タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

この手順の全体的な目標は、単一のDNA結合タンパク質とDNA分子との間の動的相互作用を観察することです。これは、カスタムメイドの顕微鏡、2つの単一分子技術、二重光ピンセット、蛍光顕微鏡法を組み合わせることで達成されます。このセットアップには、サンプルの可視化とナノメートルの安定化のための明視野照明も装備されています。

第2のステップとして、マイクロフローシステムに統合されたマルチチャンネルフローセルは、最大4つの層流が実験に必要なすべてのコンポーネントを効率的にリクルートして組み立てることができるように構築されています。次に、実験を行うために、1分子コンストラクトを組み立てます。最初の2つのストリップタイチンコーティングされたマイクロスフィアは、最初のチャネルのデュアル光ピンセットで捕捉されます。

次に、トラップされた2つのビーズを第2のチャネルに移動させ、ビオチンで標識したDNAテンプレートを両端に付着させます。単一のDNA分子の存在は、A DNA力拡張分析によって3番目のチャネルでチェックされます。最後に、DNAダンベルと名付けられたビーズDNAビーズコンストラクトを、蛍光標識されたラクトースリプレッサータンパク質が存在するタンパク質チャネルに移動します。

単一の伸張DNA分子上の単一のLAC眼分子の拡散と特異的結合、およびLAC眼球運動の速度論的パラメータの定量化を示す結果が得られました。この手法が既存の単一分子法と比較した場合の主な利点は、新しい分子に加えられる張力を制御できること、ナノメートルの安定したスポットで結合タンパク質の動きを正確に追跡できること、およびカバーの睡眠表面から遠く離れた場所で操作できることです。この方法は、タンパク質DNAの相互作用、特に遺伝子発現調節のメカニズム、およびターゲット探索のメカニズムにおけるDNAに沿ったタンパク質拡散のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法のこれらのデモンストレーションは、フローセル、サンプルの取り扱い、およびビートDNAビーズコンストラクトの組み立ての構築の実際的な側面を示すのに非常に役立ちます。このビデオでは、まず、カバースリップ面に貼り付けられたマイクロビーズを参考にして、2つのトラッピングレーザーのポインティング安定性を確認する方法を示します。光ピンセットのセットアップの設計と構造の詳細については、付属のプロトコルテキストを参照してください。

24 x 60 mmのカバースリップを使用して、2マイクロリットルのシリカビーズを24 x 32 mmのカバースリップの表面に広げます。両面テープを2枚使用。24 x 32 mmのカバースリップを顕微鏡スライドに取り付けて、フローセルを作成します。

フローセルに50ミリモルのリン酸緩衝液を充填し、シリコングリース画像で密封します。明視野顕微鏡で約2000倍の倍率で1つのシリカビーズ。視野は、ビーズ画像の直径が約190ピクセルになるように、7 68 x 5 76ピクセルで取得された約7 x 5マイクロメートルである必要があります。フィードバックソフトウェアを使用して、画像の中心からXY位置を計算し、回折リングからZを計算してドリフトを補正します。

ナノメートルの精度でピゾステージを移動させるには、左のトラップの中心をビーズの中心と重ね合わせ、位置ノイズと象限検出器フォトダイオードまたはQDPからの標準偏差を測定します。正しいトラップについて測定を繰り返します。位置ノイズの標準偏差は、DNA結合タンパク質の正確な局在化を可能にしてフローセルを作るために、数ナノメートル以内である必要があります。

ダイヤモンドチップは、76 x 76 x 1 mmの顕微鏡で直径1mmの穴を開けるために最初に使用されます。スライドさせて 4 つの入口と 1 つの出口を作成します。これにより、最大 4 つの並列バッファ フローが可能になります。

それぞれに、実験ビーズ、DNA蛍光標識タンパク質、およびイメージングバッファーに必要な異なる成分の1つが含まれています。顕微鏡スライドをエタノールで洗浄し、Oリングを挿入したポートの中央にポートを配置し、アクセス穴を囲むスライドに接着リングを配置します。このステップでは、接着プロセスの邪魔になる指紋を避けるために手袋を着用することが不可欠です。

2つ目のスライドクランプを使用して、ナノポートをスライドに固定し、摂氏180度に予熱したオーブンに1時間入れて、完全に取り付けます。その間に、フローセルのアウトラインパターンを紙に描きます。チャンネルの幅は約3mmで、顕微鏡スライド上の全体位置と一致する必要があります。

図面を2枚のパーフィルの上に置き、メスで、描いた輪郭に沿ってシャープで連続したカットを行います。形成された突起をすべて取り除き、きれいなサポートを保証するためだけに使用される下部の香水層を廃棄します。次に、取り付けられたナノポートを含む顕微鏡スライドを逆さまにして金属支持体に置きます。

パラフォームチャンバーのアウトラインを穴に慎重に合わせ、パラメーターが清掃された顕微鏡カバースリップでチャンバーカバーの入口と出口を押し出さないようにし、チャンバーを囲む余分なパラメーターを慎重に取り除きます。120°Cで加熱した2つのヒートブロックをフローセルの上に置き、均一な圧力をかけます。パラフィルムを約25分間溶かします。

次のステップは、圧力リザーバーとバッファーコンテナを準備することです。圧力リザーバーはプレキシガラス製で、最大6つのバッファーコンテナを収容できます。まず、バッファコンテナの出口にあるシャットオフバルブを接続して、バッファフローをオンにするには、バルブレバーを垂直位置でオンにするか、時計回りに回転した位置でオフにします。

