タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

本手順の総合的な目的は、単一のDNA結合タンパク質とDNA分子との間の動的な相互作用を観察することです。これは、カスタム設計の顕微鏡において、2つの単分子技術であるダブルオプティカルツイーザー（二光ピンセット）と蛍光顕微鏡を組み合わせることで実現されます。また、このセットアップには、視認のための明視野照明およびサンプルのナノメートル単位の安定化機能が備わっています。

第2ステップとして、最大4つの層流により、実験に必要なすべてのコンポーネントを効率的に誘導し組み立てることができるよう、マイクロフローシステムに組み込まれたマルチチャンネルフローセルを構築します。次に、実験を実施するために、単分子構築物を組み立てます。まず、第1チャンネル内で、ストリップチチンをコーティングした2つのマイクロ球をデュアル光ピンセットで捕捉します。

次に、捕捉された2つのビーズを第2チャネルに移動させ、両端にビオチン標識がなされたDNAテンプレートを付着させます。第3チャネルにおいて、DNAの力伸長解析を行い、単一のDNA分子が存在することを確認します。最後に、DNAダンベルと呼ばれるビーズ-DNA-ビーズ構築物を、蛍光標識されたラクトースリプレッサータンパク質が存在するタンパク質チャネルへ移動させます。

単一の伸展DNA分子上における単一のLAC eye分子の拡散および特異的結合、ならびにLAC eyeの運動に関する速度論的パラメータの定量化の結果が得られました。既存の単一分子手法に対する本手法の主な利点は、分子に印加する張力を制御できること、結合タンパク質の動きをナノメートル単位で安定したスポット上で精密に追跡できること、そしてカバーガラス表面から十分に離れた位置で操作できることです。本手法は、タンパク質とDNAの相互作用に関する重要な問い、特に遺伝子発現調節のメカニクスや、標的探索メカニズムにおけるDNAに沿ったタンパク質拡散のダイナミクスを解明するのに役立ちます。

本手法のデモンストレーションは、フローセルのサンプルハンドリングの構築およびDNAビーズ構築物のアセンブリに関する実践的な側面を示す上で非常に有用です。このビデオでは、まず、カバースリップ表面に付着させたマイクロビーズをリファレンスとして用い、2つのトラッピングレーザーのポインティング安定性を確認する方法を説明します。光ピンセット装置の設計と構築に関する詳細は、付随するプロトコルテキストで確認できます。

24 × 60 mmのカバーガラスを使用して、2 µLのシリカビーズを24 × 32 mmのカバーガラスの表面に広げます。2枚の両面テープを用い、24 × 32 mmのカバーガラスを顕微鏡スライドガラスに貼り付けてフローセルを作成します。

フローセルに50 millimolarのリン酸緩衝液を満たし、シリコングリースで密閉します。明視野顕微鏡を用いて、約2000倍の倍率でシリカビーズ1粒を観察します。視野は約7 $\mu$m $\times$ 5 $\mu$mとし、ビーズの画像直径が約190 pixelsになるよう688 $\times$ 576 pixelsで取得します。画像の中心からXY位置を、回折リングからZ位置を算出してドリフトを補正するフィードバックソフトウェアを用いて、熱ドリフトを補正します。

ナノメートル精度またはそれ以上の精度でピエゾステージを移動させ、左側トラップの中心をビーズの中心に重ね合わせ、クアドラント検出器フォトダイオード（QDP）を用いて位置ノイズとその標準偏差を測定します。右側トラップについても同様に測定を繰り返します。フローセルの作製においてDNA結合タンパク質を精密に局在化させるためには、位置ノイズの標準偏差が数ナノメートル以内である必要があります。

まずダイヤモンドチップを用いて、76 × 76 × 1 mmの顕微鏡スライドに直径1 mmの穴を開け、4つの入口と1つの出口を作成します。これにより、最大4本のバッファーを並行して流すことが可能になります。

それぞれ、実験に必要な異なるコンポーネント（ビーズ、蛍光標識DNAタンパク質、イメージングバッファー）を含んでいます。顕微鏡スライドをエタノールで洗浄し、Oリングを挿入したポートを、アクセスホールを囲むスライド上の接着リングの中心に合わせます。指紋が付着すると接着工程に支障をきたすため、この手順では必ず手袋を着用してください。

2つ目のスライドクランプを用いてナノポートをスライドに固定し、完全に接着させるために180 °Cに予熱したオーブンに1時間置きます。その間に、フローセルのアウトラインパターンを紙に描きます。チャンネルの幅は約3 mmとし、顕微鏡スライド上のホール位置と一致させてください。

図面を2枚の perfil の上に置き、メスを用いて、描かれたアウトラインに沿って鋭く連続的に切断します。形成された突起物を除去し、クリーンな支持を保証するためだけに使用した下層の parfum 層を廃棄します。次に、ナノポートが取り付けられた顕微鏡スライドを、金属製サポートに逆さまに配置します。

パラフィルムのチャンバーの外形を穴に慎重に合わせ、パラフィルムがチャンバーカバーの入口および出口からはみ出していないことを確認し、洗浄済みの顕微鏡カバーガラスを用いてチャンバー周囲の余分なパラフィルムを丁寧に除去します。フローセルに均一な圧力をかけるため、あらかじめ120 °Cに加熱しておいた2つのヒートブロックをフローセルの上に置きます。パラフィルムを約25分間加熱して溶かします。

次のステップは、加圧リザーバーとバッファー容器を準備することです。加圧リザーバーはプレキシガラス製で、最大6つのバッファー容器を収容できます。まず、バッファー容器の出口にある遮断バルブを接続し、バルブレバーを垂直位置にするとバッファーの流れがオンになり、時計回りに回転させるとオフになるようにします。

