、フローセルの破損やガラスからのナノポートの脱落を防ぐために不可欠です。一方で、内径の大きいチューブのみを使用すると、大量の生物学的サンプルが必要になります。フローチャンバーの出口を、大気圧下の開いたFalconチューブに接続してください。このチューブは、フローチャンバーから流出する緩衝液の廃棄用として使用します。この手順を開始するには、各緩衝液容器に1 mLの緩衝液Aを加え、200 mbarの圧力をかけて接続チューブとフローセルを洗浄します。圧力制御システムの使用が可能です。最後に、圧力リザーバー内部の空気圧を調整します。流量の均一性を妨げる可能性がある気泡の有無を確認してください。出口チューブを軽く弾くことで、残っている気泡を除去できます。圧力を20 millibarsまで下げ、すべてのチャネルとチューブから気泡が除去されていること、およびすべてのチャネルでバッファーが同等の速度で流れていることを確認します。サンプルを最終容量 300 µL に調製します。本実験では、ストレプトアビジンコートポリスチレンビーズ、両末端にビオチン標識されラクトースリプレッサー結合用の特異的ターゲット配列を含む線状DNA、および蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質を使用します。各サンプルを、1番目のチャネルにビーズ、2番目にDNA、3番目にイメージングバッファー、4番目のチャネルに標識タンパク質という順序でシリンジ容器に注入します。流量を20 millibarsで開始し、遮断弁を開いてサンプルをフローチャネル内に導入します。これはビーズチャネルで容易に確認できます。明視野照明下で第1チャネルをイメージングしながら、2つの光ピンセットを起動し、各トラップでポリスチレンビーズを1つずつ捕捉します。他のビーズがトラップに落ちるのを避けるため、速やかに2番目のチャネルへ移動します。DNAチャネルへの到達は、ビーズの流れの終端で容易に確認できます。1つのAO光学デフレクターまたはOD移動を用いて、1つのトラップされたビーズをもう一方のビーズの付近で前後に動かし、2つの光学トラップされたビーズの間に、流れで伸長したDNAを付着させます。DNAダンベルが形成されると、静止ビーズがトラップによって能動的に前後に動かされるビーズの動きに追従し始めます。速やかにバッファーチャネルへ移動し、バッファーの流れを停止させます。力-伸長曲線解析を行い、単一のDNA分子が存在することを確認します。これは、DNAの張力を測定しながら2つのビーズを離すことで達成されます。単一のDNAダンベルが得られたら、再びフローをオンにし、ダンベルをタンパク質チャネルへ移動させます。広視野蛍光顕微鏡に切り替えて、ラベル化されたラクトースリプレッサータンパク質とDNAの相互作用を観察し、フローをオフにしてデータ収集を開始してください。この手法により、伸展させたDNA分子と相互作用する単一の乳糖リプレッサー（lac repressor）またはlac eye分子の検出が可能になります。この代表的なkymograph（カイモグラフ）では、1つのlac eye分子が非特異的なDNA配列に沿って拡散している一方で、別のlac eye分子がDNA分子の中央に位置する1つのオペレーターに特異的に結合しています。このプロットは、2つのトラップの中心を結ぶ方向に沿った2つのlac eye分子の位置を示しています。時間の関数として、分子の位置は放射対称中心アルゴリズムによって決定されました。ここに示されているのは、伸展したDNA分子に沿って拡散する単一のlacI分子における、平均二乗変位（MSD）の時間に対するプロットです。タンパク質の拡散係数は、データの線形回帰から容易に得ることができます。操作技術とイメージング技術の組み合わせは強力な手法であり、DNA、RNA、または細胞骨格フィラメントなどの単一の生物学的ポリマーを機械的に制御しながら、そのポリマーと相互作用する単一のタンパク質分子を同時に局在化させることが可能です。この手順を行う際は、単一分子操作とイメージング技術を組み合わせるために、懸垂されたポリマーのナノメートルレベルの安定性を確保できるよう、実験装置を慎重に設計することが重要であるという点に留意してください。一方で、トラッピング用Gレーザーと蛍光プローブの空間的な分離を保証するためには、生物学的プローブを適切に設計する必要があります。詳細は、付属のプロトコル本文を参照してください。このビデオを視聴することで、2つの光学的なラピッドビートの間にDNA分子をアセンブリする方法について深く理解することができます。この構成のアセンブリは、詳細な説明を提供しているマルチチャンネルフローセルを使用することでより効果的に行えます。また、バッファーの流れを最適化する方法と、実験結果に悪影響を及ぼす可能性がある気泡を除去する方法についても説明しました。結合テキストプロトコルには、ストレプトアビジンコートビーズを用いたアセンブリに必要なbioTEによるDNAラベル化プロトコルおよびタンパク質のラベル化プロトコルが記載されています。最後に、1本のDNA分子上における単一の乳糖リプレッサータンパク質の結合と拡散を定量化するためのステップバイステップの操作手順を説明しました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA...

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

この動画では、特定の遺伝子座におけるDNA分子上の融合タンパク質凝縮物の集合を、1分子イメージングを用いて可視化する方法を説明しています。これらの凝縮物は、LCD-LCDおよびLCD-DBDの相互作用によって形成され、RNAポリメラーゼIIの動員と遺伝子転写の促進を可能にします。...

DNAカーテン上の融合タンパク質凝縮物の集合を可視化するための1分子イメージング

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。...

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。...

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

DNAカーテンは、ハイスループットな1分子イメージング技術であり、多様なタンパク質-DNA相互作用をリアルタイムで可視化するためのプラットフォームを提供します。現在のプロトコルはAbo1の Schizosaccharomycesのpombe のbromodomain含んでいるAAA+...

DNAカーテン法によるヒストン集合の分子機構の解明

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。...

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。...

生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

蛍光標識され、完全に再構成されたCdc45/Mcm2-7/GINS(CMG)ヘリカーゼの動きを光学トラップに保持された直鎖状DNA分子上で直接画像化および定量化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイを報告します。...

完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

このプロトコルは、光学光子再割り当てを備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いて深部全細胞単分子局在顕微鏡(SMLM)を行う手順を示しており、カスタム光学や複雑な照明を必要とせずにDNA-PAINTイメージングを可能にします。...

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

学ぶ単一分子レベルでのタンパク質-DNA相互作用の観察法。二重光トラップと蛍光顕微鏡を組み合わせたカスタム顕微鏡システムを用いて、DNA結合タンパク質の動的挙動を詳細に解析する手法です。

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