実験中は、フローセルを顕微鏡ステージに取り付けます。次に、シャットオフバルブをポリエーテル、エーテルケトン、またはピークチューブを介して接続し、フランジレススピニングをフローチャンバーインレットに接続します。ピークチューブの内径は約150μmkmで、ピークチューブとフローセルのナノポートアセンブリとのリンケージとして、内径約500μmのフッ素化エチレンプロピレンチューブが約3cm使用されています。

これは、フローセルの破損やガラスからのナノポートの剥離を避けるために、チャンバー入口のバッファーフローを減らすために不可欠です。一方、内径の大きなチューブだけでは、大量の生体サンプルが必要になります。フローチャンバーの出口を大気圧で開いたFalconチューブに接続します。

このチューブは、フローチャンバーから流出するバッファーの処分として機能します。この手順を開始するには、各バッファー容器に1ミリリットルのバッファーAを追加し、200ミリバールの圧力を加えて接続チューブとフローセルを洗浄します。圧力制御システムが可能です。

最後に、圧力リザーバー内の空気圧を調整します。流れの滑らかさを乱す可能性のある気泡の存在を確認してください。出口チューブを軽くフリックすると、残っている気泡を取り除き、圧力を20ミリバールに下げ、すべてのチャネルとチューブに気泡がないこと、およびバッファがすべてのチャネルで同様の速度で流れることを確認します。

サンプルを最終容量300マイクロリットルまで調製します。この実験では、ストレプトコーティングポリスチレンビーズ、ラクトースリプレッサー結合の特定の標的配列を含む両肢にビオチン化された線状DNAビオチン、および蛍光標識されたラクトースリプレッサータンパク質を利用しています。各サンプルを、第1チャネルのビーズを第2チャネルDNAに、イメージングバッファーを第3チャネルに、標識タンパク質を第4チャネルに、次の順序でシリンジ容器の1つに加えます。

20ミリバールでフローをオンにし、シャットオフバルブを開いて、サンプルがフローチャネル内に到着するのを待ちます。これは、ビーズチャネルで簡単に検出できます。明視野照明下で最初のチャンネルをイメージングしながら、2つの光ピンセットのスイッチを入れ、各トラップでポリスチレンビーズをキャッチします。

他のビーズがトラップに落ちないように、2番目のチャネルにすばやく移動します。DNAチャネルへの到着は、ビーズの流れの終わりまでに容易に目立つることに注意してください。1つのAO光学デフレクターまたはODムーブを使用して、一方のトラップビーズをもう一方のビーズの近くで前後に動かし、2つの光学的にトラップされたビーズの間にDNAを伸ばした流れの付着を可能にします。

DNAダンベルが形成されると、トラップによって能動的に前後に動くビーズの動きに追従して、静的ビーズが動き始めます。バッファチャネルにすばやく移動し、バッファフローをオフにします。力延長曲線解析を実行して、単一のDNA分子の存在を確認します。

これは、DNAの張力を測定しながら2つのビーズを分離することによって達成されます。DNAダンベルが1つになったら、再度フローをオンにし、ダンベルをタンパク質チャネルに移動します。広視野蛍光顕微鏡に切り替えて、標識されたラクトースリプレッサータンパク質とDNAとの相互作用をモニターし、フローをオフにして取得を開始します。

この方法により、伸張DNA分子と相互作用する単一のラクトースリプレッサーまたはラックアイ分子の検出が可能になります。この代表的なCHアグラムでは、1つのラックアイ分子が非特異的なDNA配列に沿って拡散し、別のラックアイ分子はDNA分子の中心に位置する1つのオペレーターに特異的に結合しています。このプロットは、2つのトラップの中心を結ぶ方向に沿った2つのラックアイ分子の位置を示しています。

時間の関数として、分子の位置は、ここに示されている放射状対称中心アルゴリズムによって決定され、引き伸ばされたDNA分子に沿って拡散する単一のlac eye分子の平均二乗変位またはMSD対時間のプロットです。タンパク質の拡散係数は、データの線形回帰から容易に得ることができます。マニピュレーションとイメージング技術の組み合わせは強力な方法であり、D-N-A-R-N-Aや細胞骨格フィラメントなどの単一の生体ポリマー上での機械的制御と、ポリマー自体と相互作用する単一のタンパク質分子の同時局在化を可能にします。

この手順を試行する際には、単一分子の操作とイメージング技術を組み合わせるには、懸濁ポリマーのナノメートルレベルの安定性を確保するための実験セットアップを慎重に設計する必要があることを覚えておくことが重要です。一方、トラップGレーザーと蛍光プローブとの間の特別な分離を保証するためには、生物学的プローブの適切な設計が必要です。詳細については、付属のプロトコルテキストを参照してください。

このビデオを見た後、このコンストラクトのアセンブリを2つの光ラピッドビートの間にDNA分子を組み立てる方法をよく理解しているはずです。これは、詳細な説明を提供したマルチチャネルフローセルでよりよく得られます。また、バッファーフローを最適化し、実験に支障をきたす可能性のある気泡を除去する方法も示しました。

コンバインテキストプロトコールでは、ストレプトアビジン被覆ビートとのアセンブルに必要なbioTEでDNAを標識するプロトコールと、タンパク質を標識するプロトコールを見つけることができます。最後に、ストレッチDNA分子上の単一のラクトース抑制タンパク質の結合と拡散を定量化するための段階的な操作を示しました。