実験中、フローセルを顕微鏡ステージに固定します。次に、遮断弁をポリエーテルエーテルケトン（PEEK）チューブで接続し、フランジレススピニングをフローチャンバーの入口に接続します。PEEKチューブの内径は約150 µmであり、PEEKチューブとフローセルのナノポートアセンブリとの間の連結として、内径約500 µmのフッ素化エチレンプロピレンチューブを約3 cm使用します。

これは、チャンバー入口でのバッファー流量を抑え、フローセルの破損やガラスからのナノポートの脱落を防ぐために不可欠です。一方で、内径の大きいチューブのみを使用すると、大量の生物学的サンプルが必要になります。フローチャンバーの出口を、大気圧下の開いたFalconチューブに接続してください。

このチューブは、フローチャンバーから流出する緩衝液の廃棄用として使用します。この手順を開始するには、各緩衝液容器に1 mLの緩衝液Aを加え、200 mbarの圧力をかけて接続チューブとフローセルを洗浄します。圧力制御システムの使用が可能です。

最後に、圧力リザーバー内部の空気圧を調整します。流量の均一性を妨げる可能性がある気泡の有無を確認してください。出口チューブを軽く弾くことで、残っている気泡を除去できます。圧力を20 millibarsまで下げ、すべてのチャネルとチューブから気泡が除去されていること、およびすべてのチャネルでバッファーが同等の速度で流れていることを確認します。

サンプルを最終容量 300 µL に調製します。本実験では、ストレプトアビジンコートポリスチレンビーズ、両末端にビオチン標識されラクトースリプレッサー結合用の特異的ターゲット配列を含む線状DNA、および蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質を使用します。各サンプルを、1番目のチャネルにビーズ、2番目にDNA、3番目にイメージングバッファー、4番目のチャネルに標識タンパク質という順序でシリンジ容器に注入します。

流量を20 millibarsで開始し、遮断弁を開いてサンプルをフローチャネル内に導入します。これはビーズチャネルで容易に確認できます。明視野照明下で第1チャネルをイメージングしながら、2つの光ピンセットを起動し、各トラップでポリスチレンビーズを1つずつ捕捉します。

他のビーズがトラップに落ちるのを避けるため、速やかに2番目のチャネルへ移動します。DNAチャネルへの到達は、ビーズの流れの終端で容易に確認できます。1つのAO光学デフレクターまたはOD移動を用いて、1つのトラップされたビーズをもう一方のビーズの付近で前後に動かし、2つの光学トラップされたビーズの間に、流れで伸長したDNAを付着させます。

DNAダンベルが形成されると、静止ビーズがトラップによって能動的に前後に動かされるビーズの動きに追従し始めます。速やかにバッファーチャネルへ移動し、バッファーの流れを停止させます。力-伸長曲線解析を行い、単一のDNA分子が存在することを確認します。

これは、DNAの張力を測定しながら2つのビーズを離すことで達成されます。単一のDNAダンベルが得られたら、再びフローをオンにし、ダンベルをタンパク質チャネルへ移動させます。広視野蛍光顕微鏡に切り替えて、ラベル化されたラクトースリプレッサータンパク質とDNAの相互作用を観察し、フローをオフにしてデータ収集を開始してください。

この手法により、伸展させたDNA分子と相互作用する単一の乳糖リプレッサー（lac repressor）またはlac eye分子の検出が可能になります。この代表的なkymograph（カイモグラフ）では、1つのlac eye分子が非特異的なDNA配列に沿って拡散している一方で、別のlac eye分子がDNA分子の中央に位置する1つのオペレーターに特異的に結合しています。このプロットは、2つのトラップの中心を結ぶ方向に沿った2つのlac eye分子の位置を示しています。

時間の関数として、分子の位置は放射対称中心アルゴリズムによって決定されました。ここに示されているのは、伸展したDNA分子に沿って拡散する単一のlacI分子における、平均二乗変位（MSD）の時間に対するプロットです。タンパク質の拡散係数は、データの線形回帰から容易に得ることができます。操作技術とイメージング技術の組み合わせは強力な手法であり、DNA、RNA、または細胞骨格フィラメントなどの単一の生物学的ポリマーを機械的に制御しながら、そのポリマーと相互作用する単一のタンパク質分子を同時に局在化させることが可能です。

この手順を行う際は、単一分子操作とイメージング技術を組み合わせるために、懸垂されたポリマーのナノメートルレベルの安定性を確保できるよう、実験装置を慎重に設計することが重要であるという点に留意してください。一方で、トラッピング用Gレーザーと蛍光プローブの空間的な分離を保証するためには、生物学的プローブを適切に設計する必要があります。詳細は、付属のプロトコル本文を参照してください。

このビデオを視聴することで、2つの光学的なラピッドビートの間にDNA分子をアセンブリする方法について深く理解することができます。この構成のアセンブリは、詳細な説明を提供しているマルチチャンネルフローセルを使用することでより効果的に行えます。また、バッファーの流れを最適化する方法と、実験結果に悪影響を及ぼす可能性がある気泡を除去する方法についても説明しました。

結合テキストプロトコルには、ストレプトアビジンコートビーズを用いたアセンブリに必要なbioTEによるDNAラベル化プロトコルおよびタンパク質のラベル化プロトコルが記載されています。最後に、1本のDNA分子上における単一の乳糖リプレッサータンパク質の結合と拡散を定量化するためのステップバイステップの操作手順を説明しました。